楊德友，楊 琳，閆向楠，唐吉雲，駱焱平，王蘭英

（海南大學 植物保護學院/熱帶農林生物災害綠色防控教育部重點實驗室，?？?570228）

柱花草（StylosanthesSw.）又稱巴西苜蓿、熱帶苜蓿等，柱花草是我國熱帶、亞熱帶地區(qū)栽培的主要豆科牧草，具有干物質產量高、粗蛋白含量高等特點，被廣泛應用到反芻動物飼料中[1?3]。中國南方如廣東、廣西等省(區(qū))，將柱花草與果樹間種，柱花草除用作飼草外，還可起到覆蓋、保持水土和綠肥作用[4]。中國熱帶農業(yè)科學院自20世紀60年代起從國際熱帶農業(yè)研究中心(Centro International Agriculture Tropicals, CIAT)等地引進柱花草種質，先后培育了‘熱研2號’(Stylosanthes guianensis‘Reyan No.2’)、‘熱研5號’(Stylosanthes guianensis‘Reyan No.5’)等優(yōu)良柱花草品種13個[5]。近年來，柱花草的根部和葉部病害日益嚴重，嚴重影響了柱花草的產量和品質[6?8]，因此，開展柱花草的增產促生作用研究具有一定的實際意義。

微生物通過調節(jié)生物地球化學循環(huán)、有機質重組和礦化的多種酶活性改善土壤條件[9]從而在維持土壤的健康和促進健康土壤的形成中發(fā)揮重要作用。近年來，微生物對植物的促生作用逐漸引起科研人員的關注，正在成為應用微生物研究領域的熱點。植物根際促生菌(Plant-growth-promoting rhizobacteria，簡稱PGPR)是指能夠促進植物生長、增加作物產量、防治病蟲害的有益細菌。根際促生菌對植物生長促進的機制可分為直接和間接2種方式。直接的促生作用是指PGPR能產生一些生長促進物質，如生長激素和鐵載體等，供植物利用，促進植物對營養(yǎng)物質的吸收；間接的促生作用是指PGPR通過對病原微生物的生物防治，減輕或抑制有害微生物，從而間接促進植物生長[10?11]。有研究表明，放線菌除具有很好的生防作用外，也能通過產生長素，溶解磷酸鹽，產生鐵載體等方式促進植物生長[12?13]。本實驗室在前期實驗中分離得到4株對土傳病害具有良好防效的內生放線菌NM2、NM3、NM17和NM24。筆者以柱花草為供試植物，采用皿內測定法和盆栽實驗法，研究本實驗室在前期實驗中分離得到的4株放線菌對柱花草形態(tài)指標和生理生化指標的影響，旨在探究4株放線菌對柱花草的促生長作用及柱花草的增產機制。

1 材料與方法

1.1 供試菌株供試內生放線菌分別為婁徹氏鏈霉菌（Streptomyces roche，代號NM2、NM3）和密旋鏈霉菌（Streptomyces pactum，代號NM17、NM24），由海南大學植物保護學院農藥研究室保存并提供。

1.2 制備供試放線菌的孢子懸浮液按照文獻[14]的方法制備高氏1號培養(yǎng)基：可溶性淀粉（20 g），KNO3（1 g），K2HPO4（0.5 g），MgSO4·7H2O（0.5 g），NaCl（0.5 g），F(xiàn)eSO4·7H2O（0.01 g），瓊脂(16 g)，蒸餾水1 L， pH=7.2～7.4，121 ℃滅菌20 min。分別配制4種供試放線菌的孢子懸浮液（109cfu·mL?1），并按10%接種量分別接種在高氏1號培養(yǎng)液中，28 ℃，160 r·min?1振蕩培養(yǎng)5 d。分別取振蕩培養(yǎng)5 d的發(fā)酵液300 mL，經8 000 r·min?1離心10 min后，將上清液經0.22 μm濾膜過濾制得發(fā)酵液原液。將原液用無菌水稀釋成10倍、50倍、100倍的發(fā)酵液，與原液一同備用；

1.3 種子與土壤柱花草種子由中國熱帶農業(yè)科學院品質資源研究所提供。精選均一且顆粒飽滿無破損的柱花草種子，用1%高錳酸鉀表面消毒，再用無菌水沖洗3次后，用溫燙法催芽直到種子露白（備用）。盆栽所用土壤（采自海南大學植物保護學院教學基地）過篩并進行干熱滅菌。

1.4 柱花草皿內測定法實驗皿內測定方法在文獻[15]的方法上做一定的修改：取10粒稱質量后的露白柱花草種子放入直徑為9 cm鋪有濾紙的培養(yǎng)皿內，沿培養(yǎng)皿邊緣每天同一時間分別加入3 mL供試菌株，用無菌水稀釋成10倍、100倍的發(fā)酵液，在日夜溫度[（18±2） ℃～（25±2） ℃]下進行，每天自然光照為10 h，培養(yǎng)4 d。分別以無菌高氏1號液體培養(yǎng)液和無菌水為對照，每個處理重復3次。

1.5 盆栽實驗盆栽實驗于2019年11?12月在海南大學植物保護學院實驗教學基地進行。溫室條件：28 ℃、濕度70%、自然光照。將催芽露白的柱花草種子均勻放置于裝滿滅菌土壤的盆缽里，再覆蓋1層無菌土。出苗后第5天移植于裝有1 400 g土的培養(yǎng)缽中，每處理30株。每株放線菌對柱花草促生長實驗設3個處理，3個處理為分別淋施發(fā)酵液原液、10倍稀釋發(fā)酵液、50倍稀釋發(fā)酵液，對照為分別淋施無菌高氏1號液體培養(yǎng)液和無菌水，實驗共設12個處理組，2個對照組，每處理3次重復。間苗時盡量使各培養(yǎng)缽內幼苗間隔一致。從拌土種植后連續(xù)3次每隔7 d澆灌處理液50 mL，以維持和加強放線菌的作用。

1.6 生物性狀測定皿內測定法實驗：待無菌水處理的種子根和莖出現(xiàn)明顯區(qū)分時，測量幼苗培養(yǎng)前后的質量，計算凈增重值、莖長、根長。盆栽實驗：第3次澆灌7 d后取樣，測量形態(tài)指標，包括幼苗鮮質量、幼苗株高；生理生化指標，包括葉綠素總含量[16]、可溶性糖含量（蒽酮法）[17]、可溶性蛋白質含量（考馬斯亮藍法測定）[18]、根系活力強度(TTC法)[19]。

1.7 數據處理采用SPSS 22.0進行數據差異性分析，其中使用單因素方差分析法（ANOVA）分析數據，并使用LSD進行多重比較分析。各項數據均以平均值±標準差（Mean ± SD）表示。采用OriginPro 2018C軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 皿內測定法實驗結果分析

2.1.1 放線菌對皿內柱花草幼苗鮮質量和莖長的影響由圖1可見，與無菌水對照組（KQ）和無菌高氏1號液體培養(yǎng)液對照組（KP）相比，4株放線菌發(fā)酵液在不同稀釋濃度下均能促使幼苗鮮質量增加和莖的伸長，其中，放線菌NM24的發(fā)酵液在稀釋10倍和稀釋100倍后均可顯著提高幼苗的鮮質量；與KP相比，在稀釋10倍條件下，放線菌NM3、NM24、NM17和NM2促進莖的伸長百分比依次為48.34%、39.34%、38.01%和37.70%，稀釋100倍條件下則為28.00%、29.60%、34.40%和36.25%；與KQ相比，在稀釋10倍條件下，放線菌NM3、NM24、NM17、NM2促進莖的伸長百分比依次為49.56%、40.50%、39.15%和38.84%，稀釋100倍條件下則為32.23%、33.88%、38.84%和40.75%，差異顯著。

圖1 4株放線菌對柱花草幼苗鮮質量和莖長的影響Fig. 1 Effect of 4 strains of Streptomyces on the fresh weight and stem length of the Stylosanthes seedlings

2.1.2 放線菌對柱花草幼苗根長的影響由圖2可見，經放線菌發(fā)酵液處理后的柱花草幼苗根長的伸長生長與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比，均受到不同程度的抑制作用，菌株NM2和NM17的抑制隨發(fā)酵液濃度的降低而減弱。

圖2 4株放線菌對皿內柱花草幼苗根長的影響Fig. 2 Effect of 4 strains of Streptomyces on root length of theStylosanthes seedlings

2.2 盆栽實驗結果分析

2.2.1 放線菌對柱花草株高的影響盆栽實驗結果（圖3）表明，經放線菌發(fā)酵液處理后的柱花草幼苗株高，與無菌水對照組（KQ）和培養(yǎng)液對照組（KP）相比有所增加。其中，與對照組（KP、KQ）相比，4株放線菌不同濃度的發(fā)酵液對柱花草的促進作用均達到顯著水平，其中，放線菌NM2、NM3和NM17隨發(fā)酵液濃度降低，對柱花草株高的促進作用減弱；放線菌NM24對柱花草株高的促進作用隨發(fā)酵液濃度降低呈現(xiàn)增加趨勢。

圖3 4株放線菌對皿內柱花草幼苗株高的影響Fig. 3 Effect of 4 strains of Streptomyces on the plant height of the Stylosanthes seedlings

2.2.2 放線菌對柱花草鮮質量的影響由圖4可見，經過放線菌發(fā)酵液處理后的柱花草幼苗鮮質量，與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比有所增加。與無菌水對照組（KQ）相比，4株菌株的發(fā)酵液原液、10倍稀釋發(fā)酵液和50倍稀釋發(fā)酵液處理都顯著增加柱花草幼苗鮮質量。其中，在發(fā)酵液原液濃度下，放線菌NM2、NM17、NM24和NM3對柱花草鮮質量增加百分比在發(fā)酵液原液濃度下依次為67.53%、64.94%、49.35%和46.75%；在10倍稀釋液條件下依次為64.94%、62.34%、59.74%和46.75%；在50倍稀釋液條件下依次為54.55%、41.56%、62.34%和33.77%。與培養(yǎng)基對照組相比，差異并不顯著，推測可能是培養(yǎng)液中含有一些柱花草生長需要的營養(yǎng)物質對柱花草鮮質量的變化產生了影響。

圖4 4株放線菌對柱花草幼苗鮮質量的影響Fig. 4 Effect of 4 strains of Streptomyces on the plant height of the Stylosanthes seedlings

2.2.3 放線菌對柱花草根系活力和葉綠素含量的影響經放線菌發(fā)酵液處理后的柱花草幼苗根系活力和葉綠素含量的測定結果（圖5）表明，與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比，4株放線菌發(fā)酵液均顯著提高了柱花草的根系活力（圖5-A），且菌株NM2、NM3和NM17隨發(fā)酵液濃度降低，根系活力呈現(xiàn)減弱的趨勢；在葉綠素含量結果中（圖5-B），與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比，4株放線菌發(fā)酵液原液和10倍稀釋液都顯著增加了柱花草的葉綠素含量，且隨著發(fā)酵液濃度降低，增加效果減弱。其中，與KQ相比，放線菌NM17、NM2、NM24和NM3對柱花草葉綠素含量增加百分量在發(fā)酵液原液濃度下依次為27.84%、18.13%、13.19%和11.36%；在10倍稀釋液條件下依次為17.21%、12.64%、7.51%和11.17%；與KP相比，放線菌NM17、NM2、NM24和NM3對柱花草葉綠素含量增加百分量在發(fā)酵液原液濃度下依次為28.33%、18.59%、13.62%和11.79%；在10倍稀釋液條件下依次為17.67%、13.07%、7.93%和11.60%。

圖5 4株放線菌對柱花草幼苗根系活力和葉綠素含量的影響Fig. 5 Effect of 4 strains of Streptomyces on root activity and chlorophyll content of the Stylosanthes seedlings

2.2.4 放線菌對柱花草可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響經過放線菌發(fā)酵液處理后柱花草幼苗可溶性蛋白和可溶性糖含量的測定結果（圖6）表明，與無菌水對照組（KQ）和空白培養(yǎng)液對照組（KP）相比，淋施放線菌不同稀釋濃度的發(fā)酵液均相應提高了柱花草的可溶性蛋白含量（圖6-A），其中，與KQ相比，放線菌NM2、NM24、NM17和NM3對柱花草可溶性蛋白含量增加百分量在發(fā)酵液原液條件下依次為36.10%、33.17%、29.36%和27.32%；在10倍稀釋液條件下依次為24.39%、34.63%、26.44%和11.51%；在50倍稀釋液條件下依次為26.15%、15.61%、11.51%和10.63%；與KP相比，放線菌NM17、NM2、NM24和NM3對柱花草可溶性蛋白含量增加百分量在發(fā)酵液原液條件下依次為28.81%、26.04%、22.44%和20.50%；在10倍稀釋液條件下依次為17.73%、27.42%、19.67%和5.54%；在50倍稀釋液條件下依次為19.39%、9.42%、5.54%和4.71%，且菌株NM2、NM3和NM17隨發(fā)酵液濃度降低，可溶性蛋白含量呈現(xiàn)降低的趨勢。可溶性糖含量結果（圖6-B）表明，與無菌水對照組（KQ）相比，淋施菌株NM2、NM17和NM24發(fā)酵液原液和10倍稀釋液都增加了柱花草的可溶性糖含量，其中，放線菌NM24、NM17和NM2對柱花草可溶性糖含量增加百分量在發(fā)酵液原液條件下依次為33.48%、23.08%和9.80%；在10倍稀釋液條件下依次為22.62%、5.43%和4.52%。隨著發(fā)酵液濃度降低，柱花草可溶性糖含量增加效果減弱，且菌株NM24的促進效果與對照相比具有顯著差異，但菌株NM3對柱花草可溶性糖含量的增加則起到抑制作用。隨著發(fā)酵液濃度降低，抑制效果減弱。

圖6 4株放線菌對柱花草幼苗可溶性蛋白和可溶性糖含量的影響Fig. 6 Effect of 4 strains of Streptomyces on the soluble protein and soluble sugar contents of the Stylosanthes seedlings

3 討 論

關于放線菌的促生作用已經開展了大量的研究，如王艷等[20]的報道表明，內生放線菌SR-1102不僅能有效防治蔬菜立枯病，同時能使番茄、辣椒產量分別提高10.10%～14.61%、7.67%～13.53%；據李興昱等[21]報道，放線菌ZZ-9可通過有效促進小麥幼苗的生長來提高小麥植株的抗病性；BAOUNE等[22]分離的17株鏈霉菌屬的內生放線菌，均能夠通過產生鐵載體、溶解磷酸鹽、IAA、固氮等方式促進植物生長。可見，放線菌不僅可作為重要的生防資源，還對植物表現(xiàn)出良好的促生作用[23]。對放線菌的促生作用主要從對植物的形態(tài)指標和生理生化指標的影響進行評價。植株根長、莖長、株高和鮮質量是容易觀察和測定的直觀指標，一般作為形態(tài)指標測定內容。植物中葉綠素含量直接影響光合作用強度，對提高植物的產量有一定意義[24?25]；可溶性蛋白質可以反映出植物體的代謝強度，它參與新器官的建成，而且有一部分是直接調控各種生化反應的酶[26]；可溶性糖既是高等植物的主要光合產物，又是碳水化合物代謝和暫時貯藏的主要形式，在植物碳代謝中占有重要位置[27]；根系活力是衡量根系功能的主要指標之一，植物根系是植物營養(yǎng)和水分的吸收器官，根的生長情況和活力水平直接影響地上部的生長和營養(yǎng)狀況[28]，上述這些指標可以較全面地代表植株的生長健康狀況，一般作為生理生化指標測定內容。本研究結果表明，4株放線菌發(fā)酵液在不同稀釋濃度下都促使幼苗鮮質量的增加和莖的伸長，并且在高濃度下均能提高柱花草葉綠素、可溶性蛋白質的含量。同時除NM3外，其余3株放線菌在高濃度下也能提高柱花草植株可溶性糖的含量。由此可見，供試的放線菌可以顯著地增加柱花草形態(tài)指標量的變化，也能在高濃度下顯著地增強柱花草生理生化指標質的提升，對柱花草具有很好的促生作用，具有提升柱花草產量和品質的潛質。本研究結果表明，利用不同放線菌發(fā)酵液對柱花草幼苗進行處理，可顯著提高柱花草生理指標和增加干物質積累量。故推測其增產機制可能是放線菌產生的次級代謝產物通過直接促生長作用，促進柱花草地下部根的伸長，吸收更多的水分和養(yǎng)分，從而增加地上部鮮質量，提高幼苗葉綠素含量，促進柱花草光合能力增強，進而增加干物質的積累，最終提高柱花草的品質和產量。

另外，本研究結果還表明，供試的4株放線菌對柱花草不同測定指標活性順序不同，如在10倍稀釋液濃度下，4株放線菌對皿內幼苗鮮質量促進作用的大小依次為NM24>NM2>NM3>NM17，對盆栽幼苗鮮質量促進作用的大小依次為NM2>NM17>NM24>NM3，對葉綠素含量促進作用的大小依次為NM17>NM2>NM3>NM24。可見，每種放線菌產生的次生代謝產物明顯存在差異，對不同測定指標起作用的活性物質也不同。因此，在后續(xù)研究中有必要進一步開展放線菌的促生活性成分的研究，以便為放線菌次生代謝產物的開發(fā)應用奠定基礎。