田麗麗 楊新宇 代小偉 陳雙雙 趙琰楓 王嫩寒 張潔 易俊莉 任怡宣 陳昊 樊瑞芳 石偉先 武文清 黃春 丁北川

結(jié)核病主要通過呼吸道飛沫傳播，因此需要快速、簡便、準(zhǔn)確的實(shí)驗(yàn)室診斷方法指導(dǎo)臨床早期診斷，尤其是活動性肺結(jié)核的早期診治[1]。病原學(xué)檢查是診斷活動性肺結(jié)核的金標(biāo)準(zhǔn)，但有許多不足之處，不能滿足臨床需求，尤其是近年來菌陰肺結(jié)核患者比例顯著增加[2]，給結(jié)核病診治帶來更大困難[3-6]。隨著檢測手段的發(fā)展，結(jié)核抗體檢測、結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)(T-SPOT.TB)等快速檢測技術(shù)逐漸應(yīng)用于臨床，尤其T-SPOT.TB對診斷結(jié)核分枝桿菌感染有較高的敏感度和特異度，已成為診斷結(jié)核病的重要輔助手段[1]，對菌陰肺結(jié)核的診斷也提供了很大幫助。本研究回顧性分析了2014年1月至2019年12月北京結(jié)核病控制研究所收治的715例疑似肺結(jié)核門診患者的資料，所有患者均行T-SPOT.TB、結(jié)核抗體、痰涂片、痰培養(yǎng)檢測，以臨床診斷結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，分析4種方法單獨(dú)及聯(lián)合檢測活動性肺結(jié)核的臨床意義。

資料和方法

一、 一般資料

回顧性分析2014年1月至2019年12月北京結(jié)核病控制研究所門診收治的715例疑似肺結(jié)核患者，入院時(shí)均行T-SPOT.TB、結(jié)核抗體、痰涂片、痰培養(yǎng)檢測。以臨床診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷為標(biāo)準(zhǔn)[2，7]，明確診斷為活動性肺結(jié)核患者412例，為肺結(jié)核組；非結(jié)核病患者303例(其中經(jīng)PCR確定為非結(jié)核分枝桿菌感染10例，肺部陰影待查268例，塵肺1例，肺炎8例，肺癌2例，慢性咽炎14例)，為非結(jié)核組。412例肺結(jié)核患者中，菌陽肺結(jié)核194例，菌陰肺結(jié)核218例；男性240例，女性172例；年齡13～95歲，中位年齡30(24，47)歲。所有患者均排除人類免疫缺陷病毒感染者。

二、檢測方法

1.T-SPOT.TB檢測：采用T-SPOT.TB(Oxford Immunotec公司，英國)試劑盒，從外周靜脈血中分離出單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，在每個(gè)預(yù)包被抗γ-干擾素抗體的孔中加入2.5×105個(gè)PBMC，分別與早期分泌抗原靶蛋白6(ESAT-6)和培養(yǎng)濾液蛋白10(CFP-10)共同孵育16～20 h，使用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)(ELISPOT)讀板儀對斑點(diǎn)進(jìn)行計(jì)數(shù)。陽性判定標(biāo)準(zhǔn)：(1)如果空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)<6個(gè)，檢測孔斑點(diǎn)數(shù)減去空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)>6；(2)如果空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，檢測孔斑點(diǎn)數(shù)必須>2倍的空白對照孔斑點(diǎn)數(shù)。反之，為陰性結(jié)果。陰性或陽性對照異常，試驗(yàn)均視為無效[8]。

2.結(jié)核抗體檢測：結(jié)核分枝桿菌IgG抗體檢測試劑盒(膠體金法)(MP Diagnostics ASSURE?TB Rapid Test)購自MP生物醫(yī)學(xué)亞太私人有限公司(MP Biomedicals Asia Pacific)。取患者血清25 μl至檢測孔內(nèi)，加3滴緩沖液于橢圓孔，直至樣本前沿到達(dá)藍(lán)色指示線即刻拉下分離片，加1滴緩沖液于加樣孔，水平放置，15 min內(nèi)判讀結(jié)果。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)：(1)如果在測試線處(T)和質(zhì)控線處(C)出現(xiàn)紫紅色條帶，則結(jié)核分枝桿菌抗體為陽性，任何深度條帶均應(yīng)判作陽性；(2)如果視窗內(nèi)僅質(zhì)控線處(C)顯示紫紅色條帶，則結(jié)核分枝桿菌抗體陰性；(3)如果質(zhì)控線處(C)條帶未顯示，則結(jié)果無效。

3.痰涂片、痰培養(yǎng)：萋-尼抗酸染色液、酸性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。痰涂片抗酸染色鏡檢采用萋-尼染色，按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[9](簡稱《規(guī)程》)進(jìn)行抗酸桿菌痰涂片鏡檢；分枝桿菌固體培養(yǎng)采用簡單法，按照《規(guī)程》進(jìn)行分枝桿菌分離培養(yǎng)檢查。

三、質(zhì)量控制

T-SPOT.TB檢測試劑盒按照試劑盒內(nèi)提供的陽性對照和陰性對照，與樣品同時(shí)檢測，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性；結(jié)核抗體檢測根據(jù)檢測反應(yīng)板質(zhì)控線條帶顯示判斷，嚴(yán)格按照試劑盒檢測規(guī)程以保證檢測準(zhǔn)確性；痰涂片與痰培養(yǎng)質(zhì)量控制按照《規(guī)程》要求，進(jìn)行抗酸桿菌痰涂片鏡檢及分枝桿菌培養(yǎng)的室內(nèi)質(zhì)量控制及室間質(zhì)量評價(jià)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。計(jì)數(shù)資料采用“百分率(%)”描述，組間差異的比較采用卡方檢驗(yàn)；兩變量間相關(guān)性以Spearman 法進(jìn)行相關(guān)分析。采用診斷性試驗(yàn)比較T-SPOT.TB檢測與其他方法對活動性肺結(jié)核的診斷價(jià)值，繪制受試者工作特征曲線(ROC)，計(jì)算ROC下面積(AUC)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、4種檢測方法在肺結(jié)核組與非結(jié)核組中陽性檢出率的比較

412例肺結(jié)核患者中，T-SPOT.TB檢測陽性345例，陽性檢出率為83.7%；303例非結(jié)核組患者中， T-SPOT.TB檢測陽性63例，陽性檢出率為20.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.823，P=0.000)。肺結(jié)核組結(jié)核抗體檢測陽性184例，陽性檢出率為44.7%；非結(jié)核組結(jié)核抗體檢測陽性90例，陽性檢出率為29.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.526，P=0.000)?；顒有苑谓Y(jié)核患者痰涂片檢測陽性81例，陽性檢出率為19.7%；非結(jié)核組痰涂片檢測陽性3例，陽性檢出率為1.0%；差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=56.912，P=0.000)?；顒有苑谓Y(jié)核患者痰培養(yǎng)陽性191例，陽性率為46.4%；非結(jié)核組痰培養(yǎng)陽性10例，陽性率為3.3%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.602，P=0.000)。

二、4種方法對活動性肺結(jié)核的檢測效能

T-SPOT.TB檢測活動性肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確度分別為83.7%、79.2%、84.6%、78.2%、81.8%；結(jié)核抗體檢測活動性肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確度分別為44.7%、70.3%、67.2%、48.3%、55.5%；痰涂片檢測活動性肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確度分別為19.7%、99.0%、96.4%、47.5%、53.3%；痰培養(yǎng)檢測活動性肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值和準(zhǔn)確度分別為46.4%、96.7%、95.0%、57.0%、67.7%。見表1。

表1 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)4種檢測方法對活動性肺結(jié)核的檢測效能

三、聯(lián)合檢測對活動性肺結(jié)核的檢測效能

T-SPOT.TB檢測聯(lián)合結(jié)核抗體、痰涂片及痰培養(yǎng)檢測的敏感度為93.7%，均高于4者單項(xiàng)檢測、2項(xiàng)(T-SPOT.TB+痰涂片、T-SPOT.TB+痰培養(yǎng)、痰涂片+痰培養(yǎng)、T-SPOT.TB+結(jié)核抗體、痰涂片+結(jié)核抗體、痰培養(yǎng)+結(jié)核抗體)聯(lián)合檢測和3項(xiàng)(T-SPOT.TB+痰涂片+痰培養(yǎng))聯(lián)合檢測；4種方法聯(lián)合檢測陰性預(yù)測值最高，為85.6%。見表2。

表2 以臨床診斷為標(biāo)準(zhǔn)4種方法聯(lián)合檢測對活動性肺結(jié)核的檢測效能

四、4種檢測方法分別檢測及聯(lián)合檢測的AUC

T-SPOT.TB的AUC為0.815，結(jié)核抗體檢測的AUC為0.575，痰涂片的AUC為0.593，痰培養(yǎng)的AUC為0.715，四項(xiàng)聯(lián)合檢測的AUC為0.894。見圖1。

圖1 4種方法單獨(dú)及聯(lián)合檢測受試者工作特征曲線

續(xù)表1

討 論

結(jié)核病早期診治對于控制結(jié)核病病情及其傳播具有重要意義[4]。目前，T-SPOT.TB、結(jié)核抗體檢測聯(lián)合痰涂片、痰培養(yǎng)檢測為篩選活動性肺結(jié)核的常用且較有效的方法，其中，T-SPOT.TB為近些年發(fā)展起來的快速診斷結(jié)核病新技術(shù)，抗原ESAT-6和CFP-10為結(jié)核分枝桿菌特有的片段，因此能較好排除卡介苗接種、非結(jié)核分枝桿菌感染[10]。與痰涂片、痰培養(yǎng)、結(jié)核抗體檢測相比，T-SPOT.TB 檢測活動性肺結(jié)核具有更高的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度[11-13]。

國外γ-干擾素釋放試驗(yàn)(IGRA)主要用于診斷結(jié)核分枝桿菌潛伏感染、監(jiān)測結(jié)核分枝桿菌潛伏感染發(fā)展為活動性結(jié)核病[14]，而我國IGRA試驗(yàn)主要用于活動性結(jié)核病的輔助診斷和鑒別。有報(bào)道細(xì)菌學(xué)方法檢測活動性肺結(jié)核的敏感度為49.75%，結(jié)核抗體檢測總體敏感度為56.6%，聯(lián)合檢測后敏感度為83.1%[15]。本研究顯示，痰涂片與痰培養(yǎng)聯(lián)合檢測活動性肺結(jié)核的敏感度為48.3%，結(jié)核抗體檢測總體敏感度為44.7%，四種方法聯(lián)合檢測的敏感度為93.7%；T-SPOT.TB 檢測活動性肺結(jié)核的敏感度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值、準(zhǔn)確度分別為83.7%、79.2%、84.6%、78.2%、81.8%，略低于施瑞潔等[16]的報(bào)道；而痰涂片、結(jié)核抗體檢測活動性肺結(jié)核的敏感度略高于陳晶等[4]的研究，可能與所選患者例數(shù)及痰液性狀等因素有關(guān)。本研究顯示，4種檢測方法均對活動性肺結(jié)核有一定的診斷價(jià)值，其中T-SPOT.TB診斷活動性肺結(jié)核的效能最好。

本研究顯示，T-SPOT.TB檢測聯(lián)合結(jié)核抗體及傳統(tǒng)痰涂片、痰培養(yǎng)檢測效能最高，診斷敏感度為93.7%，特異度為50.8%，AUC為0.894。略高于陳晶等[4]報(bào)道的6種檢測方法聯(lián)合檢測的AUC(0.848)，說明T-SPOT.TB、結(jié)核抗體、痰涂片、痰培養(yǎng)聯(lián)合檢測對活動性肺結(jié)核有較高的診斷價(jià)值。T-SPOT.TB檢測有較高的敏感度，但單純采用T-SPOT.TB檢測的特異度評價(jià)也有一定局限性，本研究T-SPOT.TB檢測的特異度為79.2%，李曙光等[17]報(bào)道的肺癌患者T-SPOT.TB陽性率較高，可能因?yàn)槟[瘤患者免疫力低下，易并發(fā)結(jié)核分枝桿菌潛伏感染等，此外，我國為結(jié)核感染高發(fā)國家，這些原因均可能導(dǎo)致T-SPOT.TB特異度較低，因此需要聯(lián)合檢測來提高診斷效能。

血清結(jié)核抗體檢測有操作簡單、檢測快速等優(yōu)點(diǎn)，在結(jié)核病臨床輔助診斷應(yīng)用較廣泛，但其溶血樣本和高脂血樣本可能受免疫功能影響，在疾病急性感染早期即出現(xiàn)陰性結(jié)果，因而結(jié)核抗體檢測活動性肺結(jié)核的敏感度、特異度不高，限制了疾病診斷與有效治療[12]。本研究結(jié)核抗體檢測的敏感度、特異度較國內(nèi)外一些研究偏低[18-20]，可能主要是因?yàn)樵谠噭┲锌乖倪x擇及優(yōu)化上有區(qū)別。敏感度、特異度與黃德東等[21]研究結(jié)果相差不大。痰涂片、痰培養(yǎng)對活動性肺結(jié)核診斷的敏感度較低，尤其是痰涂片，敏感度為19.7%，痰培養(yǎng)為46.4%。代小偉等[22]研究顯示，痰涂片、痰培養(yǎng)的敏感度分別為22.5%、32.2%，可能與所選病例數(shù)、痰液性狀等因素有關(guān)。另外，楊新宇等[23]的研究結(jié)果顯示，無論是痰涂片或痰培養(yǎng)結(jié)果，合格痰標(biāo)本的陽性檢出率及量化分級指標(biāo)均遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于不合格標(biāo)本。

將T-SPOT.TB、結(jié)核抗體、痰涂片、痰培養(yǎng)聯(lián)合檢測用于活動性肺結(jié)核的診斷，可起到互補(bǔ)作用，其中T-SPOT.TB避免了接種過卡介苗可能存在的抗原交叉反應(yīng)，有較高特異度，結(jié)合結(jié)核抗體檢測后從體液免疫與細(xì)胞免疫方面進(jìn)行檢測，再聯(lián)合傳統(tǒng)的痰涂片與痰培養(yǎng)檢測，對提高診斷準(zhǔn)確率有互補(bǔ)作用。

綜上所述，T-SPOT.TB、結(jié)核抗體聯(lián)合痰涂片、痰培養(yǎng)檢測在活動性肺結(jié)核診斷中有較高的臨床意義，可提高診斷敏感度、特異度、準(zhǔn)確度。

本研究的不足之處是未將結(jié)核分枝桿菌核酸檢測技術(shù)納入評價(jià)體系。隨著結(jié)核分枝桿菌核酸檢測技術(shù)的普及應(yīng)用，筆者建議今后可以系統(tǒng)評估結(jié)核分枝桿菌核酸檢測技術(shù)及免疫學(xué)檢查方法聯(lián)合應(yīng)用，對診斷活動性肺結(jié)核，尤其是病原學(xué)陰性肺結(jié)核的價(jià)值及成本，提出適合不同情況的最優(yōu)診斷流程。