靖 晶，李 軍，劉鳳軍，徐 君，姜紅衛(wèi)，李 青

（蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院/太湖地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇蘇州215000）

0 引言

蝴蝶蘭(Phalaenopsis aphrodita)是觀賞價值極高的花卉之一，其花型奇特，花色艷麗，花期長，深受人們的喜愛，素有“蘭花皇后”的美稱。蝴蝶蘭在蘭花市場上占有相當(dāng)大的比例，主要用作切花和盆花栽培?，F(xiàn)在市場上對蝴蝶蘭的需求量正在逐年增加。目前運用組織培養(yǎng)技術(shù)對蝴蝶蘭進行繁殖是蘭花工廠化生產(chǎn)中普遍運用的繁殖方式，這種無性繁殖方法具有保持母本優(yōu)良形狀、縮短繁育周期、利于周年生產(chǎn)的優(yōu)點，但是因為不經(jīng)過有性繁殖世代，很容易造成病毒積累，嚴重影響蝴蝶蘭的觀賞價值和商業(yè)價值。據(jù)統(tǒng)計，蘭花受到約27種病毒的侵染，最主要的是建蘭花葉病毒(CymMV)和齒蘭環(huán)斑病毒(ORSV)[1]。這2種病毒的普遍發(fā)生與無性繁殖方式有著密切的關(guān)系，人工繁殖時造成的機械傷口可導(dǎo)致病毒的廣泛傳播，因此，與病株直接接觸、使用被病株污染過的器具等都有可能傳播該病毒[2]。隨著國內(nèi)外蘭花品種交流的增加和貿(mào)易的迅猛增長，也給病毒病的傳播和蔓延提供了更多的機會。研究和建立一種既能保持品種優(yōu)良特性和較高的繁殖系數(shù)，又能脫除培養(yǎng)材料中的病毒病原的有效方法，對于防止病毒的進一步擴散，減少種植者的風(fēng)險具有重要的現(xiàn)實意義。

White和Limasset等研究表明，病毒濃度呈梯度變化，病毒粒子隨植物組織的成熟而增加，旺盛生長的根尖、莖尖很少有病毒分布[3-4]。目前已有的報道有多種脫除病毒的方法，有通過噴灑農(nóng)藥殺死傳播媒介昆蟲，也有通過轉(zhuǎn)基因手段給植物導(dǎo)入抗性基因等，然而應(yīng)用最廣泛的就是通過組織培養(yǎng)技術(shù)對植物進行脫除病毒[5]?，F(xiàn)有的通過組織培養(yǎng)技術(shù)進行植物脫毒的研究主要包括莖尖分生組織培養(yǎng)脫毒[6]、熱處理結(jié)合莖尖的脫毒法、化學(xué)藥劑結(jié)合莖尖分生組織的脫毒法[7]、珠心胚培養(yǎng)脫毒法及莖尖微體嫁接脫毒法等[8]，還有近幾年報道的超低溫脫毒技術(shù)[9]。Morel等[10]首次通過莖尖培養(yǎng)成功獲得脫毒的大麗花，之后莖尖培養(yǎng)相繼用于桃、櫻桃、櫻花、豆櫻、山櫻花等植物脫毒。朱根發(fā)等[11]對文心蘭的脫毒快繁技術(shù)進行了研究，利用文心蘭的莖尖生長錐誘導(dǎo)出原球莖后，通過癥狀觀察、生物接種、電鏡觀察和血清學(xué)檢測方法進行了CMV、TMV、CyMV、ORSV等4種常見蘭花病毒病的檢測，成功地建蘭了3個品種的文心蘭脫病毒無性系。姜玲、張明濤等[12]對墨蘭圓球莖頂端分生組織培養(yǎng)結(jié)合化學(xué)處理脫除建蘭花葉病毒(CyMV)的效果進行了研究，發(fā)現(xiàn)原球莖頂端分生組織經(jīng)過20 mg/L的三氮唑核苷處理，可以獲得100%的無病毒苗。王玉英等[13]以蘭屬花卉虎雪蘭組培原球莖為試材，采用玻璃化超低溫法對蘭花病毒的脫除進行了研究，結(jié)果表明,在蔗糖濃度0.5 mol/L預(yù)培養(yǎng)4天，然后在蔗糖0.6 mol/L加載液冰上處理50 min，之后轉(zhuǎn)入PVS2溶液冰上玻璃化處理120 min，再液氮冷凍40 min，之后經(jīng)過水浴解凍和卸載后恢復(fù)培養(yǎng)，原球莖成活率可達到65%以上，隨機檢測不同處理樣品的脫毒率可達97%。

目前，針對蝴蝶蘭的脫除病毒方面的研究已有少量報道。程曉菲等[14]分別從云南蝴蝶蘭病樣中分離到隸屬于番茄斑萎病毒屬(Tospovirus)的病毒分離物Tospo-Pha。葛云星[15]通過誘導(dǎo)莖尖形成原球莖的方式來進行蝴蝶蘭脫毒的研究，發(fā)現(xiàn)接種成活率與莖尖大小呈正比關(guān)系，莖尖小于0.2 mm時，成活率不超過25%。需要說明的是，該種方法可能存在原有性狀的變異。鄭荔丹等[16]報道稱，蝴蝶蘭原球莖在33～37℃溫度下熱處理4周，然后采用帶2～3個葉原基的莖尖作為外植體，脫毒率比對照（未經(jīng)熱處理，只培養(yǎng)莖尖）提高23%～26%?，F(xiàn)有的關(guān)于蝴蝶蘭脫毒的研究大多不成體系，研究不夠深入，脫毒方法簡單或者表述不清，方法的可重復(fù)性不強；另外在脫毒病毒前后，并沒有分別進行病毒的檢測工作，這樣就無法確定通過相應(yīng)的實驗操作后，最終病毒是否完全脫除干凈，或者脫除到什么程度。本實驗在前人研究的基礎(chǔ)上，通過組織培養(yǎng)的方式，將莖尖頂端分生組織培養(yǎng)與化學(xué)處理方法相結(jié)合，這種方法目前在蝴蝶蘭脫毒處理上尚未見報道。另外，在本實驗前后運用了酶聯(lián)免疫試劑盒的方法進行了病毒檢測，旨在比較準(zhǔn)確地把握不同脫毒方法脫除病毒的效果和程度。

1 材料與方法

1.1 植物材料的準(zhǔn)備及病毒檢測

從北京市蝴蝶蘭生產(chǎn)溫室采集葉片上帶有不規(guī)則褪綠斑紋的蝴蝶蘭植株，以健康的蝴蝶蘭作對照，運用Compound direct ELISA法分別進行2種病毒CymMV和ORSV的檢測。2種病毒的ELISA試劑盒由美國Agdia公司提供，切取植株葉片在樣品提取緩沖液中研磨后靜置，提取上層清夜用于病毒檢測。經(jīng)過包被抗體，孵育，洗板，點樣及孵育，洗板，加酶標(biāo)記物稀釋液及孵育，洗板，加PNP底物溶液及孵育的過程后，可以用肉眼直接觀察檢測結(jié)果。每個樣品分成2份分別進行2種病毒（CymMV和ORSV）的試劑盒檢測，比較陽性孔和陰性孔的顏色對照。2種病毒的顯色反應(yīng)均是顯黃色的樣品為陽性含病毒的樣品，顯無色的樣品為陰性不含病毒或者病毒含量較低的樣品。將陽性含病毒的植株進行標(biāo)記，作為脫病毒實驗的植物材料。

1.2 外植體消毒及培養(yǎng)條件

切取已檢測出含CymMV和ORSV病毒的蝴蝶蘭植株的花梗為外植體材料，將含有腋芽的花梗節(jié)段先用75%酒精棉球擦拭一遍尤其是腋芽部位，之后用洗滌靈清洗10 min再用自來水沖洗30 min，放入75%酒精滅菌30 s，再在0.1%升汞中處理12 min后，在無菌水中清洗4～5次，用解剖刀分別切去消毒后花梗兩端各1 cm左右之后，接種到誘導(dǎo)腋芽的培養(yǎng)基中。培養(yǎng)室溫度為(25±3)℃，光照強度15～20 μmol/(m2·s)，光照時間12 h/d，相對濕度70%～80%。

1.3 腋芽誘導(dǎo)及增殖

在MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L+蔗糖30 mg/L培養(yǎng)基(pH 5.8)上誘導(dǎo)花梗腋芽。經(jīng)過大約2個月的誘導(dǎo)培養(yǎng)后，外植體逐漸分化出2 cm左右的叢生芽，此時將其切離花梗并轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基上進行繼代壯苗，增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L(pH 5.8)。大約2個月后，當(dāng)叢生芽在增殖培養(yǎng)基中生長至3～4 cm左右時，可以用于脫毒培養(yǎng)。

1.4 脫毒處理及蝴蝶蘭植株再生

取增殖培養(yǎng)基中經(jīng)過繼代后的組培苗，將外圍葉片去掉，保留中心生長點，切取大小為1～2、2～3、3～4、4～5、5～6 mm的莖尖頂端分生組織，然后接種到培養(yǎng)基MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L中進行培養(yǎng)誘導(dǎo)形成新芽。每長度處理50個莖尖頂端分生組織小塊，重復(fù)3次，比較不同莖尖長度的成活率和脫毒率。以上述實驗結(jié)果作為化學(xué)處理切取莖尖長度的依據(jù)，切取大小為2～3 mm的莖尖頂端分生組織，分別放入含有0、10、20、30和40 mg/L三氮唑核苷的無菌離心管中浸泡15 min，然后將上述材料分別接種到含相應(yīng)濃度的三氮唑核苷的培養(yǎng)基MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖30 g/L(pH 5.8)中培養(yǎng)30天，誘導(dǎo)生成叢生芽，之后再轉(zhuǎn)入不含抗病毒劑的培養(yǎng)基中。每濃度處理50個莖尖頂端分生組織小塊，重復(fù)3次。繼代培養(yǎng)2～3個月后，形成新生的叢生芽。將叢生芽接種到生根培養(yǎng)基1/2MS+6-BA 2.0 mg/+NAA 0.5 mg/L+蔗糖20 g/L+0.5%活性炭中進行生根培養(yǎng)，獲得再生植株，采集其葉片進行病毒檢測。

1.5 脫毒培養(yǎng)后的ELISA檢測

按照Compound direct ELISA法，對脫毒處理之后的再生植株，進行2種病毒CymMV和ORSV的檢測[3]。剪取待檢測的脫毒后蝴蝶蘭植株葉片，在樣品提取緩沖液中研磨，然后去上層清液用于檢測。檢測步驟同1.1。需要注意的是每次檢測都需要一個陽性質(zhì)控孔和一個陰性對照孔，只有在陽性質(zhì)控孔得到陽性結(jié)果，陰性對照孔得到陰性結(jié)果的時候，實驗結(jié)果才是可靠的。另外，只要通過檢測后，2種病毒的檢測顯色反應(yīng)均為陰性，才算是脫除了病毒。檢測結(jié)果可直接觀察，顯黃色為陽性反應(yīng)證明病毒未被脫除，顯無色為陰性反應(yīng)證明病毒已被脫除。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖大小對莖尖成活率的影響

在切取不同長度的莖尖到相同的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進行脫毒培養(yǎng)的過程中，隨著莖尖長度的增加，莖尖成活率明顯上升（表1）。莖尖長度是1～2 mm時，接種至培養(yǎng)基中，有4/5的莖尖褐化淹沒或者透明狀，停止生長，僅有1/5成活并且形成再生植株，成活率極低。當(dāng)莖尖大小是2～3 mm時，成活率迅速增加，為76%，僅有1/4莖尖死亡。莖尖長度為3～4 mm時，成活率稍有增加，為86%。莖尖大小4～5 mm時，92%的莖尖形成再生植株。當(dāng)莖尖長度為5～6 mm，莖尖成活率達到最高，為100%，莖尖在接種后20天開始膨大生長，逐漸分生出叢生芽，并形成再生植株。對實驗數(shù)據(jù)的方差分析證明，不同莖尖長度之間莖尖的成活率差異均極顯著。

表1 莖尖長度對蝴蝶蘭莖尖成活率的影響

2.2 莖尖大小對莖尖脫毒效果的影響

在對成活莖尖誘導(dǎo)出的再生植株進行ELISA法檢測后，統(tǒng)計檢測結(jié)果。表2結(jié)果顯示，在不同長度莖尖的脫毒培養(yǎng)中，與成活率的變化規(guī)律相反，隨著莖尖長度的增加，莖尖脫毒率迅速下降。莖尖是1～2 mm時，雖然只有1/5的莖尖成活，但是成活的莖尖形成的再生植株，均未檢測到CymMV和ORSV病毒病原。莖尖長度是2～3 mm時，在成活率76%較高的情況下，脫毒率為68%，僅有1/3成活的再生植株仍能檢測到CymMV或ORSV病毒病原，所以綜合考慮成活率和脫毒率的2個因素并且結(jié)合相關(guān)資料，將莖尖2～3 mm作為莖尖結(jié)合化學(xué)處理脫毒切取的莖尖長度。在莖尖大小為3～4 mm時，再生植株脫毒率較低，為54%；當(dāng)莖尖大小為4～5 mm和5～6 mm時，未檢測出病毒病原的再生植株極少，僅為26%和12%。對實驗數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果顯示，在P=0.05和P=0.01時，各莖尖大小之間脫毒率的差異均極顯著。

表2 莖尖大小對蝴蝶蘭CymMV和ORSV脫毒效果的影響

2.3 化學(xué)處理對莖尖成活率的影響

在含有相應(yīng)濃度0、10、20、30、40 mg/L三氮唑核苷的誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，隨著三氮唑核苷濃度的增加，莖尖的成活率明顯降低（表3）。在0 mg/L三氮唑核苷的培養(yǎng)基中，即未經(jīng)化學(xué)處理的莖尖，前4周開始變化不大，當(dāng)繼續(xù)培養(yǎng)時，莖尖開始萌動生長，成活率為75%，由于莖尖太小(2～3 mm)，25%的莖尖褐化死亡。在10 mg/L三氮唑核苷的培養(yǎng)基中，約有70%的莖尖成活并分生出叢生芽。經(jīng)20 mg/L三氮唑核苷處理后的莖尖約1/3出現(xiàn)褐變，生長處于停滯狀態(tài)，另外的2/3莖尖恢復(fù)生長。在30 mg/L三氮唑核苷的培養(yǎng)基中處理的莖尖，38%褐化死亡，另外的62%莖尖在轉(zhuǎn)入新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基后，需要近2周的緩解過程，生活力才逐漸恢復(fù)，隨后莖尖細胞不斷分裂和生長形成叢生芽。隔30天繼代1次，繼代2次后，叢生芽生長至2 cm左右時，切分這些芽至增殖培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)2～3個月，便形成再生植株。完成脫毒和植株再生程序需要5～6個月。在40 mg/L三氮唑核苷的培養(yǎng)基中，莖尖幾乎全部出現(xiàn)嚴重的透明和褐變現(xiàn)象，細胞生活力很難恢復(fù)，未獲得再生植株。對實驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性測驗發(fā)現(xiàn)，0、10、30、40 mg/L三氮唑核苷處理的莖尖成活率兩兩之間均差異顯著，而20 mg/L與10 mg/L三氮唑核苷處理，以及20 mg/L與30 mg/L三氮唑核苷處理的莖尖成活率之間差異不顯著(P=0.05)。

表3 三氮唑核苷處理對蝴蝶蘭莖尖成活率的影響

觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過脫毒培養(yǎng)形成的再生植株，試管苗上并無典型的CymMV和ORSV癥狀。將經(jīng)過繼代培養(yǎng)形成的叢生芽，接種到生根培養(yǎng)基中，30～40天后每株可長出3～4條健壯的根，根長3 cm左右。

2.4 化學(xué)處理對莖尖脫毒效果的影響

實驗表明，在用三氮唑核苷處理的莖尖脫毒培養(yǎng)中，隨著三氮唑核苷濃度的升高，莖尖2種病毒（CymMV和ORSV）的脫毒率呈明顯增長趨勢（表4）。在未用三氮唑核苷處理中，即直接切取2～3 mm的莖尖頂端生長錐，通過組織培養(yǎng)誘導(dǎo)形成的再生植株，有32%仍帶有CymMV或ORSV病原。在10 mg/L三氮唑核苷的培養(yǎng)基中，由于三氮唑核苷對病毒復(fù)制的抑制作用，比較0 mg/L三氮唑核苷的處理，脫毒率明顯升高，達到80%，即仍有20%未脫除病毒病原。經(jīng)20 mg/L三氮唑核苷處理后的莖尖有較好的脫毒效果，脫毒率約為91%，僅有9%仍帶有病毒病原。而經(jīng)30 mg/L三氮唑核苷處理后誘導(dǎo)的再生植株，其葉片經(jīng)過ELISA檢測后，未檢測出CymMV和ORSV病原，結(jié)果均為陰性，脫毒效果最為理想。經(jīng)4個處理樣本脫毒率百分數(shù)的差異顯著性測驗，添加三氮唑核苷的處理與未添加三氮唑核苷的處理間差異極顯著，同時4個處理兩兩之間的差異均極顯著。

表4 三氮唑核苷處理對蝴蝶蘭CymMV和ORSV脫毒效果的影響

3 結(jié)論與討論

從理論上講，莖尖分生組織不帶病毒或帶毒濃度很低，使莖尖培養(yǎng)脫毒成為可能。本研究沒有直接取已檢測出含有CymMV和ORSV病毒的植株莖尖頂端分生組織，而是取其花梗進行組織培養(yǎng)誘導(dǎo)成組培苗，并經(jīng)過增殖繼代，然后取組培苗的莖尖分生組織進行脫毒培養(yǎng)，這樣一方面降低了病毒含量，本身的組織培養(yǎng)過程就是一個脫毒的過程；另一方面豐富了脫毒材料的來源，并且沒有直接破壞母株，這是本研究的一個可取之處。本研究結(jié)果證明，莖尖長度在1～2 mm時，所取的莖尖分生組織太小，雖然脫毒率很高，但是成活率太低，莖尖很容易褐化死亡，再生植株困難。所以在化學(xué)處理結(jié)合莖尖脫毒中，所取莖尖大小為2～3 mm，這樣減少了植株再生的難度，成活率較高。但是直接培養(yǎng)獲得的脫毒率只有68%，加入病毒唑后，脫毒率平均升高22.3%，由此可見，單純使用莖尖分生組織培養(yǎng)，不能達到理想的脫毒目的。

Lim等[18]研究指出，三氮唑核苷進入被病毒感染的細胞后迅速磷酸化，其產(chǎn)物作為病毒合成酶的競爭性抑制劑，阻止病毒RNA和蛋白合成，抑制病毒的復(fù)制與傳播。本研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中加入病毒抑制劑（三氮唑核苷）可以起到一定的抗CymMV和ORSV病毒的作用。但是通過ELISA酶聯(lián)免疫的檢測方法以肉眼觀察的方式來進行顯色反應(yīng)的判斷，操作簡單方便，但是存在較大的誤差，不同視覺狀態(tài)和心理狀態(tài)的實驗者可能會得出不同的觀察結(jié)果。今后，通過分子生物學(xué)的手段進行病毒檢測將會是以后進行脫毒研究的重要手段。另外，三氮唑核苷濃度過高時，容易造成植物細胞嚴重的傷害，產(chǎn)生透明狀和褐變現(xiàn)象，甚至導(dǎo)致生命力無法恢復(fù)。Klein等[19]在馬鈴薯上的研究有類似的表現(xiàn)。莖尖的成活率和脫毒率受莖尖大小、三氮唑核苷的濃度和處理時間等因素的直接影響。

本研究主要采取的是切取莖尖頂端分生組織進行組織培養(yǎng)的方式脫毒，該方法的脫毒率直接受剝離莖尖大小的限制，剝離莖尖越小脫毒率越高，但是成活及再生率卻越低[20]。因此，在解剖鏡下剝?nèi)∥⑶o尖屬于一個很難的技術(shù)挑戰(zhàn)，操作失敗率高，很容易導(dǎo)致莖尖死亡和褐化。除熱處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)、化學(xué)處理結(jié)合莖尖培養(yǎng)等方法，近幾年開始報道的莖尖超低溫脫毒方法是今后的主要研究方向。該技術(shù)已成功地應(yīng)用于脫除甘薯類、柑橘、葡萄、香蕉、李、冬凌草、樹莓和大蒜等植物體內(nèi)的病毒細菌等[21-26]。該技術(shù)不僅脫毒效果好，而且對莖尖大小的要求不高，可以克服莖尖培養(yǎng)脫毒的技術(shù)難題[27]。在今后的研究中，將以帶毒蝴蝶蘭莖尖為材料，通過超低溫保存法，建立適應(yīng)蝴蝶蘭的完整的超低溫脫毒體系，以期為蝴蝶蘭的無毒苗生產(chǎn)提供技術(shù)支持。