王繼雯 李磊 劉瑩瑩 甄靜 岳丹丹 李冠杰 慕琦 楊金星 陳國參

摘要 采用盆栽試驗探討了不同劑量棘孢木霉SFC-3菌劑對小麥生理生化指標及生防效果的影響。結(jié)果表明：施用SFC-3菌劑對小麥的株高和主根長度沒有明顯影響（P>0.05），但可提高小麥的出芽率，當施菌劑量為1.0～2.0 g/kg時小麥的出芽率顯著高于對照（P<0.05）;施用SFC-3菌劑小麥葉片中葉綠素含量和可溶性蛋白含量與對照相比均顯著增加（P<0.05），其中施菌劑量為1.0 g/kg時最高。而小麥葉片中的MDA含量在施菌劑量為1.0 g/kg時顯著低于對照和其他施菌處理（P<0.05）;當施菌劑量為0.5～1.0 g/kg時，小麥葉片中SOD和POD活性顯著高于對照，進一步增加施菌劑量，小麥葉片中SOD和POD活性均隨之顯著降低（P<0.05）。當施菌劑量為1.5 g/kg和2.0 g/kg時每克根中小麥孢囊線蟲2齡幼蟲數(shù)量最少，發(fā)病級別最低，其相對防效分別為88.68%和87.04%，其次為施菌劑量1.0 g/kg的處理，其相對防效為80.50%。施用不同劑量的棘孢木霉SFC-3菌劑對小麥生理生化指標均有不同程度的影響，并且當施菌劑量為1.0 g/kg時對小麥生長和孢囊線蟲的防治效果最好。

關(guān)鍵詞 棘孢木霉; 小麥; 生理生化特性; 孢囊線蟲; 生防效果

中圖分類號： S 512.1

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020324

Effects of Trichoderma asperellum? SFC-3 agent on wheat physiological and biochemical characteristics and wheat cyst nematode

WANG Jiwen1，2， LI Lei1，2， LIU Yingying1， ZHEN Jing1，2， YUE Dandan1，2，LI Guanjie1，2， MU Qi1*， YANG Jinxing1， CHEN? Guocan1，2*

（1. Institute of Biology Co.Ltd.， Henan Academy of Sciences， Zhengzhou 450008， China;

2. Key Laboratory of Microbial Engineering of Henan Province， Zhengzhou 450008， China）

Abstract

Pot experiments were conducted to explore the effect of different dosages of Trichoderma asperellum SFC-3 on wheat physiological and biochemical indicators and biocontrol effects. The results show that the application of SFC-3 showed no effect on the plant height and main root length of wheat （P>0.05）， but increased the germination rate. The treatment with 1.0-2.0 g/kg of SFC-3 showed significantly higher germination rates than the control （P<0.05）. The content of chlorophyll and soluble protein in wheat leaves increased significantly in all treatments compared with that of the control （P<0.05）. When treated with 1.0 g/kg of SFC-3， the wheat showed the highest content of chlorophyll and soluble protein but the lowest MDA content in the leaves （P<005）. When treated with 0.5-1.0 g/kg of SFC-3， the SOD and POD activities in wheat leaves were higher than those of the control， but decreased significantly with the increase of the dose （P<0.05）. Compared with other treatments， the number of second-instar larvae of wheat cyst nematode per gram of roots and the disease index was the lowest at the dosage of 1.5 g/kg and 2.0 g/kg， with the relative control efficacy of 88.68% and 87.04%， respectively， followed by the treatment of 1.0 g/kg with the relative control efficacy of 80.50%. These results indicate that the application of different doses of T.asperellum SFC-3 has different effects on the physiological and biochemical indexes of wheat， and the control effect on wheat growth and cyst nematodes is best at the dosage of 10 g/kg.

Key words

Trichoderma asperellum; wheat; physiological and biochemical characteristics; cyst nematode; biocontrol efficacy

小麥作為我國主要的糧食作物之一，當前主要通過各種生物學方法來改善其生理生化指標從而提高產(chǎn)量[1]。但是長期以來，植物病蟲害一直是制約小麥生產(chǎn)的嚴重問題之一。我國為提高小麥等農(nóng)作物的單位面積產(chǎn)量，過度依賴化肥和農(nóng)藥，不僅造成了土壤肥力下降，而且對生態(tài)環(huán)境造成了嚴重的破壞，成為制約我國農(nóng)業(yè)環(huán)保、可持續(xù)發(fā)展的瓶頸。因此，研發(fā)高效的生防菌劑對于改良土壤結(jié)構(gòu)，提高小麥產(chǎn)量，防治病蟲害有重要意義。近年來，國內(nèi)外開始著力研究節(jié)能環(huán)保、無污染、可持續(xù)的新型生物肥料。新型生物肥料主要有生物菌劑和生物有機肥[2]。研究證實，廣泛存在于土壤中的木霉，不僅在防治植物病害中具有重要作用，而且也具有良好的促進植物生長的效果[3]。木霉對番茄[4]、豇豆[5]、小麥[6]、黃瓜[7]等植物上的病害均具有良好的防治效果。李世貴[8]在田間施用木霉菌劑，其對黃瓜枯萎病的防治效果為51.79%，大幅提高了黃瓜的抗病能力。姚彥坡[9]證明哈茨木霉能有效降低馬鈴薯和辣椒的死苗率和病情指數(shù)，對馬鈴薯晚疫病和辣椒疫病防治效果明顯，并且能明顯降低土壤中病菌的種群數(shù)量。Zhang等[10]發(fā)現(xiàn)，長枝木霉Trichoderma longibrachiatum 對小麥孢囊線蟲Heterodera avenae的寄生作用很強，并且其分泌的幾丁質(zhì)酶能夠降解孢囊。除了木霉，其他真菌對小麥孢囊線蟲也有抑制作用。Kerry等[11]發(fā)現(xiàn)，厚垣輪枝菌Verticillium chalamydosporium能使病田中孢囊數(shù)量減少40%以上。Stein等[12]從土樣中分離出的腐霉菌Pythium和鐮刀菌Fusarium可以使大田中孢囊減退率達98%。

因此，真菌對于發(fā)展綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要作用[13-14]。目前，關(guān)于棘孢木霉Trichoderma asperellum 作為生物肥料對小麥生理生化指標的影響以及對小麥孢囊線蟲的防效研究鮮有報道。本試驗擬通過探討棘孢木霉菌劑對小麥的生理生化指標的影響及生防效果，確定棘孢木霉菌劑的最佳施用量，為提高小麥產(chǎn)量及小麥孢囊線蟲的防治提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用小麥品種為‘鄭麥9405，購于河南省農(nóng)業(yè)科學院種子公司。試驗土壤采于汝南縣綠優(yōu)家庭農(nóng)場小麥孢囊線蟲發(fā)生嚴重的地塊。棘孢木霉SFC-3菌劑由河南省微生物工程重點實驗室提供，該菌劑為粉狀，其有效活菌數(shù)≥5億/g，有機質(zhì)≥20%，水分≤30%，塑料花盆（直徑25 cm，高20 cm）購于鄭州市陳寨花卉市場。

1.2 溶液的配制

10%三氯乙酸（TCA）溶液：10 g TCA溶于50 mL蒸餾水中，攪拌均勻定容至100 mL。20 mg/mL L-甲硫氨酸溶液：2 g L-甲硫氨酸加磷酸緩沖液（pH 70）溶解并定容至100 mL，搖勻。0.1 mg/mL核黃素溶液：100 mg核黃素溶于少量1 mol/L的NaOH，然后加蒸餾水溶解并定容至1 000 mL，搖勻。1 mg/mL 氮藍四唑（NBT）溶液：100 mg NBT加磷酸緩沖液（pH 7.0）溶解并定容至100 mL，搖勻。

1.3 試驗方法

小麥盆栽試驗每盆裝4 kg土壤，試驗共設(shè)5個處理，每處理設(shè)4個重復(fù)。處理1：不施菌劑的空白對照;處理2：每盆施SFC-3菌劑2 g（相當于0.5 g/kg）;處理3：每盆施SFC-3菌劑4 g （相當于1.0 g/kg）;處理4：每盆施SFC-3菌劑6 g（相當于1.5 g/kg）;處理5：每盆施SFC-3菌劑8 g（相當于2.0 g/kg）。

施菌后按50粒/盆播種小麥，自然光照，室溫培養(yǎng)20 d，試驗結(jié)束后，將小麥整株從盆中移出，洗凈晾干后4℃保存?zhèn)溆?同時從每盆中隨機均勻地取一部分土樣，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標

1.4.1 小麥生長指標測定

分別統(tǒng)計各處理小麥的發(fā)芽數(shù)量，計算發(fā)芽率。發(fā)芽率=（發(fā)芽種子數(shù)/供檢測種子數(shù)）×100%;同時從每個處理樣品中隨機抽取10株小麥，分別測量和統(tǒng)計株高和主根長度。

1.4.2 小麥葉片生理指標測定

1.4.2.1 小麥葉片中葉綠素含量測定

分別取一定量的各處理新鮮小麥葉片，洗凈，晾干，剪碎，去中脈，混勻后稱0.1 g，充分研磨勻漿后加入5 mL 95%乙醇，繼續(xù)研磨直到組織發(fā)白[15-16]。過濾，用95%乙醇沖洗多次，定容至25 mL容量瓶中，搖勻，分別在663 nm和645 nm處測定吸光度。分別計算葉綠素a，葉綠素b，葉綠素a+b的含量和葉綠素含量。Ca=12.7×OD663-2.69×OD645;Cb=22.9×OD645-4.86×OD663;C（a+b）=8.02×OD663+20.20×OD645;葉綠素含量=[C（a+b）×V]/（M×1 000）。上述公式中Ca、Cb、 C（a+b）分別代表葉綠素a、葉綠素b和葉綠素a+b的含量，V代表提取液體積（mL）;M代表樣品鮮重（g）。

1.4.2.2 小麥葉片中POD和SOD活性及可溶性蛋白、MDA含量的測定

各處理小麥葉片中過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測定分別采用愈創(chuàng)木酚法和氮藍四唑（NBT）光化還原法;小麥葉片中可溶性蛋白含量和丙二醛（MDA）含量分別用考馬斯亮藍法和硫代巴比妥酸法檢測[17-19]。

1.4.3 小麥根部孢囊線蟲侵染情況統(tǒng)計

從每個處理樣品中隨機選取10 株小麥完整的根系，洗凈、晾干后分別稱其鮮重，然后用次氯酸鈉-酸性品紅染色，在顯微鏡下觀察并統(tǒng)計根內(nèi)2齡幼蟲數(shù)量，并按下面的公式分別計算出每克鮮根重中2齡幼蟲數(shù)量、病情指數(shù)和防效。同時分別按表1標準對各處理進行病情分級。

每克鮮根重2 齡幼蟲數(shù)量（NP）=2 齡幼蟲數(shù)/鮮根重;

病情指數(shù)=∑（各級病株數(shù)×相應(yīng)病級數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×最高病級值）×100;

防效=（對照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%。

1.5 統(tǒng)計分析

采用DPS 7.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 棘孢木霉菌劑對小麥株高和主根長度及出芽率的影響

由表2可知，施用不同劑量的棘孢木霉菌劑對小麥的株高和主根長度沒有明顯影響（P>0.05），但對出芽率有一定的促進作用，施菌劑量為1.0 g/kg的處理出芽率最高，并且施菌劑量1.0～2.0 g/kg的各處理與不施菌的對照相比，小麥的出芽率顯著增加（P<0.05）。

2.2 棘孢木霉菌劑對小麥葉片中葉綠素含量的影響

由圖1可以看出，施用棘孢木霉菌劑的處理小麥葉片的葉綠素含量顯著高于對照（不施用棘孢木霉菌劑組）（P<0.05），當施菌劑量在1.0 g/kg時，小麥葉片中葉綠素含量最高，極顯著高于對照（P<0.01）;然而隨著施菌劑量的增加，小麥葉片中葉綠素含量反而有所降低。

2.3 棘孢木霉菌劑對小麥葉片中丙二醛（MDA）含量的影響

由圖2可以看出，當施菌劑量為1.0 g/kg時，小麥葉片中MDA含量顯著低于對照和其余處理（P<0.05），此時抑制作用最為顯著。當施菌劑量為0～1.0 g/kg時，隨著施菌劑量增加小麥葉片中MDA含量也隨之減少，當施菌劑量為1.0～2.0 g/kg時，隨著施菌劑量增加小麥葉片中MDA含量也隨之增高，其中施菌劑量為2.0 g/kg時小麥葉片中MDA含量與對照相比差異不顯著（P>0.05）。結(jié)果表明，與對照相比施菌劑量在0.5～1.5 g/kg時能極顯著降低小麥葉片中的MDA含量（P<0.01）。

2.4 棘孢木霉菌劑對小麥葉片中超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響

由圖3可以看出，與對照相比，施用0.5 g/kg棘孢木霉菌劑對小麥葉片中SOD活性的促進作用最顯著（P<0.05）。施用劑量為0.5 g/kg和1.0 g/kg時小麥葉片的SOD活性較高，且兩者差異不顯著（P>0.05）。當劑量大于1.0 g/kg時，隨著施菌劑量增加小麥葉片的SOD活性反而極顯著降低（P<0.01）。

圖3 棘孢木霉菌劑對葉片中超氧化物歧化酶活性的影響

Fig.3 Effect of Trichoderma asperellum agent on

SOD activity in wheat leaves

2.5 棘孢木霉菌劑對小麥葉片中過氧化物酶（POD）活性的影響

由圖4可以看出，施用0.5 g/kg棘孢木霉菌劑時小麥葉片中POD活性最高，極顯著高于對照（P<0.01）;施用劑量為0.5 g/kg和1.0 g/kg的兩個處理小麥葉片POD活性差異不顯著（P>0.05），但進一步增加劑量，小麥葉片中POD活性顯著減?。≒<0.05），施菌劑量為2.0 g/kg的處理葉片POD活性極顯著低于其余處理組（P<0.01）。

2.6 棘孢木霉菌劑對小麥葉片中可溶性蛋白含量的影響

由圖5可以看出，與對照相比，施用棘孢木霉菌劑后小麥葉片中可溶性蛋白含量均極顯著增加（P<0.01）。當施菌劑量為1.0 g/kg時，小麥葉片中可溶性蛋白含量最高;1.5 g/kg和2.0 g/kg處理可溶性蛋白含量差異不顯著（P>0.05）。

2.7 棘孢木霉菌劑對小麥孢囊線蟲的防治效果

從表3可知，與不施菌對照相比，隨著施菌劑量增加，小麥每克根中2齡幼蟲數(shù)量隨之減少，其中，施菌劑量為1.5 g/kg時，每克根中2齡幼蟲數(shù)量最少，病情指數(shù)最低，其防效最高，達88.68%，當施菌劑量大于等于1.0 g/kg時，其防效可達到80%以上，施菌劑量2.0 g/kg的防效為8704%，極顯著高于05 g/kg和1.0 g/kg（P<001），與1.5 g/kg差異不顯著（P>0.05）。

3 結(jié)論與討論

宋玉娟[20]研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉T-6的孢子懸浮液不僅能夠增加煙草體內(nèi)葉綠素和類胡蘿卜素的含量，提高煙草的根系活力，促進煙草生長;還能夠誘導煙草體內(nèi)POD、SOD、CAT 3種防御酶的活性，有效地防治煙草根部病害黑脛病和根黑腐病，但是對煙草葉部病害赤星病的防治效果不明顯。對比本試驗，當土壤中施用1.0 g/kg棘孢木霉菌劑時，小麥葉片中的葉綠素含量最高;并且能極顯著提高小麥葉片中SOD和POD酶活。這兩種酶對于清除植物體內(nèi)活性氧，減少植物在逆境中所受的傷害具有重要作用[21]。張春龍等[22]進行了淡紫擬青霉顆粒菌劑防治小麥禾谷孢囊線蟲的田間試驗，結(jié)果表明，100 kg/hm2顆粒菌劑處理的防效最好，在小麥苗期和小麥生長后期（抽穗至揚花期）的防效分別為5725%和40.22%。對比本試驗：隨著施菌劑量的增加，小麥每克根中2齡幼蟲數(shù)量也隨之減少，當施菌劑量大于或等于1.0 g/kg時，其防效達到80%以上，尤其是當施菌劑量為1.5 g/kg時，每克根中2齡幼蟲數(shù)量最少，病情指數(shù)最低，防效最高，達8868%，生防效果明顯優(yōu)于張春龍的試驗結(jié)果，這可能是因為本試驗是盆栽試驗而非大田試驗，受外界環(huán)境影響較小，若要應(yīng)用于生產(chǎn)還需進一步進行大田試驗。棘孢木霉SFC-3對小麥孢囊線蟲的防治主要依靠其生長過程中分泌的幾丁質(zhì)酶，這種酶可以有效降解孢囊，這與Zhang等[10]分離的長枝木霉的作用機理相同。

在小麥生長過程中葉綠素含量增高意味著植物的凈光合速率、實際光化學效率增高，這有利于作物干物質(zhì)的積累從而增加小麥的穗長和穗粒數(shù)[23];MDA是膜脂過氧化的產(chǎn)物，MDA的積累會損傷小麥膜系統(tǒng)，加速植物的衰老[24-25]，而SOD、POD等酶類則可以減少MDA的積累維持小麥中活性氧的平衡[26];可溶性蛋白和可溶性糖能夠調(diào)節(jié)細胞滲透壓，對小麥的生長、發(fā)育有重要作用[27-28]。本研究結(jié)果表明，施加棘孢木霉菌劑可以有效提高小麥葉片中葉綠素、可溶性蛋白含量、SOD和POD的活性，并能顯著降低MDA含量，同時對小麥孢囊線蟲病有較好的防效。該研究結(jié)果證明了棘孢木霉菌劑在防病促生方面有較高潛力，為提高小麥產(chǎn)量、開發(fā)新型生物肥料提供了理論依據(jù)。

參考文獻

[1] 王春枝， 郭世乾， 劉鳳芹， 等. 追肥運籌對不同品種春小麥蛋白質(zhì)含量及組分的影響[J]. 華北農(nóng)學報， 2008， 23（S1）： 204-207.

[2] 張陽， 劉重喜， 王相晶， 等. 微生物代謝產(chǎn)物在植物病害防治中的應(yīng)用[J]. 世界農(nóng)藥， 2013（3）： 46-52.

[3] 袁揚， 王胤晨， 韓玉竹， 等. 木霉菌在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用研究進展[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學， 2018， 46（3）： 10-14.

[4] 康萍芝， 張麗榮， 沈瑞清， 等. 哈茨木霉制劑對設(shè)施連作番茄根際土壤微生物的生態(tài)效應(yīng)及防病作用[J]. 農(nóng)藥， 2013， 52（2）： 128-131.

[5] 魏林. 哈茨木霉（Trichoderma harzianum）發(fā)酵液中對豇豆具促生活性物質(zhì)的研究[D]. 長沙： 湖南農(nóng)業(yè)大學， 2005.

[6] 陸寧海， 徐瑞富， 房振宏， 等. 哈茨木霉對小麥和玉米幼苗生長的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報， 2005， 21（3）： 238-240.

[7] 王建鋒， 吳利民， 陸寧海， 等. 木霉發(fā)酵產(chǎn)物對黃瓜種子活力及幼苗生長的影響[J]. 陜西農(nóng)業(yè)科學， 2008（3）： 37-38.

[8] 李世貴. 防治黃瓜枯萎、青椒疫病木霉菌的研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)科學院， 2005.

[9] 姚彥坡. 防治馬鈴薯晚疫病和辣椒疫病木霉菌的篩選及生防機制研究[D]. 北京： 中國農(nóng)業(yè)大學， 2015.

[10]ZHANG Shuwu， XUE Yingyu， GAN Yantai. et al. The parasitic and lethal effects of Trichoderma longibrachiatum against Heterodera avenae [J]. Biological Control， 2014， 72： 1-8.

[11]KERRY B R， CRUMP D H， MULLEN L A. Natural control of the cereal cyst nematode， Heterodera avenae Woll. by soil fungi at three sites [J]. Crop Protection， 1982， 1（1）： 99-109.

[12]STEIN B， GRABERT D. Isolation of fungi from cysts and eggs of Heterodera avenae Wollenweber， 1924 and tests of their pathogenicity to the nematode [J]. Nematologica， 1992， 38（1）： 375-384.

[13]DEMIRAL T， TRKAN I。. Comparative lipid peroxidation， antioxidant defense systems and proline content in roots of two rice cultivars differing in salt tolerance [J]. Environmental and Experimental Botany， 2005， 53（3）： 247-257.

[14]袁揚， 王胤晨， 曾兵， 等. 5株木霉菌株對鴨茅生長及營養(yǎng)品質(zhì)的影響[J]. 草業(yè)科學， 2018， 35（2）： 391-397.

[15]崔勤， 李新麗， 翟淑芝. 小麥葉片葉綠素含量測定的分光光度計法[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2006， 34（10）： 2063.

[16]薛香， 吳玉娥. 小麥葉片葉綠素含量測定及其與SPAD值的關(guān)系[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學， 2010， 49（11）： 2701-2702.

[17]王學奎. 植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M]. 北京： 高等教育出版社， 2006： 172-173.

[18]陳均輝， 陶力， 李俊， 等. 生物化學實驗指導[M]. 北京： 科學出版社， 2003.

[19]侯福林. 植物生理學實驗教程[M]. 北京： 科學出版社， 2005.

[20]宋玉娟. 棘孢木霉T-6對煙草的促生抗病作用[D]. 泰安： 山東農(nóng)業(yè)大學， 2019.

[21]楊小勇. 重金屬脅迫對水稻傷害機理及水稻耐性機制的研究[D]. 揚州： 揚州大學， 2002.

[22]張春龍， 肖炎農(nóng)， 向妮， 等. 淡紫擬青霉防治小麥禾谷孢囊線蟲病研究[J]. 植物保護， 2014， 40（4）： 181-184.

[23]董寶婧， 黃蓉， 苗芳， 等. 小麥葉片逆向衰老過程中葉綠素含量及光合特性的變化[J]. 西北農(nóng)林科技大學學報（自然科學版）， 2013， 41（6）： 44-48.

[24]伍澤堂， 楊大旗. 丙二醛對衰老葉片質(zhì)膜破壞的影響[J]. 植物生理學通訊， 1990（4）： 48.

[25]楊婷. 膜脂過氧化對植物細胞的傷害[J]. 科技與創(chuàng)新， 2018（8）： 61-62.

[26]曹傳莉， 仲延龍， 宋賀， 等. 耕作方式對小麥抗氧化酶和產(chǎn)量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學學報， 2019， 46（5）： 883-887.

[27]趙江濤， 李曉峰， 李航， 等. 可溶性糖在高等植物代謝調(diào)節(jié)中的生理作用[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學， 2006（24）： 6423-6425.

[28]鄭金鳳， 白志英， 李存東， 等. 低磷脅迫對小麥代換系可溶性糖和可溶性蛋白含量的影響及染色體效應(yīng)[J]. 華北農(nóng)學報， 2013， 28（1）： 27-31.

（責任編輯：楊明麗）