孫維良，萬(wàn)光儀，鄧國(guó)志**

(1. 安徽大學(xué) 資源與環(huán)境工程學(xué)院，安徽 合肥 230601；2. 安徽大學(xué) 濕地生態(tài)保護(hù)與修復(fù)安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230601)

近年來(lái)，偶氮染料是染料工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛的一類(lèi)含偶氮基團(tuán)的芳香化合物. 其中Ponceau S作為典型偶氮染料在工業(yè)染色中運(yùn)用廣泛，其滯留在環(huán)境中會(huì)分解成多種致癌芳香胺. 由于共軛鍵和生色基團(tuán)的影響，Ponceau S 分子的生化性差、色度高[1]等復(fù)雜特點(diǎn)使含Ponceau S 廢水成為最難處理的工業(yè)廢水之一. 因此迫切需要一種安全、快速有效的方法去除水體中的Ponceau S 染料. PMS 活化過(guò)硫酸鹽是國(guó)內(nèi)外近些年發(fā)展起來(lái)的高級(jí)氧化體系(AOPs)[2]，通過(guò)活化PMS 產(chǎn)生氧化能力極強(qiáng)的自由基，對(duì)有機(jī)污染物具有良好的降解效果. 催化PMS 降解污染物的關(guān)鍵在于尋找合適的催化劑，當(dāng)前催化劑主要有過(guò)渡金屬離子[3]、金屬硫化物[4]、負(fù)載型化合物[5]、摻雜型化合物[6]等.

Te 為多價(jià)態(tài)的過(guò)渡金屬：-2、+2、+4 和+6 價(jià)，這為利用電子轉(zhuǎn)移活化PMS 提供了可能[7]. 目前制備碲納米顆粒(TeNPs)的方法有物理法、化學(xué)法和生物法. 其中物理法所用設(shè)備過(guò)于昂貴且只是暫時(shí)轉(zhuǎn)移污染物，并沒(méi)有從根本上去除污染物[8]，化學(xué)法成本消耗高[9]且所需的還原試劑有毒，生物法不僅對(duì)Te(Ⅳ)具有較強(qiáng)的解毒和代謝能力[10]，而且生物活性高、結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，因而考慮生物法，即通過(guò)蛋白質(zhì)、還原酶等代謝產(chǎn)物將其還原成低生物毒性的單質(zhì).

經(jīng)過(guò)多年研究，TeNPs 已應(yīng)用于吸附染料和重金屬[11]、抗菌[12]和去除生物膜[13]等. 本實(shí)驗(yàn)利用Meyerozyma guilliermondii(季也蒙畢赤酵母菌)，在好氧環(huán)境下將Te(Ⅳ)還原并對(duì)其還原產(chǎn)物進(jìn)行純化表征. 然后以偶氮類(lèi)染料Ponceau S 為污染物，利用TeNRs 催化PMS 對(duì)目標(biāo)污染物進(jìn)行氧化降解，并對(duì)其降解機(jī)制進(jìn)行分析，為生物化學(xué)聯(lián)合處理偶氮染料提供了新的方向.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌種Meyerozyma guilliermondii

1.1.2 培養(yǎng)基 LB 液體培養(yǎng)基：Trypone 10 g/L，Yeast extract 5 g/L，NaCl 10 g/L.

還原液體培養(yǎng)基：（NH4）2SO40.255 g/L，NaCl 0.46 g/L，MgSO4·7H2O 0.024 g/L，K2HPO40.225 g/L，KH2PO40.225 g/L，HEPes 4.766 g/L，微量元素儲(chǔ)備液5 mL/L；pH=7.0.

LB 固體培養(yǎng)基和還原固體培養(yǎng)基：在上述成分之外加入18.0 g/L 的瓊脂.

培養(yǎng)基在121 ℃滅菌15 min.

1.1.3 試劑 二乙基二硫代氨基甲酸酯(DDTC)、三羥甲基氨基乙烷(Tris)、鹽酸(HCl)、L-組氨酸、叔丁醇、乙醇和苯酚，本實(shí)驗(yàn)采用的試劑均為分析純.

亞碲酸鈉(Na2TeO3)采購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司，PMS 采購(gòu)自上海薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司.

1.2 方法

1.2.1 菌株 的篩選及 培養(yǎng) 取5 g 土樣接 種到50 mL LB 培養(yǎng)基中30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)48 h；取培養(yǎng)液2 mL 加至pH=7.0 的還原培養(yǎng)基培養(yǎng)72 h；待培養(yǎng)基混濁. 上述步驟篩選3 代后取10 μL 培養(yǎng)液在含0.1 mmol/L Te(Ⅳ)的LB 固體平板上劃線，30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，當(dāng)LB 固體培養(yǎng)基上菌落呈黑色時(shí)，證明所得分離菌株可還原Te(Ⅳ)，繼續(xù)純化3 次后，于超低溫冰箱保種.

冰 箱 取 出 保 種 的 菌 轉(zhuǎn) 至50 mL LB 培 養(yǎng) 基中，在30 ℃、150 r/min 好氧培養(yǎng)24 h，離心收集(8 000 r/min，5 min)，用滅菌的還原培養(yǎng)基重懸離心，重復(fù)3 次. 打開(kāi)分光光度計(jì)預(yù)熱20 min，取50 μL菌液稀釋100 倍使OD600=1.0，計(jì)算接菌量.

1.2.2 菌株合成TeNRs 將菌株接種至含有10 g/L葡萄糖的還原培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min 避光培養(yǎng).

1.2.3 Te(Ⅳ)的測(cè)定方法 溶液中亞碲酸鹽的測(cè)定方法采用文獻(xiàn)中描述的DDTC[14]方法：取1 mL 上 清 液 在9 727 r/min 下 離 心10 min，依 次加 入0.5 mol/L Tris-HCl（pH=7.0）溶 液3 mL 和10 mmol/L DDTC 溶液1 mL，混勻，室溫避光反應(yīng)10 min 后測(cè)定OD340nm.

1.2.4 TeNRs 的表征儀器 紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司，型號(hào)為DU730)、X射線衍射儀(日本株式會(huì)社理學(xué)，型號(hào)為SmartLab 9KW)、透射電子顯微鏡-能譜(日本電子株式會(huì)社，型號(hào)JEM-2100)、掃描電子顯微鏡(日本日立公司，型號(hào)REGULUS 8230)和傅里葉紅外光譜(德國(guó)布魯克公司，型號(hào)Vertex80+Hyperion2000).

1.2.5 TeNRs 的純化 10 000 r/min 離心10 min，棄上清液，Tris-HCl 重懸沉淀，去離子水離心沖洗3～5 遍，保留沉淀；超聲破碎1 h (間隔2 s，超聲4 s)后，10 000 r/min 離心10～30 min；沉淀于超低溫冰箱冷凍保存1 h，放入冷凍干燥機(jī)過(guò)夜，研磨成粉末后4 ℃冰箱保存.

1.2.6 TeNRs 催化 PMS 氧化降解Ponceau S，向25 mL 錐形瓶中加入10 mg/L Ponceau S 溶液，再加入0.06 g/L TeNRs 和0.40 g/L PMS 粉末. 在150 r/min、30 ℃恒溫氣浴振蕩，每隔0.5 h，使用0.45 μm 注射器過(guò)濾器取出樣品，并立即用分光光度計(jì)在λmax=520 nm 處測(cè)定吸光度，實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 組平行樣.

2 結(jié)果與討論

2.1 菌 株 合 成TeNRs菌 株 在 含0.5 mmol/L Te(Ⅳ)平板和還原培養(yǎng)基中好氧培養(yǎng)24 h 后，結(jié)果如圖1 所示. 在無(wú)Te(Ⅳ)的情況下平板和培養(yǎng)基并無(wú)顏色變化，表明沒(méi)有新物質(zhì)產(chǎn)生；而添加Te(Ⅳ)的平板和培養(yǎng)基的顏色會(huì)變黑，Te(Ⅳ)明顯被還原為T(mén)e(0).

圖1 菌還原Te(Ⅳ)的表面特征Fig. 1 Surface characteristics of Te(Ⅳ) reduction by fungus

2.2 TeNRs 的表征取反應(yīng)后的溶液，將其用去離子水稀釋注入石英比色皿中，以去離子水為參比，在200～900 nm 的波長(zhǎng)范圍內(nèi)，用UV-Vis 進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描. 如圖2 所示，發(fā)現(xiàn)在210 nm 處有明顯的吸收峰，已有文獻(xiàn)證實(shí)TeNRs 的特征峰是由于表面等離子共振(SPR)[15]，證明TeNRs 的存在.

圖2 TeNRs 的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig. 2 UV-Vis absorption spectra of TeNRs

對(duì)樣品進(jìn)行XRD 檢測(cè)，使用jade 6.5 軟件對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析. 如圖3，發(fā)現(xiàn)在22.99°、27.63°、38.68°、47.01°和51.89°的衍射峰可與Te 的標(biāo)準(zhǔn)卡(ICDD 卡 號(hào)36-1452)(100)、(101)、(102)、(200)和(103)面的衍射峰相對(duì)應(yīng). 這表明TeNRs 成功制備.

圖3 TeNRs 的XRD 圖譜Fig. 3 The XRD spectra of TeNRs

Baesman 等[16]利用芽孢桿菌(Bacillus)合成棒狀TeNRs；在Zare 等[17]的研究中生物合成TeNRs的長(zhǎng)度為180 nm. 為了進(jìn)一步確定納米粒子的形貌和成分，利用TEM 觀察TeNRs 的形貌，如圖4(a)所示，細(xì)胞壁表面分散著平均長(zhǎng)度為100 nm 左右的納米棒，推測(cè)其為T(mén)e(Ⅳ)的還原產(chǎn)物. 為了進(jìn)一步表征納米粒子，對(duì)樣品進(jìn)行如圖4(b)的HRTEM 分析，結(jié)果表明納米粒子晶格條紋的間距約為0.21 nm，對(duì)應(yīng)TeNRs 的(102)晶格平面. 對(duì)圖4(a)中標(biāo)示的納米棒進(jìn)行EDS(圖5)分析，發(fā)現(xiàn)單質(zhì)Te 在3.6 keV下有一個(gè)顯著峰值，觀測(cè)到C，N，O 的峰，推測(cè)源于生物分子，如酶、菌生物材料或包裹在TeNRs 上的多糖和蛋白質(zhì)[18]，此外Cu 產(chǎn)生的峰值是由于納米粒子滴于銅網(wǎng)上造成. 從SEM (圖6)可看出大量納米棒位于細(xì)胞壁表面，這與TEM 結(jié)果一致. 這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)TeNRs 的存在.

圖4 TeNRs 透射電子顯微鏡圖和高分辨透射電子顯微鏡圖Fig. 4 TEM picture and HRTEM picture of TeNRs

圖5 TeNRs 的EDS 圖譜Fig. 5 Energy spectrometer of TeNRs

圖6 TeNRs 掃描電鏡圖像Fig. 6 SEM picture of TeNRs

圖7 給出的FTIR 光譜用來(lái)分析TeNRs 表面的有機(jī)官能團(tuán): 3 382 cm-1處吸收峰(O―H 伸縮)，2 926 cm-1(C―H 反對(duì)稱伸縮)，2 854 cm-1(C―H 對(duì)稱伸縮)，1 749 cm-1(C＝O 伸縮)，1 652 cm-1(C＝C伸縮)，1 415 cm-1(COO―對(duì)稱伸縮)，1 235 cm-1(多糖 和 磷 脂 中 的P＝O 伸 縮)、1 077cm-1(肽 聚 糖C―O 和 P―O 伸縮). 結(jié)果表明，生物合成 TeNRs表面附著蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì).

圖7 TeNRs 的傅里葉紅外光譜Fig. 7 The FTIR spectra of TeNRs

2.3 TeNRs 催化PMS 氧化降解Ponceau S保持Ponceau S 投 加 量 為10 mg/L，TeNRs 投 加 量 為0.06 g/L，PMS 投加量為0.40 g/L 的條件不變.

(1)Ponceau S 顏色在不同體系下的變化如圖8(a)所示，單獨(dú)加PMS 或只有染料存在時(shí)，染料顏色基本不會(huì)改變；單獨(dú)加TeNRs 時(shí)，染料顏色會(huì)加深；而對(duì)比加入TeNRs 和PMS 時(shí)，染料顏色會(huì)逐漸發(fā)生改變，最終由紅色變?yōu)榘咨?

(2)Ponceau S 顏色在不同體系下降解曲線如圖8(b)所示，4 種體系下Ponceau S 的降解速率比較：v(TeNRs+PMS +Ponceau S) ＞v(PMS+Ponceau S)＞v(TeNRs+Ponceau S) ≈v(Ponceau S). 單 獨(dú) 加TeNRs 對(duì)Ponceau S 基本不會(huì)吸附；單獨(dú)加入PMS對(duì)Ponceau S 有一定的降解效果，但其最終降解率在6.61%；而對(duì)比加入TeNRs 催化PMS 對(duì)Ponceau S 的降解效果較為顯著，降解率可達(dá)92.5%.

圖8 TeNRs 催化降解Ponceau S 性能實(shí)驗(yàn)Fig. 8 Catalytic degradation of Ponceau S by TeNRs

由上述可知單獨(dú)加入TeNRs 時(shí)，對(duì)Ponceau S顏色及降解率的影響基本忽略不計(jì)，說(shuō)明Ponceau S 降解并非吸附作用造成；PMS 可降解Ponceau S是因其本身的氧化性，但其顏色變化和降解率不明顯；當(dāng)同時(shí)加入 PMS 和TeNRs 后，Ponceau S 的顏色變化顯著、降解率大大增加，說(shuō)明TeNRs 可提供催化活性位點(diǎn)以活化PMS 產(chǎn)生強(qiáng)氧化性自由基[19]，故生物合成的TeNRs 具有良好的催化PMS 氧化降解Ponceau S 的能力.

2.4 降解機(jī)制的分析實(shí)驗(yàn)采用L-組氨酸、叔丁醇、乙醇和苯酚來(lái)猝滅催化降解過(guò)程中可能產(chǎn)生的自由基.L-組氨酸主要猝滅單線態(tài)氧（1O2）[19]；乙醇和苯酚常用猝滅HO·和SO4-·；叔丁醇對(duì)HO·有比較高的反應(yīng)速率，常用來(lái)猝滅HO·. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖9 所示，當(dāng)TeNRs+PMS+Ponceau S 體系添加500 mmol/L 的乙醇后，Ponceau S 降解率從92.5%下降為52.6%；添加1 mmol/L 的L-組氨酸和500 mmol/L的叔丁醇后有輕微抑制Ponceau S 降解的作用；加入500 mmol/L 的苯酚后，Ponceau S 的降解率降為34.6%.

圖9 自由基猝滅實(shí)驗(yàn)Fig. 9 Free radical quenching experiment

推測(cè)產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是L-組氨酸、叔丁醇、乙醇和苯酚的水溶性不同，對(duì)液相和催化劑表面的自由基及非自由基清除效果不同[20].L-組氨酸，乙醇和叔丁醇都是親水性化合物，相對(duì)難以接近催化劑表面，大部分會(huì)在液相中與污染物分子競(jìng)爭(zhēng)自由基，所以當(dāng)3 種化合物加入反應(yīng)體系后，降解率會(huì)出現(xiàn)不同的降低情況，結(jié)合猝滅劑會(huì)清除特定自由基可知：在反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的自由基有SO4-·、HO·以及非自由 基1O2，但主要產(chǎn)生的是SO4-·. 而苯酚屬于疏水性化合物，會(huì)更容易接近催化劑表面，從而高效清除催化劑表面的自由基[21]，由結(jié)果現(xiàn)象看苯酚的抑制作用最為強(qiáng)烈，分析催化劑表面具有大量的SO4-·. 由此可知TeNRs在催化PMS 降解Ponceau S 的過(guò)程中，無(wú)論在催化劑表面還是液相，SO4-·都起到了主要作用.

為了進(jìn)一步分析Ponceau S 的降解機(jī)制，實(shí)驗(yàn)采用UV-Vis 全波長(zhǎng)掃描(圖10)對(duì)不同時(shí)間段TeNRs+PMS+Ponceau S 的反應(yīng)體系進(jìn)行掃描以考察染料在降解過(guò)程中的結(jié)構(gòu)變化.Ponceau S 在可見(jiàn)區(qū)域520 nm 處有1 個(gè)強(qiáng)的吸收峰，即偶氮鍵(―N＝N―)與萘環(huán)共軛發(fā)色體系的吸收峰，近紫外區(qū)259 nm 處吸收峰對(duì)應(yīng)苯環(huán)、萘環(huán)或雜環(huán)不飽和體系[22]. 隨著反應(yīng)的進(jìn)行，520 nm 和259 nm 處吸收峰逐漸降低，分別對(duì)應(yīng)偶氮鍵斷裂和苯環(huán)、萘環(huán)開(kāi)環(huán)等反應(yīng).

圖10 Ponceau S 的紫外-可見(jiàn)吸收光譜Fig. 10 UV-Vis absorption spectra of Ponceau S

根據(jù)自由基猝滅的結(jié)果可知，在TeNRs 催化PMS 降解Ponceau S 的過(guò)程中，SO4-·起到了主要作用，而且結(jié)合不同時(shí)間降解產(chǎn)物的紫外-可見(jiàn)光譜推測(cè)染料Ponceau S 主要的降解機(jī)制是由于TeNRs表面豐富的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程使其活化PMS 的能力增強(qiáng)，產(chǎn)生的SO4-·破壞了染料的偶氮鍵、苯環(huán)和萘環(huán)結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致Ponceau S 的降解.

3 結(jié)論

本 文 利 用Meyerozyma guilliermondii還 原Te(Ⅳ)，通過(guò)分析XRD、TEM-EDS、SEM 和FTIR，證明TeNRs 的成功合成. TeNRs 催化PMS 降解Ponceau S 的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：TeNRs 可提供催化活性位點(diǎn)以活化PMS 降解Ponceau S，4 h 降解率達(dá)到92.5%；并且通過(guò)自由基猝滅實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，整個(gè)體系中，SO4-·起到了主導(dǎo)作用，從而導(dǎo)致Ponceau S的降解. 故TeNRs 具有良好的催化PMS 氧化降解Ponceau S 的能力，這也為生物化學(xué)聯(lián)合處理偶氮染料提供了新的催化策略.