劉學(xué) 欒曉瑾 肖正華

稽留流產(chǎn)（missed abortion，MA）指胚胎或胎兒已死亡，仍然滯留在宮腔內(nèi)，未能及時(shí)從陰道排出[1-2]。MA是妊娠早期的常見并發(fā)癥，在我國(guó)的發(fā)生率約為13.4%，且呈逐年遞增的趨勢(shì)[3]。MA發(fā)病因素復(fù)雜，目前研究認(rèn)為其發(fā)生與染色體異常、生殖道感染、母體系統(tǒng)疾病、內(nèi)分泌失調(diào)和解剖缺陷等有關(guān)。然而仍有30%的MA病因尚不明確[4]。近年來，有研究發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1）作為重要的趨化因子，在胎盤中廣泛表達(dá)[5]。并且有研究指出當(dāng)胚泡植入后MCP-1表達(dá)受抑，有助于胎盤的發(fā)育和妊娠的維持[6]。在復(fù)發(fā)性流產(chǎn)和反復(fù)著床失敗的發(fā)展過程中，MCP-1能夠?qū)魏思?xì)胞募集到損傷和感染部位上，發(fā)揮促炎效應(yīng)，從而導(dǎo)致不良結(jié)局[7]。胎盤的發(fā)育伴隨著滋養(yǎng)細(xì)胞的侵襲和子宮螺旋動(dòng)脈的重塑，這一過程受一系列血管生成因子的調(diào)控。CD105作為血管生成的相關(guān)標(biāo)志物之一，參與維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定，在胎盤組織中也呈廣泛表達(dá)[8]。然而目前尚未有文獻(xiàn)報(bào)道MCP-1和CD105在MA中的作用。本研究通過檢測(cè)MA和正常宮內(nèi)早孕要求終止妊娠者蛻膜組織中MCP-1和CD105的表達(dá)水平，探討MCP-1和CD105在MA發(fā)生、發(fā)展中的作用，為進(jìn)一步研究MA的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 選取2020年6至12月重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院收治住院的10例MA患者作為MA組，選取同期收治住院的10例正常宮內(nèi)早孕要求終止妊娠者作為對(duì)照組。MA組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕周7～13周；（2）年齡20～35周歲；（3）彩超檢查提示胚胎停止發(fā)育；（4）胚胎無染色體異常。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）孕周 7～13 周；（2）年齡20～35周歲；（3）彩超檢查提示宮內(nèi)妊娠，可見心管搏動(dòng)。兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）伴有全身性或生殖道的感染；（2）既往有不良孕產(chǎn)史；（3）有心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、肝腎功異常的患者；（4）妊娠期間應(yīng)用保胎藥物。兩組對(duì)象年齡、孕周、孕次、產(chǎn)次比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。本研究經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批通過，所有對(duì)象均簽署知情同意書。

表1 兩組對(duì)象一般資料比較

1.2 主要儀器和試劑 FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞分析儀、電泳儀、制膠板、電泳槽、成像儀、Stain Buffer（批號(hào)：554657）均購(gòu)自美國(guó) BD公司；BCA試劑盒（批號(hào)：B00S001100）、Dulbecco's磷酸鹽緩沖液（DPBS，批號(hào)：G4200）、4%多聚甲醛溶液（批號(hào)：AR0211）均購(gòu)自中國(guó)鼎國(guó)公司；FBS（批號(hào)：F8687）和膠原酶Ⅳ（批號(hào)：V900893）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；ficoll分離液（批號(hào)：17544652）購(gòu)自美國(guó) Cytiva公司；CD45-APC-Cy7（批號(hào)：B314603）、MCP-1-PE（批號(hào)：B193217）、CD105 抗體（批號(hào)：10010278）、山羊抗小鼠單克隆抗體（批號(hào)：SA00001-1）、DAB 顯色試劑盒（批號(hào)：PK10005）均購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。

1.3 標(biāo)本采集 術(shù)后立即收集兩組的蛻膜組織，使用預(yù)冷的0.9%氯化鈉溶液洗凈組織的血液，直至漂洗液呈無色，一部分蛻膜組織放入凍存管內(nèi)，置于-80℃冰箱保存，用于行流式細(xì)胞術(shù)和Western blot檢測(cè)；一部分組織石蠟包埋后常溫保存，用于免疫組化染色。

1.4 蛻膜免疫細(xì)胞（decidual immunocyte，DIC）中MCP-1表達(dá)水平檢測(cè) 采用流式細(xì)胞術(shù)。兩組每例各取50 g蛻膜組織于EP管中剪碎，加入1 ml濃度為0.01 g/ml的膠原酶Ⅳ消化30 min。然后加入5 ml含有10%FBS和1%雙抗的完全培養(yǎng)基終止消化，用70 μm細(xì)胞過濾器過濾，收集沉淀細(xì)胞，然后使用5 ml DPBS重懸備用。另外準(zhǔn)備一只15 ml離心管，將密度為1.077的5 ml ficoll分離液緩慢加入其中，再將準(zhǔn)備好的細(xì)胞懸液緩慢覆蓋在ficoll分離液上。使用水平離心機(jī)以2 500 r/min離心15 min，在5 ml的位置可見一層云霧狀的液面則是所需DIC，緩慢將其吸出，離心后用Stain Buffer重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml。吸取100 μl上述細(xì)胞懸液放置于流式管中，分別加入CD45-APC-Cy7、MCP-1-PE流式熒光抗體各2.5 μl，然后避光孵育30 min，再用DPBS洗滌兩遍后，用DPBS重懸至500 μl，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。應(yīng)用Flowjo軟件測(cè)定MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞的比例，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 蛻膜組織中CD105的定位及表達(dá)水平檢測(cè) 采用免疫組化法。分別取兩組蛻膜組織石蠟塊切片固定后做好標(biāo)志，然后進(jìn)行脫蠟和水化處理，再滴加 50 μl 10%BSA溶液于切片上，室溫孵育60 min進(jìn)行封閉，然后將50 μl抗-CD105鼠抗稀釋液滴加在切片上 4℃孵育過夜。再用PBS洗滌后，向每個(gè)切片中添加100 μl二抗稀釋液（1∶500），并在 4 ℃下再次孵育 50 min，陰性對(duì)照組使用PBS代替一抗。最后使用DAB顯色，將所有切片用蘇木精復(fù)染，通過分級(jí)乙醇脫水并用中性樹膠封固。將制備好的切片置于顯微鏡下觀察，并且隨機(jī)選擇3個(gè)視野（×10）進(jìn)行拍攝。使用Image J軟件測(cè)量每個(gè)視野CD105陽(yáng)性信號(hào)的平均光密度值（average optical density，AOD），并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 蛻膜組織中CD105表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。分別取兩組每例蛻膜組織30 mg，嚴(yán)格按照BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后置于-80℃冰箱內(nèi)保存。分別配制10%分離膠和4%上樣膠，待膠凝固后，每孔加入30 μg蛋白，然后在100 V恒壓條件下進(jìn)行跑膠，跑膠結(jié)束后，按照黑膠白膜的順序于轉(zhuǎn)膜液中組裝夾板，將組裝好的夾板放入轉(zhuǎn)膜槽中，以恒定電流250 mA轉(zhuǎn)90 min，轉(zhuǎn)膜結(jié)束后將膜放置在5%脫脂奶粉中封閉1 h，然后加入1∶1 000稀釋的鼠抗CD105單克隆抗體，4℃孵育過夜，再用TBST洗膜3次，接著用對(duì)應(yīng)一抗種屬的二抗稀釋液（1∶1 000）敷育1 h后用TBST洗膜，最后用ECL發(fā)光檢測(cè)試劑盒進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。使用Gel-Proanlyzer軟件進(jìn)行灰度定量分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組DIC中MCP-1表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，MA組患者DIC中MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞比例明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（36.27±3.98）%比（15.17±7.62）%，P＜0.05]，見圖 1。

圖1 兩組蛻膜免疫細(xì)胞（DIC）中單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）表達(dá)水平比較（a：兩組DIC中MCP-1表達(dá)的流式細(xì)胞圖；b：兩組DIC中MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞比例比較的柱狀圖，*P＜0.05；MA為稽留流產(chǎn)）

2.2 兩組蛻膜組織中CD105表達(dá)水平比較 免疫組化結(jié)果顯示，CD105在兩組蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核中均有表達(dá)，見圖2a-b；與對(duì)照組比較，MA組患者蛻膜組織中CD105表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（5.40±0.49 比 3.03±0.21，P＜0.05），見圖 2c。Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，MA組蛻膜組織中CD105蛋白表達(dá)水平升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（3.38±0.29比2.29±0.42，P＜0.05），見圖 3。

圖2 兩組蛻膜組織中CD105的定位和表達(dá)水平[a：稽留流產(chǎn)（MA）組蛻膜組織免疫組化染色所見，×10；b：對(duì)照組蛻膜組織免疫組化染色所見，×10；c：兩組蛻膜組織中CD105平均光密度值（AOD）比較的柱狀圖，*P＜0.05]

圖3 兩組蛻膜組織中CD105蛋白表達(dá)水平比較（a：兩組蛻膜組織中CD105蛋白表達(dá)的電泳圖；b：兩組蛻膜組織中CD105灰度值比較的柱狀圖，*P＜0.05；MA為稽留流產(chǎn)）

2.3 兩組MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞比例與CD105蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析 兩組MCP-1陽(yáng)性細(xì)胞比例和CD105蛋白表達(dá)水平均呈正相關(guān)（r=0.931和0.940，均P＜0.01），見圖4。

圖4 兩組單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）陽(yáng)性細(xì)胞比例與CD105蛋白表達(dá)水平的散點(diǎn)圖[a：稽留流產(chǎn)（MA）組；b：對(duì)照組]

3 討論

在胚胎植入過程中，子宮內(nèi)膜受卵巢激素的調(diào)控，促進(jìn)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檩^大圓形的蛻膜細(xì)胞，稱為蛻膜化。同時(shí)，具有侵襲性的絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞（extra villous trophoblasts，EVTs），植入和浸潤(rùn)至蛻膜化的子宮內(nèi)膜中，促進(jìn)螺旋動(dòng)脈的形成和重塑，為生長(zhǎng)中的胎盤和胎兒提供營(yíng)養(yǎng)和氧氣[9]。蛻膜化是成功建立和維持妊娠必不可少的一環(huán)，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞現(xiàn)已被認(rèn)為是胎盤的主要免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞之一，具有調(diào)節(jié)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲，抵抗炎癥和氧化應(yīng)激以及抑制母體局部免疫反應(yīng)的獨(dú)特能力[10-11]。一旦蛻膜化障礙則會(huì)導(dǎo)致EVTs遷移和侵襲受損，使螺旋小動(dòng)脈重塑不足，胎盤血流量減少，進(jìn)而導(dǎo)致胎盤缺氧。同時(shí)，蛻膜基質(zhì)細(xì)胞釋放各種胎盤因子，激活系統(tǒng)炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致一系列妊娠并發(fā)癥，如胎兒生長(zhǎng)受限、先兆子癇和流產(chǎn)等[12-13]。本研究中所涉及的MCP-1和CD105是公認(rèn)的與炎癥免疫和血管形成相關(guān)的關(guān)鍵分子，本研究通過檢測(cè)MA患者蛻膜組織中MCP-1和CD105的表達(dá)水平，從而為探究炎癥和血管形成在MA發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論依據(jù)。

母胎界面主要由來自母體的蛻膜和來自胚胎和胎盤的滋養(yǎng)細(xì)胞組成，作為半同種異源的胚胎，不被母體免疫系統(tǒng)排斥，依賴于DIC的免疫調(diào)控。母胎界面的DIC主要由NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和多種少數(shù)細(xì)胞類型（如樹突狀細(xì)胞、自然殺傷T細(xì)胞等）組成[14]。蛻膜NK（dNK）細(xì)胞是最大的細(xì)胞群，在妊娠早期占母體免疫細(xì)胞的50%～70%，dNK細(xì)胞具有維持蛻膜微環(huán)境穩(wěn)態(tài)的多種功能[15]。目前已被證實(shí)，dNK細(xì)胞數(shù)量和功能的變化與妊娠并發(fā)癥有關(guān)，如流產(chǎn)、胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限和子癇前期等[16]。而MCP-1是子宮內(nèi)NK細(xì)胞的有效引誘劑和激活劑，MCP-1的升高能激活和招募dNK細(xì)胞，使dNK細(xì)胞從它的自然保護(hù)作用轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴诰哂屑?xì)胞毒性的NK細(xì)胞，釋放穿孔素和誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致流產(chǎn)[17]。此外，在胚泡植入的過程中，大量MCP-1由蛻膜巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)釋放，從而進(jìn)一步將單核細(xì)胞激活為巨噬細(xì)胞并招募至母胎界面，參與炎癥的發(fā)生[18]。蛻膜組織中MCP-1表達(dá)的升高可能促進(jìn)促炎型巨噬細(xì)胞募集，進(jìn)而分泌大量炎性細(xì)胞因子（如TNF-α、INF-γ和IL-1等），進(jìn)一步增強(qiáng)MCP-1的表達(dá)，形成一個(gè)正反饋回路，最終導(dǎo)致不良妊娠結(jié)局[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，MA組蛻膜組織中MCP-1的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，提示MCP-1在MA中發(fā)揮重要作用。因此筆者推測(cè)蛻膜組織中MCP-1水平參與了母胎界面的免疫失衡，MCP-1水平升高，直接導(dǎo)致了dNK細(xì)胞活性的改變，使其發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。同時(shí)，MCP-1還可能通過誘導(dǎo)蛻膜巨噬細(xì)胞數(shù)量和功能的改變，發(fā)揮促炎的作用，最終導(dǎo)致MA的發(fā)生。

EVTs入侵子宮蛻膜后，與dNK和蛻膜巨噬細(xì)胞之間相互影響。在EVTs的植入過程中，螺旋小動(dòng)脈壁的平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞不斷降解，螺旋動(dòng)脈從窄口徑、高阻力血管轉(zhuǎn)變?yōu)榇罂趶?、低阻力血管，血液以較低的流速向絨毛間隙輸送，促進(jìn)胎盤和胎兒的生長(zhǎng)發(fā)育[21]。螺旋動(dòng)脈發(fā)育障礙嚴(yán)重影響了胎盤和胎兒的發(fā)育，最終導(dǎo)致各種妊娠并發(fā)癥。有研究指出，在子癇前期患者的血清中觀察到CD105的表達(dá)水平顯著上調(diào)，高水平的CD105導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能障礙、血管收縮和免疫失調(diào)，從而對(duì)母體和胎兒產(chǎn)生不良影響[22]。CD105是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的跨膜輔助受體，能夠干擾TGF-β與其受體的結(jié)合，抑制內(nèi)皮一氧化氮合酶對(duì)血管的擴(kuò)張作用，導(dǎo)致血管生成障礙，最終影響胎盤發(fā)育[23]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)CD105除了抗血管生成的作用外，也可以參與炎癥過程并調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。CD105可以促進(jìn)單核巨噬細(xì)胞的黏附和遷移，誘導(dǎo)促炎型的巨噬細(xì)胞分化，從而導(dǎo)致不良的妊娠結(jié)局[24]。本研究中，與對(duì)照組相比，MA組CD105的表達(dá)水平呈上調(diào)趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此筆者推測(cè)，CD105可能通過抑制血管發(fā)育和誘導(dǎo)炎癥免疫反應(yīng)來促進(jìn)MA的發(fā)生。蛻膜組織中CD105表達(dá)水平上調(diào)，一方面證實(shí)了在MA患者中，存在胎盤血管發(fā)育障礙。另一方面，CD105作為炎癥的調(diào)控因子之一，同MCP-1一樣，也能導(dǎo)致促炎型巨噬細(xì)胞增多，加劇母胎界面的炎癥反應(yīng)爆發(fā)，最終導(dǎo)致MA患者的胚胎死亡。同時(shí)相關(guān)性分析顯示，在蛻膜組織中，MCP-1和CD105呈正相關(guān)，這提示MCP-1和CD105兩者可能存在著相互作用，從而共同調(diào)控MA的發(fā)生，但這仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究顯示MA患者蛻膜組織中MCP-1和CD105高表達(dá)。MCP-1表達(dá)水平的升高，促使DIC的數(shù)量和活性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致母體界面的免疫失衡。同時(shí)CD105的上調(diào)，導(dǎo)致子宮螺旋小動(dòng)脈形成和重塑障礙，使胎盤發(fā)育不良，最終導(dǎo)致MA的發(fā)生。探討MCP-1、CD105與MA的關(guān)系，有利于為研究MA的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。