孫瑜嬬，史鵬云，王梓安，孫理軍

陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046

《素問(wèn)·宣明五氣》中指出：“五臟化液，心為汗，肺為涕，肝為淚，脾為涎，腎為唾，是謂五液?！痹谥嗅t(yī)學(xué)理論中，“涎”與“唾”是兩種重要概念，都?xì)w屬于“五液”，但涎、唾二者，無(wú)論是在其生成、與臟腑的關(guān)系或是病理變化等方面都有著區(qū)別，由于其皆出于口，是口腔分泌物，臨床中很難將二者區(qū)分開來(lái)，因此常合稱為“唾液”“唾沫”等?，F(xiàn)代藥理研究證實(shí)唾液與脾腎關(guān)系密切［1-4］，但唾液與脾腎之間的關(guān)系又不十分明確。為了進(jìn)一步探討唾液與脾腎之間的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)制備腎虛體質(zhì)、脾虛體質(zhì)動(dòng)物模型，研究腎虛、脾虛病理體質(zhì)狀態(tài)下唾液腺形態(tài)和生化指標(biāo)的變化，從而探討脾、腎對(duì)唾液影響的差異。

1 材料

1.1 動(dòng)物8周齡SPF級(jí)SD大鼠，雌鼠15只，雄鼠5只，體質(zhì)量180 g～220 g，購(gòu)買于西安第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，合格證號(hào)：SCXK（陜）2018-003。室溫20～26℃，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食。成熟土貓1只，兇狠善斗，前期貓糧喂養(yǎng)，造模期間以貓糧并不定期投入實(shí)驗(yàn)淘汰掉的子代鼠喂養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)：G1120）；無(wú)水乙醇（安徽安特股份有限公司，批號(hào)：1308073601）；生理鹽水（西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司，批號(hào)：172703）；多聚甲醛（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，批 號(hào)：20100318）；電 解 質(zhì) 檢 測(cè) 液、鈣 離 子（Ca2＋）、磷離子（P5＋）、總蛋白（total protein，TP）、白蛋白（albumin，ALB）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate transaminase，AST）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、尿素（urea，UREA）、肌酐（creatinine，CREA）、尿酸（uric acid，UA）測(cè)定試劑盒（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，貨號(hào)：66313、OSR61117、OSR6122、OSR6132、OSR6102、OSR6128、OSR6107、OSR6109、OSR6104、OSR6134、OSR6178、OSR6198）；匹魯卡品（山東博士倫福瑞達(dá)制藥有限公司生產(chǎn)，國(guó)藥準(zhǔn)字：H19983028）；二甲苯、醫(yī)用石蠟（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào)：20130306、20100302）；中性樹膠（中國(guó)上海標(biāo)本模型廠，批號(hào)：20141205）。

1.3 儀器FT-200小動(dòng)物跑步機(jī)（成都泰盟軟件有限公司）；HJT-B＋1000G型天平（華杰電子有限公司）；CB880V潔凈工作臺(tái)（蘇潔醫(yī)療器械（蘇州）有限公司）；貝克曼Au5800全自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；KDC-40低溫離心機(jī)（離心半徑：13 cm，科大創(chuàng)新股份有限公司）；ZT-12J生物組織自動(dòng)脫水機(jī)（湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；JB-L6生物組織包埋機(jī)、JJQ-P2016j切片機(jī)（武漢俊杰電子有限公司）；A1型顯微鏡（德國(guó)Zeiss公司）。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及模型制備20只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，雌雄比例為3∶1合籠交配。待雌鼠成功受孕后，將15只孕鼠隨機(jī)分為A、B、C 3組（n＝5）。A組孕鼠每日8∶00～20∶00置于特質(zhì)鼠籠，將鼠籠固定于內(nèi)有兇狠土貓的大籠內(nèi)，孕鼠與土貓間僅有一層鐵絲網(wǎng)相隔，貓爪能夠觸碰孕鼠但不能將之捕獲；使A組孕鼠處于恐嚇狀態(tài)直至先天不足的子代鼠（仔鼠）出生。B、C組孕鼠不做任何刺激正常產(chǎn)子。待3組孕鼠產(chǎn)下仔鼠后，將仔鼠正常喂養(yǎng)4周后進(jìn)行分組。

選取A組孕鼠所產(chǎn)仔鼠，雌雄各半，繼續(xù)上述“貓嚇鼠”恐嚇刺激，并不定期投入實(shí)驗(yàn)淘汰掉的仔鼠喂養(yǎng)土貓，使仔鼠在旁觀看強(qiáng)化恐嚇刺激，持續(xù)4周，所得仔鼠為先天不足＋后天失養(yǎng)復(fù)合型腎虛質(zhì)模型鼠［5-9］，選取10只模型鼠為腎虛質(zhì)組。

隨機(jī)選取B組孕鼠所產(chǎn)仔鼠，雌雄各半，不規(guī)律喂食使其饑飽無(wú)度，并于每日8∶00將其放置在小動(dòng)物跑步機(jī)上跑步30 min，速度10 m·min-1，六個(gè)跑道后方均裝有電擊裝置，仔鼠若觸碰則會(huì)遭受電擊。為避免電擊懲罰，仔鼠將持續(xù)向前奔跑直至精疲力竭。以仔鼠出現(xiàn)跑步吃力，半臥位姿勢(shì)跑步，降低跑道轉(zhuǎn)速度后仍無(wú)法恢復(fù)跑動(dòng)能力，停止運(yùn)動(dòng)后出現(xiàn)氣促、神倦，且對(duì)外界刺激不敏感為力竭標(biāo)準(zhǔn)。4周后所得仔鼠為飲食不節(jié)＋勞倦過(guò)度復(fù)合型脾虛質(zhì)模型鼠［10-12］，選取10只作為脾虛質(zhì)組。

C組孕鼠所產(chǎn)仔鼠隨機(jī)選取10只，雌雄各半，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水進(jìn)食，為平和質(zhì)組。

2.2 各組仔鼠一般情況檢測(cè)分別在仔鼠6周齡和8周齡時(shí)稱重，并觀察各組仔鼠的神態(tài)、活動(dòng)能力、飲食、毛色等變化。

2.3 唾液生化指標(biāo)檢測(cè)造模結(jié)束后，各組仔鼠禁食12 h后稱重，以10 mL·kg-1劑量腹腔注射300 mg·kg-1水合氯醛麻醉［13］，腹腔注射0.2%匹魯卡品（7.5 mg·kg-1）促進(jìn)唾液分泌［14］，于仔鼠麻醉狀態(tài)下收集唾液。將收集的唾液3 000 rpm·min-1離心10 min，取上清液，于-80℃保存待用，用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定唾液生化指標(biāo)。

2.4 唾液腺組織切片觀察處死動(dòng)物后快速摘取唾液腺置于4%多聚甲醛溶液固定，自動(dòng)脫水機(jī)脫水，石蠟包埋，切片機(jī)切片（厚度為5μm），常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察組織切片。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組仔鼠一般生長(zhǎng)情況比較平和質(zhì)組仔鼠飲食正常，體格健碩，體質(zhì)量增長(zhǎng)迅速，精神良好，活動(dòng)度高，毛發(fā)密實(shí)有光澤，二便正常。造模時(shí)，A組孕鼠成群蜷縮在籠子角落，瑟縮易驚，大小便增多，攝食量減少，產(chǎn)子量明顯減少，仔鼠體格瘦小，蜷臥少動(dòng)，皮毛松弛，毛發(fā)稀疏灰暗、光澤度差；脾虛質(zhì)組仔鼠飲食逐漸減少，體型消瘦，體質(zhì)量增長(zhǎng)緩慢，精神萎靡不振，大便增多。對(duì)仔鼠第6、8周稱重檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與平和質(zhì)組比較，腎虛質(zhì)組仔鼠第8周體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01），脾虛質(zhì)組第6、8周體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01）；與腎虛質(zhì)組比較，脾虛質(zhì)組第6、8周時(shí)仔鼠體質(zhì)量均顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表1。

表1 各組仔鼠第6周、第8周體質(zhì)量比較 （±s，n＝10）

表1 各組仔鼠第6周、第8周體質(zhì)量比較 （±s，n＝10）

注：與平和質(zhì)組比較，**P＜0.01；與腎虛質(zhì)組比較，△△P＜0.01

/g平和質(zhì)組組別 第6周體質(zhì)量/g 第8周體質(zhì)量74.60±8.43 112.62±10.91腎虛質(zhì)組 67.54±10.37 98.55±9.85**脾虛質(zhì)組 56.79±5.36**△△ 73.17±6.47**△△

3.2 各組仔鼠唾液中相關(guān)離子比較對(duì)各組仔鼠唾液中相關(guān)離子水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與平和質(zhì)組比較，腎虛質(zhì)組仔鼠唾液中Na＋、Cl-的水平顯著降低（P＜0.01），K＋、P5＋的水平顯著升高（P＜0.01），而Ca2＋水平無(wú)明顯變化；脾虛質(zhì)組仔鼠唾液中Na＋、Cl-的水平顯著降低（P＜0.01），K＋的水平顯著升高（P＜0.01），而Ca2＋、P5＋的水平無(wú)明顯變化。與腎虛質(zhì)組比較，脾虛質(zhì)組Cl-、P5＋水平顯著降低（P＜0.05），其他離子水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)表2。

表2 各組仔鼠唾液中相關(guān)離子比較 （±s，n＝10）

表2 各組仔鼠唾液中相關(guān)離子比較 （±s，n＝10）

注：與平和質(zhì)組比較，**P＜0.01；與腎虛質(zhì)組比較，△△P＜0.01，△P＜0.05

組別 Na＋（c/mmol·L-1） K＋（c/mmol·L-1） Cl-（c/mmol·L-1） Ca2＋（c/mmol·L-1） P5＋（c/mmol·L-1）0.29±0.03腎虛質(zhì)組 24.79±4.46** 26.56±2.28** 28.18±1.45** 0.40±0.05 0.32±0.02**脾虛質(zhì)組 21.70±3.68** 27.55±1.90** 26.87±1.14**△ 0.45±0.05 0.28±0.02平和質(zhì)組 34.04±6.35 20.19±2.50 31.61±2.66 0.41±0.06△△

3.3 各組仔鼠唾液中TP、ALB的比較對(duì)各組仔鼠唾液中TP、ALB水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與平和質(zhì)組比較，腎虛質(zhì)組仔鼠唾液中TP、ALB的水平顯著升高（P＜0.01）；脾虛質(zhì)組仔鼠唾液中TP、ALB的水平顯著升高（P＜0.01）。與腎虛質(zhì)組比較，脾虛質(zhì)組TP、ALB的水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)表3。

表3 各組仔鼠唾液中TP、ALB的比較（±s，n＝10）

表3 各組仔鼠唾液中TP、ALB的比較（±s，n＝10）

注：與平和質(zhì)組比較，**P＜0.01

組別 TP（ρ/g·L-1） ALB（ρ/g·L-1）3.12±0.66 0.29±0.05腎虛質(zhì)組 7.21±1.44** 0.40±0.08**脾虛質(zhì)組 6.84±1.16** 0.41±0.07平和質(zhì)組**

3.4 各組仔鼠唾液中LDH、ALT、AST、ALP的比較對(duì)各組仔鼠唾液中LDH、ALT、AST、ALP水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與平和質(zhì)組比較，腎虛質(zhì)組仔鼠唾液中ALT的水平顯著降低（P＜0.05）；脾虛質(zhì)組仔鼠唾液中AST的水平增高（P＜0.05）。與腎虛質(zhì)組比較，脾虛質(zhì)組LDH、ALT、AST、ALP的水平無(wú)明顯變化。見(jiàn)表4。

表4 各組仔鼠唾液LDH、ALT、AST、ALP的比較 （±s，n＝10）

表4 各組仔鼠唾液LDH、ALT、AST、ALP的比較 （±s，n＝10）

注：與平和質(zhì)組比較，*P＜0.05

組別 LDH/IU·L-1 ALT/IU·L-1 AST/IU·L-1 ALP/IU·L-1 93.80±8.30 6.63±1.28 18.71±3.15 7.53±1.43腎虛質(zhì)組 98.80±7.60 5.33±1.02* 21.79±4.30 7.12±1.42脾虛質(zhì)組 96.90±9.15 6.35±1.23 23.22±4.31*平和質(zhì)組8.06±1.61

3.5 各組仔鼠唾液中UREA、CREA、UA的比較對(duì)各組仔鼠唾液中UREA、CREA、UA水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與平和質(zhì)組比較，腎虛質(zhì)組仔鼠唾液中CREA、UA的水平顯著增高（P＜0.01）；脾虛質(zhì)組仔鼠唾液中UA的水平顯著增高（P＜0.01）。與腎虛質(zhì)組比較，脾虛質(zhì)組CREA的水平顯著降低（P＜0.01）。見(jiàn)表5。

表5 各組仔鼠唾液UREA、CREA、UA的比較 （±s，n＝10）

表5 各組仔鼠唾液UREA、CREA、UA的比較 （±s，n＝10）

注：與平和質(zhì)組比較，*P＜0.01；與腎虛質(zhì)組比較，△P＜0.01

組別 UREA（c/mmol·L-1）CREA（c/mmol·L-1）UA（c/mmol·L-1）4.63±0.72 4.67±0.88 4.71±0.94腎虛質(zhì)組 5.23±1.03 9.84±1.40** 6.45±1.19**脾虛質(zhì)組 5.10±1.01 5.07±1.01△△ 6.40±0.88平和質(zhì)組**

3.6 各組仔鼠唾液腺組織切片觀察采用HE染色觀察不同模型下仔鼠唾液腺的病理變化。平和質(zhì)組唾液腺結(jié)構(gòu)完整、分葉明顯，腺管結(jié)構(gòu)排列緊密，導(dǎo)管及腺細(xì)胞密集，偶見(jiàn)腺小葉、腺泡局灶性萎縮；腎虛質(zhì)組唾液腺結(jié)構(gòu)較完整，分葉明顯，可見(jiàn)腺泡、導(dǎo)管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)片狀萎縮，腺上皮細(xì)胞部分脫落，部分細(xì)胞核溶解、消失，導(dǎo)管結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞間質(zhì)增寬伴細(xì)胞水腫；脾虛質(zhì)組唾液腺結(jié)構(gòu)完整，分葉明顯，腺管結(jié)構(gòu)出現(xiàn)片狀萎縮，腺管基底膜尚存，管狀結(jié)構(gòu)清晰。見(jiàn)圖1。

圖1 各組仔鼠唾液腺組織病理觀察（HE染色，×200）

4 討論

唾液，是中醫(yī)“唾”與“涎”的合稱，又被稱為“金精玉液”，是滋潤(rùn)濡養(yǎng)、化生血液、調(diào)節(jié)陰陽(yáng)的重要物質(zhì)?！鹅`樞·九針論》中再次明確了“腎主唾，脾主涎”，唾液與脾腎關(guān)系密切［15］?，F(xiàn)代研究證實(shí)，唾液成分的改變影響機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育，并與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)［16-18］。病理體質(zhì)決定了個(gè)體對(duì)某些疾病的易感性，是疾病發(fā)生的內(nèi)在基礎(chǔ)［19-20］。

腎虛體質(zhì)主要以腎精虧損、臟腑功能虛弱為表現(xiàn)，與多種慢性疾病和老年性疾病的發(fā)生密切相關(guān)［21］。脾虛體質(zhì)是以脾氣虧虛，脾胃功能低下，易受邪染病為主要特征的一種病理體質(zhì)［22］。腎虛、脾虛體質(zhì)同屬病理體質(zhì)范疇［23-24］，從唾液相關(guān)指標(biāo)研究腎虛、脾虛體質(zhì)差異對(duì)發(fā)展中醫(yī)特色的無(wú)創(chuàng)傷體質(zhì)辨識(shí)技術(shù)和微觀辨證及預(yù)警都將具有重要的意義［25］。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)制備腎虛、脾虛體質(zhì)動(dòng)物模型，對(duì)比觀察各組仔鼠6周齡、8周齡體質(zhì)量發(fā)現(xiàn)，腎虛質(zhì)組、脾虛質(zhì)組體質(zhì)量均顯著低于平和質(zhì)組，但與腎虛質(zhì)組間比較，脾虛質(zhì)組6周齡和8周齡時(shí)的體質(zhì)量更低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示脾虛質(zhì)對(duì)體質(zhì)量的影響較腎虛質(zhì)更直觀、更明顯。脾虛質(zhì)動(dòng)物脾胃功能衰退，后天之本虛弱，樞機(jī)不利，氣血生化無(wú)源，四肢無(wú)法充養(yǎng)，肌肉瘦削、體質(zhì)量驟降。腎虛質(zhì)動(dòng)物腎中精氣虧虛，腎臟蒸化、封藏、攝納等功能失常，不能化氣行水，間接影響脾胃功能，腎中藏納的液態(tài)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也不能上注于舌竅，引起唾液異常分泌［26］。對(duì)唾液腺組織觀察發(fā)現(xiàn)，與平和質(zhì)組唾液腺結(jié)構(gòu)完整、腺管排列整齊致密不同，腎虛質(zhì)、脾虛質(zhì)組唾液腺出現(xiàn)了不同程度的細(xì)胞和組織損傷。

Na＋是細(xì)胞外液中帶正電荷的離子，與K＋、Cl-共同參與人體的新陳代謝，維持機(jī)體水液分布的平衡。肌肉運(yùn)動(dòng)、氧的利用、心血管功能的發(fā)揮均需要鈉的參與。K＋是人體內(nèi)不可或缺的常量元素，與Na＋協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)體電解質(zhì)的平衡。K＋濃度的輕微變化可能對(duì)肌肉系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、心臟產(chǎn)生嚴(yán)重影響［27］。Cl-可以調(diào)節(jié)人體的酸堿平衡，與H＋結(jié)合形成胃酸，在促進(jìn)淀粉酶激活的同時(shí)可以抑制胃中微生物的生長(zhǎng)。Ca2＋存在于細(xì)胞外液，在神經(jīng)傳導(dǎo)、酶的激活、肌肉收縮過(guò)程中均起調(diào)節(jié)作用。磷是骨骼和牙齒的重要成分，也是傳達(dá)神經(jīng)刺激和維持腎臟正常機(jī)能的重要物質(zhì)。CREA是由肌肉中的肌酸或磷酸代謝，經(jīng)腎臟排泄出的一種小分子物質(zhì)。當(dāng)腎功能受損時(shí)，CREA排泄受到阻礙，CREA透過(guò)細(xì)胞膜或黏膜，引起唾液中CREA的濃度升高。UREA是由氨基酸分解、經(jīng)肝內(nèi)合成，再由血液運(yùn)輸，通過(guò)腎臟排至體外的代謝物。當(dāng)腎臟發(fā)生疾病時(shí)，UREA排泄障礙，體液中UREA濃度自然升高。尿酸是嘌呤分解代謝的終末產(chǎn)物，腎實(shí)質(zhì)的變化影響尿酸的正常分泌［28-29］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)腎虛體質(zhì)、脾虛體質(zhì)及正常體質(zhì)的唾液生化指標(biāo)進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，與平和質(zhì)組比較，腎虛質(zhì)組大鼠Na＋、Cl-、ALT含量顯著降低，K＋、P5＋、TP、ALB、CREA、UA含量顯著升高；脾虛質(zhì)組Na＋、Cl-含量顯著降低，K＋、TP、ALB、AST、UA含量顯著升高。與腎虛質(zhì)組比較，脾虛質(zhì)組Cl-、P5＋、CREA顯著降低，但其余指標(biāo)二者比較并無(wú)顯著差異，Cl-、P5＋、CREA是否為腎虛質(zhì)、脾虛質(zhì)鑒別的標(biāo)志物，還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，在腎虛、脾虛病理體質(zhì)下，大鼠生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，唾液腺組織形態(tài)、唾液生化指標(biāo)均發(fā)生了明顯變化，進(jìn)一步說(shuō)明病理體質(zhì)的亞健康狀態(tài)對(duì)機(jī)體的影響。同時(shí)，腎虛質(zhì)、脾虛質(zhì)唾液除了Cl-、P5＋、CREA含量有顯著差異外，其余生化指標(biāo)并無(wú)顯著變化，進(jìn)一步說(shuō)明脾腎兩臟共同調(diào)控津液在機(jī)體內(nèi)運(yùn)行輸布，唾液為脾腎共同所主這一理論的科學(xué)性。