方秋月，王君巧，諶淑平，董 楠，聶少平

(南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330047)

冬蟲夏草，又名夏草冬蟲、蟲草，是指麥角菌科真菌寄生在蝙蝠蛾科昆蟲幼蟲上的子座及幼蟲尸體的復(fù)合體[1]，在我國(guó)主要分布于西藏、青海、四川、云南和甘肅等省3 000～5 200 m的高海拔地區(qū)[2]。冬蟲夏草味甘，性溫，歸肺、腎經(jīng)，具有補(bǔ)腎益肺、止血化痰等功效，主要包含糖類、氨基酸、核苷酸、脂肪酸、無機(jī)元素、維生素等化學(xué)成分[3-4]，現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示，冬蟲夏草具有抗腫瘤、抗氧化、降血糖、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用[5]。

在本課題組前期的研究中，對(duì)天然冬蟲夏草的化學(xué)成分和多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了系統(tǒng)的研究[6-8]。此外，天然冬蟲夏草多糖在體外表現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫調(diào)節(jié)作用[9]，并在體內(nèi)顯著降低環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的腸道損傷，發(fā)揮腸粘膜免疫調(diào)節(jié)作用[10]。然而，其他提取物的生物活性尚不清楚，對(duì)腸道損傷的改善作用也不明確，因此，本研究收集天然蟲草多糖提取過程中各個(gè)組分，建立環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制模型，研究不同組分對(duì)小鼠腸道損傷的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

天然冬蟲夏草取材于中國(guó)青海省，環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，香菇多糖購(gòu)于上海江萊生物，小鼠白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β3(transforming growth factor-β3,TGF-β3) ELISA試劑盒購(gòu)于南京森貝伽公司，小鼠分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A,sIgA)試劑盒購(gòu)于武漢碧云天公司。

雌性BALB/c小鼠，6周齡，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司(資格證號(hào)：SCXK (湘) 2016-0002)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物符合美國(guó)國(guó)家健康研究院規(guī)定(NIH Publication 85-23,1996)，實(shí)驗(yàn)操作經(jīng)南昌大學(xué)動(dòng)物保護(hù)評(píng)審委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 儀器與設(shè)備

3K15低溫高速離心機(jī)，美國(guó)Sigma公司；Milli-Q超純水儀，美國(guó)Millipore公司；-80 ℃超低溫冰箱、E-330型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Thermo公司；SHP-50生化恒溫培養(yǎng)箱，上海森信儀器有限公司；CKX41倒置熒光顯微鏡，日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 天然冬蟲夏草不同組分的提取

采用水和乙醇分別提取天然冬蟲夏草不同組分，過程如下，用80%乙醇浸泡冬蟲夏草原料過夜，離心得到上清醇提物(EE)及沉淀醇提殘?jiān)?REE)。REE用熱水浸提3次，離心得上清水提物(WE)和水提殘?jiān)?RWE)。WE用無水乙醇沉淀過夜，離心后沉淀為粗多糖(NCSP)，上清為醇溶物(WE-S)。NCSP用 Sevag 試劑除去游離蛋白后再用無水乙醇沉淀得到純多糖(NCSP-50)，具體方法參考實(shí)驗(yàn)室前期研究[9]。

1.3.2 動(dòng)物分組及處理

清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠130只，6～8周，(20.0±2.0) g，(22±1) ℃環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，取118只小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺100 mg·kg-1bw，連續(xù)注射3 d，建立免疫抑制模型，未造模的12只為正常對(duì)照組(NC)。造模結(jié)束后隨機(jī)選取10只小鼠檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)確定造模成功。剩下造模了的108只小鼠隨機(jī)分為9組，分別為：原料粉末組(NCS)、醇提物組(EE)、醇提殘?jiān)M(REE)、水提物組(WE)、粗多糖組(NCSP)、醇溶物組(WE-S)、純多糖組(NCSP-50)、香菇多糖陽性對(duì)照組(LNT)以及模型對(duì)照組(MC)。第11～17 d，10組小鼠進(jìn)行灌胃，灌胃情況如下：REE、WE、NCSP和NCSP-50組等含有一定多糖含量的組分，以實(shí)驗(yàn)室前期研究為參照，劑量為100 mg·kg-1·bw[10]；其他組分(NCS、EE、WE-S)以粗多糖NCSP的劑量為基礎(chǔ)，依據(jù)相對(duì)于原料的得率[11]確定劑量如下：NCS組(1330 mg·kg-1·bw)，EE 組(394 mg·kg-1·bw)，WE-S 組(58 mg·kg-1·bw)；LNT組為100 mg·kg-1·bw；其中EE、WE、NCSP、WE-S、NCSP-50等5個(gè)組分可溶于水，稱取灌胃所需劑量后直接溶于生理鹽水配制成溶液；NCS和REE經(jīng)反復(fù)粉碎后稱取給藥所需劑量后用生理鹽水配制成低濃度懸浮液，分多次灌胃給藥，NC組和MC組分別灌胃等體積生理鹽水。末次給藥24 h后稱重，頸椎脫臼處死小鼠，收集胸腺、脾臟、小腸等臟器，保存于-80 ℃。

此外，實(shí)驗(yàn)前期也對(duì)水提殘?jiān)黂WE進(jìn)行了研究，但是實(shí)驗(yàn)過程中RWE組小鼠全部死亡。經(jīng)解剖后，發(fā)現(xiàn)該組小鼠胃里堆積未消化殘?jiān)?，推測(cè)可能是由于RWE難以被消化，因此，后期實(shí)驗(yàn)未對(duì)RWE進(jìn)行研究。

1.3.3 小鼠器官指數(shù)的測(cè)定

小鼠進(jìn)行頸椎脫臼處死后，取出胸腺和脾臟，用生理鹽水漂洗后用濾紙吸干多余水分，稱重，以胸腺或脾臟(mg)和體重(g)的比值表示胸腺和脾臟的指數(shù)。

1.3.4 小鼠小腸緊密連接蛋白的觀察

小鼠解剖后，用剪刀剪取3 cm小鼠空腸浸于4%多聚甲醛中進(jìn)行固定，參考劉丹鳳[12]等的方法進(jìn)行脫水固定及臘片包埋，參考Poritz[13]等的方法，采用直接免疫熒光法檢測(cè)小腸緊密連接蛋白表達(dá)，處理好的組織切片，200倍熒光顯微鏡下觀察緊密連接蛋白表達(dá)并拍照。

1.3.5 小鼠小腸IgA分泌細(xì)胞數(shù)量以及sIgA含量的測(cè)定

采用直接免疫熒光法檢測(cè)定小腸IgA分泌細(xì)胞的數(shù)量，方法同1.3.4，處理好的組織切片，200倍熒光顯微鏡下選取4個(gè)視野觀察并拍照，運(yùn)用Image-Pro Plus 6.0計(jì)數(shù)分泌IgA陽性細(xì)胞數(shù)，并取4個(gè)視野下IgA分泌細(xì)胞數(shù)量的總值。

取適量小腸組織用冷生理鹽水制成10%組織勻漿，3000 r·min-1離心15 min，收集上清液并分裝保存于-80 ℃?zhèn)溆?，參考說明書測(cè)定小腸sIgA含量。

1.3.6 小鼠小腸細(xì)胞因子的測(cè)定

取1.3.5收集的小腸上清液，參考說明書測(cè)定小腸IL-17和TGF-β3含量。

1.3.7 小鼠小腸轉(zhuǎn)錄因子的測(cè)定

取適量小腸組織，采用定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(quantitative real time polymerase chain reaction，RT-qPCR)測(cè)定轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。根據(jù)Trizol說明書提取總RNA，以提取的總 RNA為模板，用cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，RT-qPCR擴(kuò)增參照試劑盒說明，以管家基因β-actin作為內(nèi)參，mRNA 的結(jié)果采用相對(duì)定量法，所有要檢測(cè)的細(xì)胞因子的基因均用Ct值來表示，用2-ΔΔCt來計(jì)算每個(gè)處理組基因的相對(duì)表達(dá)。目的基因引物序列及退火溫度如表1。

表1 目的基因引物序列及退火溫度

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 天然冬蟲夏草不同組分對(duì)小鼠器官指數(shù)影響

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，胸腺是T細(xì)胞分化成熟的場(chǎng)所，能調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞的分泌表達(dá)[14]，脾臟是機(jī)體進(jìn)行特異性免疫調(diào)節(jié)的主要場(chǎng)所，能夠產(chǎn)生多種免疫應(yīng)答[15]。如表2所示，與正常組相比，模型組小鼠胸腺嚴(yán)重萎縮，灌胃不同組分后，除NCS組外其它各組的胸腺指數(shù)均有回升；環(huán)磷酰胺能通過代償性增生導(dǎo)致脾臟腫大，因此造模后的脾臟指數(shù)與正常組相比顯著提高(P<0.01)，除NCS和REE組外，其它各組的脾臟指數(shù)均有顯著下降，且EE組效果最為顯著。表明天然冬蟲夏草各提取物組分能通過調(diào)節(jié)免疫器官指數(shù)來緩解環(huán)磷酰胺造成的免疫器官損傷。

表2 天然蟲草不同組分對(duì)器官指數(shù)的影響

2.2 天然冬蟲夏草不同組分對(duì)小鼠小腸組織結(jié)構(gòu)形態(tài)及緊密連接蛋白的影響

小腸是各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)最終消化吸收的主要器官，保持正常腸道屏障功能對(duì)小腸發(fā)揮生理功能具有重要意義[16]。腸道緊密連接蛋白是腸道機(jī)械屏障的重要組成部分，由跨膜蛋白(Claudin、Occludin等)和細(xì)胞內(nèi)蛋白(ZO等)之間的相互作用組成，能夠阻止過敏原，毒素和病原體等大分子的擴(kuò)散[17-18]。如圖1所示，與正常組相比，模型組的緊密連接蛋白(Claudin-1、Occludin、ZO-1)的表達(dá)量明顯降低且不連續(xù)，與模型組相比，其它各組均能提高緊密連接單邊的表達(dá)量且表達(dá)相對(duì)較連續(xù)，可以看出天然冬蟲夏草不同組分可以在一定程度上提高緊密連接表達(dá)，從而修復(fù)腸道機(jī)械屏障。

注：A 、B、C分別為小腸緊密連接蛋白Claudin-1，Occludin，ZO-1。

2.3 天然冬蟲夏草不同組分對(duì)小鼠小腸sIgA含量以及IgA分泌細(xì)胞數(shù)目的影響

B細(xì)胞在受到抗原刺激后進(jìn)入黏膜固有層形成IgA分泌細(xì)胞[19]，成熟的IgA分泌細(xì)胞可進(jìn)一步分化成為sIgA，作為黏膜層中最豐富的免疫球蛋白，sIgA具有抵御病原體和毒素，免疫調(diào)節(jié)等功能[20-21]。如圖2所示(具體數(shù)值見附表S1)， Cy能夠造成IgA分泌細(xì)胞數(shù)量和sIgA含量顯著降低，給予冬蟲夏草各組分后，除NCS組外其它各組均能顯著提高IgA分泌細(xì)胞的數(shù)量，而只有NCS、EE、WE-S組對(duì)sIgA含量有明顯提高作用，前期研究發(fā)現(xiàn)WE-S的黃酮、多酚和蛋白質(zhì)含量較高，而原料組的多糖和黃酮含量較高，表明天然冬蟲夏草不同組分對(duì)IgA分泌細(xì)胞和sIgA含量有一定的增強(qiáng)作用，且不同組分對(duì)兩種細(xì)胞的影響程度各不相同，可能與各組分活性成分組成有關(guān)。

注：#P<0.05，##P<0.01表示與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01表示與模型組相比。

2.4 天然冬蟲夏草不同組分對(duì)小鼠小腸細(xì)胞因子的影響

根據(jù)分化條件的不同，CD4+ T細(xì)胞可分為Th1、Th2、Th17和Treg 4種類型[22]。其中，Th17細(xì)胞是一種新定義的能夠分泌IL-17、IL-21等的細(xì)胞亞群[23]，可介導(dǎo)宿主防御反應(yīng)及組織免疫反應(yīng)，對(duì)免疫性疾病具有重要調(diào)節(jié)作用[24]。另一方面，Treg細(xì)胞主要分泌TGF-β、IL-10等抗炎因子，可抑制過度的炎癥反應(yīng)。如圖3所示(具體數(shù)值見附表S2)，與正常組相比，模型組的IL-17和TGF-β3含量均有顯著下降(P<0.05)。與模型組相比，除NCS和WE組外，其他各組分均能明顯提高IL-17的含量，其中EE、NCSP和NCSP-50組效果最為顯著；除NCS和WE-S外，其它各組分的TGF-β3含量也有明顯提升。以上結(jié)果說明天然冬蟲夏草不同組分能在一定程度上提高Cy造成的Th17和Treg型細(xì)胞因子的減少，從而調(diào)節(jié)腸道免疫，維護(hù)腸道健康。

注：#P<0.05，##P<0.01表示與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01表示與模型組相比。

2.5 天然冬蟲夏草不同組分對(duì)小鼠小腸轉(zhuǎn)錄因子的影響

RORγt是Th17細(xì)胞的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控Th17細(xì)胞及其分泌的相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)[25]，F(xiàn)oxp3是Treg細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子，可控制Treg細(xì)胞的分泌[26]，RORγt/Foxp3平衡可確定初始T細(xì)胞受抗原刺激后的分化方向[27]，對(duì)維持自身免疫穩(wěn)態(tài)具有重要意義。如圖4所示(具體數(shù)值見附表S3)，給與Cy后RORγt 的mRNA表達(dá)顯著增高，F(xiàn)oxp3顯著降低(P<0.01)。給藥后，除NCS和REE組，其他各組分的RORγt均有明顯降低，而只有EE和NCSP組對(duì)Foxp3的表達(dá)有顯著提高；同時(shí)除NCS和REE組外，其它各組均能調(diào)節(jié)RORγt與Foxp3的比值，使RORγt/Foxp3趨于正常。以上結(jié)果表明天然冬蟲夏草不同組分可以調(diào)整RORγt及Foxp3平衡進(jìn)而調(diào)節(jié)腸道免疫。

注：#P<0.05，##P<0.01表示與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01表示與模型組相比。

3 結(jié)論

天然冬蟲夏草不同組分能夠調(diào)節(jié)免疫器官指數(shù)，并且能夠修復(fù)小腸緊密連接蛋白表達(dá)，提高IgA分泌細(xì)胞數(shù)量及sIgA含量，調(diào)節(jié)Th17和Treg相關(guān)細(xì)胞因子及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子來發(fā)揮腸道免疫，緩解腸道損傷。從總體來看，提取物效果要優(yōu)于原料，不同提取物中，乙醇提取物(EE,WE-S)和多糖組(NCSP,NCSP-50)對(duì)Th17和Treg相關(guān)細(xì)胞因子及轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)作用效果相對(duì)優(yōu)于其它組分，此外EE和WE-S對(duì)免疫器官指數(shù)，sIgA含量也有較好的調(diào)節(jié)作用。結(jié)合前期研究結(jié)果，與其他組相比，NCSP和NCSP-50糖含量較高(53.05 g/100 g、79.41 g/100 g)，WE-S中蛋白質(zhì)和總酚含量最高(7.95 g/100 g、19.93 mg/g)，EE和WE-S中黃酮類化合物含量較高(18.64、16.82 mg/g)，推測(cè)提取過程有利于活性成分的積累，而活性成分的單獨(dú)或相互作用可能對(duì)不同組分發(fā)揮作用機(jī)制的影響也各不相同。實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果可為未來深度解析冬蟲夏草藥效關(guān)系提供數(shù)據(jù)支撐。