佟 斌，李 虹，孫 波

（黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所，哈爾濱150040）

0 引言

藍(lán)莓是杜鵑花科(Ericaceae)越橘屬(Vaccinium)植物。果實(shí)中營(yíng)養(yǎng)豐富，并且具增強(qiáng)免疫力、預(yù)防疾病等多種功能[1-3]。全球杜鵑花科越橘屬植物種類繁多，中國(guó)自然分布一種為篤斯越橘（野生藍(lán)莓），在大、小興安嶺等地區(qū)分布，引進(jìn)品種較多[4-5]。在北方高寒地區(qū)由于低溫等制約因素，致使大多引進(jìn)的藍(lán)莓品種產(chǎn)生凍害，生長(zhǎng)緩慢[6-10]。在實(shí)際栽培時(shí)多進(jìn)行防寒處理，增加了藍(lán)莓的生產(chǎn)成本，嚴(yán)重影響北方高寒地區(qū)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)化發(fā)展[11-16]。因此，開(kāi)展藍(lán)莓的抗寒性研究對(duì)北方地區(qū)藍(lán)莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

藍(lán)莓‘興安1號(hào)’由大興安嶺野生藍(lán)莓為母本、美國(guó)矮叢藍(lán)莓為父本進(jìn)行雜交獲得，于2013年12月25日經(jīng)國(guó)家林業(yè)局審定授予藍(lán)莓植物新品種。田間栽培顯示與野生藍(lán)莓相比，‘興安1號(hào)’藍(lán)莓的性狀表現(xiàn)更優(yōu)秀，單株果實(shí)產(chǎn)量也有所增加。而抗寒能力的強(qiáng)弱成為雜交藍(lán)莓新品種推廣應(yīng)用的關(guān)鍵因素之一[17]。因此本研究利用人工防寒馴化方法，選取藍(lán)莓‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓為試驗(yàn)材料，通過(guò)盆栽防寒試驗(yàn)，設(shè)置差異處理梯度，對(duì)比不同藍(lán)莓品種的生理、生化特征，結(jié)合隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評(píng)估，衡量‘興安1號(hào)’的抗寒能力，以期為雜交藍(lán)莓新品種的應(yīng)用推廣與規(guī)?；a(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與處理方法

2019年3月將‘興安1號(hào)’藍(lán)莓、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓3年生組培苗定植于黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)。2019年10月選擇生長(zhǎng)勢(shì)均一的苗木栽于盆中，置于室外自然環(huán)境條件下正常管理養(yǎng)護(hù)。

2019年11月中旬，利用室外自然低溫脅迫。防寒措施采取深坑覆土的方式，設(shè)置輕度低溫脅迫（藍(lán)莓株高30%露出地面）、中度低溫脅迫（藍(lán)莓株高60%露出地面）、重度低溫脅迫（藍(lán)莓株高90%露出地面）、對(duì)照（不覆土）4個(gè)梯度，每個(gè)梯度處理30株。

1.2 指標(biāo)測(cè)定方法

確定采樣期為溫度最低的2020年1月，選擇同規(guī)格藍(lán)莓盆栽苗10株，每株在相同樹(shù)冠部位采樣，選取成熟度一致、深休眠期未受凍傷的枝條，用以測(cè)定各項(xiàng)指標(biāo)。采用硫代巴比妥酸法[18]測(cè)定藍(lán)莓枝條丙二醛含量，采用電導(dǎo)法[19]測(cè)定藍(lán)莓枝條電導(dǎo)率，參照J(rèn)in等[20]的方法測(cè)定藍(lán)莓枝條H2O2含量，參照Huang等[21]的方法測(cè)定藍(lán)莓枝條O2-含量，采用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法[22]測(cè)定藍(lán)莓ABA含量。

1.3 抗寒性的評(píng)估方法

生理抗寒性的評(píng)估采用隸屬函數(shù)法[23-24]，可有效消除單一指標(biāo)的片面性結(jié)論，計(jì)算如式(1)～(2)。

式中，i為藍(lán)莓類別，j為具體特定指標(biāo)，Xjmin為全類別特定指標(biāo)的最低極限值，Xjmax為全類別特定指標(biāo)的最高極限值，Uij為i類別j指標(biāo)的抗寒性隸屬函數(shù)值，Xij為i類別j指標(biāo)的值。

權(quán)重計(jì)算采用客觀賦權(quán)法，以無(wú)量綱數(shù)Ij反映低溫脅迫下特定指標(biāo)值與對(duì)照的比值，如式(3)～(4)。歸一化得到指標(biāo)權(quán)重Wj，如式(5)。抗寒性綜合評(píng)估如式(6)。

式中，Cj表示第j項(xiàng)指標(biāo)實(shí)測(cè)值，Sj表示第j項(xiàng)指標(biāo)均值。

1.4 田間試驗(yàn)的觀測(cè)方法

2019年3月與盆栽試驗(yàn)均在黑龍江省科學(xué)院自然與生態(tài)研究所實(shí)驗(yàn)基地內(nèi)，將‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓3年生苗木定植于田間，株行距0.7 m×1.5 m，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)。土壤有機(jī)質(zhì)含量5%～12%，pH 4.5～6.0，土壤濕度20%～80%。至2020年5月初為止定期統(tǒng)計(jì)株高、冠幅、植株存活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條相對(duì)電導(dǎo)率的影響

如圖1所示，在輕度低溫脅迫條件下，藍(lán)莓的相對(duì)電導(dǎo)率變化不顯著；中度低溫脅迫條件下，‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓的相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照相比均有所提高，幅度在154.4%～450%；在重度低溫脅迫條件下，3種藍(lán)莓的相對(duì)電導(dǎo)率提升幅度更大，達(dá)到297.6%～450%。由此可知，藍(lán)莓枝條的相對(duì)電導(dǎo)率受低溫脅迫影響較明顯，以美國(guó)矮叢藍(lán)莓的變化幅度最為顯著。

圖1 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條相對(duì)電導(dǎo)率的影響

2.2 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條丙二醛(MDA)含量的影響

如圖2所示，藍(lán)莓的MDA含量的變化與低溫脅迫程度的加劇呈顯著的正相關(guān)關(guān)系。在重度低溫與中度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓的MDA含量均有大幅提升，差異性達(dá)到極顯著水平。由此可見(jiàn)，一定程度的低溫脅迫下，野生藍(lán)莓、‘興安1號(hào)’的變化幅度比美國(guó)矮叢藍(lán)莓低，可以推測(cè)低溫脅迫對(duì)其質(zhì)膜傷害程度相對(duì)較小。

圖2 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條MDA含量的影響

2.3 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條的H2O2含量的影響

如圖3所示，在低溫脅迫條件下，H2O2含量隨著脅迫程度的加劇呈顯著上升趨勢(shì)。在輕度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓的H2O2含量不存在顯著差異。而在重度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，藍(lán)莓的H2O2含量都顯著提高，差異達(dá)到極顯著水平。

圖3 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條H2O2含量的影響

2.4 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條的O2-速率的影響

如圖4所示，在低溫脅迫條件下，O2-速率隨著脅迫程度的加劇顯著上升。在輕度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓的O2-速率不存在顯著差異。而在重度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，藍(lán)莓的O2-速率都顯著提高，差異達(dá)到極顯著水平。在同一程度的低溫脅迫下，不同品種的藍(lán)莓的O2-速率變化不同。

圖4 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條O2-速率的影響

2.5 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條的ABA含量的影響

如圖5所示，在低溫脅迫條件下，ABA含量隨著脅迫程度的加劇呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)。在輕度低溫脅迫條件下，‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓的ABA含量與對(duì)照之間顯著不差異。而在中度、重度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，藍(lán)莓的ABA含量都顯著提高，差異達(dá)到極顯著水平。

圖5 低溫脅迫對(duì)藍(lán)莓枝條ABA含量的影響

2.6 藍(lán)莓的抗寒性評(píng)估

基于隸屬函數(shù)的上述各指標(biāo)的加權(quán)平均值對(duì)各藍(lán)莓品種抗寒性進(jìn)行綜合評(píng)估（表1）。經(jīng)過(guò)計(jì)算發(fā)現(xiàn)，MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率、O2-速率的權(quán)重值較大，推測(cè)可能與藍(lán)莓抗寒性緊密相關(guān)。經(jīng)過(guò)綜合評(píng)估值的計(jì)算3種藍(lán)莓抗寒性有強(qiáng)到弱表現(xiàn)為‘興安1號(hào)’>野生藍(lán)莓>美國(guó)矮叢。

表1 藍(lán)莓的抗寒性評(píng)估

2.7 田間試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

2019—2020年試驗(yàn)時(shí)間內(nèi)哈爾濱市冬季平均氣溫為-12.7℃，平均降雪量為4.9 mm，接近于該地區(qū)歷史平均值。該地區(qū)總體氣候環(huán)境優(yōu)于野生藍(lán)莓自然分區(qū)地區(qū)，劣于美國(guó)矮叢藍(lán)莓引種地氣候環(huán)境。在哈爾濱越冬時(shí)冬季溫度成為藍(lán)莓生長(zhǎng)的主要限制因子。由表2可知‘，興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓的存活率顯著高于美國(guó)矮叢藍(lán)莓；‘興安1號(hào)’藍(lán)莓的冠幅明顯高于野生藍(lán)莓和美國(guó)矮叢藍(lán)莓；3個(gè)品種的株高野生藍(lán)莓、‘興安1號(hào)’藍(lán)莓?dāng)?shù)值高于美國(guó)矮叢藍(lán)莓?？傮w來(lái)說(shuō)，田間試驗(yàn)與指標(biāo)抗寒性綜合評(píng)估結(jié)果趨于一致。

表2 田間栽培條件下低溫對(duì)3個(gè)藍(lán)莓品種的生長(zhǎng)影響

3 結(jié)論

本研究基于人工防寒馴化方法，利用隸屬函數(shù)法，以田間實(shí)驗(yàn)和生理指標(biāo)相互驗(yàn)證為切入點(diǎn)進(jìn)行研究。在中度低溫脅迫條件下，‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓的相對(duì)電導(dǎo)率與對(duì)照相比均有所提高。在重度低溫脅迫條件下，3種藍(lán)莓的相對(duì)電導(dǎo)率提升幅度增加；藍(lán)莓的MDA含量的變化與低溫脅迫程度的加劇呈顯著的正相關(guān)。在重度低溫與中度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓的MDA含量均有大幅度的提升，差異性達(dá)到極顯著水平；H2O2含量隨著脅迫程度的加劇呈顯著上升趨勢(shì)。在重度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，藍(lán)莓的H2O2含量顯著提高，差異達(dá)到極顯著水平；藍(lán)莓O2-速率隨著脅迫程度的加劇呈顯著上升趨勢(shì)。在輕度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓的O2-速率不存在顯著差異。在重度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，藍(lán)莓的O2-速率顯著提高，差異達(dá)到極顯著水平；ABA含量隨著脅迫程度的加劇呈現(xiàn)顯著上升趨勢(shì)。在中度、重度低溫脅迫條件下，與對(duì)照相比，藍(lán)莓的ABA含量顯著提高，差異達(dá)到極顯著水平。通過(guò)藍(lán)莓的抗寒性評(píng)估MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率、O2-速率在5種生理指標(biāo)中的權(quán)重值較大，‘興安1號(hào)’抗寒能力總體優(yōu)于野生藍(lán)莓、美國(guó)矮叢藍(lán)莓。田間試驗(yàn)結(jié)果表明‘興安1號(hào)’、野生藍(lán)莓的自然越冬存活率顯著高于美國(guó)矮叢與藍(lán)莓生理指標(biāo)表現(xiàn)和抗寒性綜合評(píng)估結(jié)果趨于一致。

4 討論

在低溫條件下，植物細(xì)胞質(zhì)膜是植物最先受到傷害的部位，可使質(zhì)膜的透性增加、電解質(zhì)滲出。質(zhì)膜傷害越小植物的抗寒性越強(qiáng)，細(xì)胞膜的滲出率與植物御寒能力呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的趨勢(shì)，與本試驗(yàn)測(cè)得MDA含量與相對(duì)電導(dǎo)率數(shù)據(jù)所呈現(xiàn)的規(guī)律相同?！澳ぶ嘧儭睂W(xué)說(shuō)被稱為近代植物抗寒性機(jī)理研究的奠基石[19]。低溫脅迫阻礙了植物體內(nèi)活性氧自由基的代謝，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基的產(chǎn)生和清除紊亂從而形成積累。這在藍(lán)莓中已有報(bào)道[6,16,23]。在本實(shí)驗(yàn)中3個(gè)藍(lán)莓品種H2O2含量與O2-含量均隨低溫脅迫程度的加劇而呈上升趨勢(shì)，推測(cè)可能是引起藍(lán)莓膜脂過(guò)氧化程度、質(zhì)膜透性等參數(shù)呈差異化表現(xiàn)的主要根源[27]。經(jīng)生理指標(biāo)的綜合分析可知，美國(guó)矮叢藍(lán)莓的變化幅度相較‘興安1號(hào)’藍(lán)莓和野生藍(lán)莓大，由此推斷，低溫脅迫對(duì)美國(guó)矮叢藍(lán)莓的傷害程度較大，‘興安1號(hào)’藍(lán)莓和野生藍(lán)莓抗寒性相對(duì)較強(qiáng)。低溫脅迫對(duì)于資源植物的影響是多樣化的，眾多學(xué)者針對(duì)藍(lán)莓等資源植物的抗寒性鑒定主要集中在生理、生化指標(biāo)[14-17,25]。評(píng)估依據(jù)總體上可歸納為生理化指標(biāo)、農(nóng)藝性狀參數(shù)及解剖結(jié)構(gòu)等[26]，然而，所得結(jié)論各不相同。有學(xué)者針對(duì)‘美登’、‘北陸’、‘藍(lán)豐’、‘密斯梯’等藍(lán)莓品種的抗寒性分析表明，LT50值、MDA含量變化量、保護(hù)酶活性與4個(gè)藍(lán)莓品種的抗寒性最為密切相關(guān)[25]。龔月樺等[22]對(duì)美國(guó)黃松、班克松和油松的抗寒性研究表明，生理生化指標(biāo)對(duì)其的影響顯著大于農(nóng)藝性狀指標(biāo)。本研究3個(gè)藍(lán)莓品種5個(gè)生理化指標(biāo)在低溫脅迫下均呈現(xiàn)不同程度的變化，與3種藍(lán)莓抗寒性相對(duì)較緊密的指標(biāo)依次為MDA含量、相對(duì)電導(dǎo)率、O2-速率。由此可知，藍(lán)莓的抗寒性評(píng)估趨向于綜合生理指標(biāo)結(jié)合形態(tài)結(jié)構(gòu)指標(biāo)等。植物的抗逆性反映了植物在逆境脅迫條件下的生存、成長(zhǎng)及繁育能力，是多重因素復(fù)合作用的集合機(jī)制。到目前為止領(lǐng)域內(nèi)尚未形成合理的、標(biāo)準(zhǔn)化的方法[28]。因此，僅著眼于單一因素而試圖評(píng)估資源植物的抗寒性，存在若干局限性。參考前人的研究成果，隸屬函數(shù)分析在一定程度上實(shí)現(xiàn)了基于多指標(biāo)測(cè)定的針對(duì)目標(biāo)對(duì)象的綜合性評(píng)估，其鑒定評(píng)估的準(zhǔn)確性相對(duì)較高[29-30]。

本研究共測(cè)定了3個(gè)藍(lán)莓品種的5個(gè)主要抗性生理指標(biāo)，指標(biāo)種類不夠全面。分析了不同低溫處理梯度下各藍(lán)莓品種的指標(biāo)變化規(guī)律，但其中3個(gè)藍(lán)莓品種的若干指標(biāo)之間的變化趨勢(shì)呈現(xiàn)出不一致的復(fù)雜性，各指標(biāo)的增幅排序就各有差異，如MDA含量與O2-含量。對(duì)于其內(nèi)部機(jī)理探究不深，更多地應(yīng)用了前人的研究成果對(duì)本試驗(yàn)進(jìn)行論證。對(duì)生理指標(biāo)進(jìn)行客觀賦權(quán)方式結(jié)合隸屬函數(shù)對(duì)3個(gè)藍(lán)莓品種抗寒性進(jìn)行了綜合評(píng)估，一定程度上仍存在評(píng)估中的主觀隨意性。3年生藍(lán)莓仍處于植株的苗期，應(yīng)用短時(shí)間的試驗(yàn)數(shù)據(jù)研究各品種藍(lán)莓的抗寒能力并不夠詳實(shí)?！d安1號(hào)’藍(lán)莓是一個(gè)優(yōu)良的雜交藍(lán)莓新品種，本研究旨在對(duì)其環(huán)境適應(yīng)性進(jìn)行一定的了解，為‘興安1號(hào)’藍(lán)莓在北方高寒地區(qū)應(yīng)用與推廣提供一定理論參考。