段一凡，李 嵐，楊欣欣，王賢榮，張 敏，張 成，柴子涵

(1.南京林業(yè)大學(xué)生物與環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.國際木犀屬植物栽培品種登錄中心，南京林業(yè)大學(xué)，江蘇 南京 210037)

桂花(Osmanthusfragrans)屬木犀科(Oleaceae)木犀屬(Osmanthus)，在我國已有2 500多年的栽培歷史，為我國十大傳統(tǒng)名花之一。木犀屬全世界約35種，中國有24種，是該屬植物的現(xiàn)代分布中心[1-2]。本犀屬植物的花多具芳香性，觀賞價值極高。目前桂花及其近緣種齒葉木犀(O.×fortunei)、柊樹(O.heterophyllus)、華東木犀(O.cooperi)在分類處理上仍存在較多爭議：其中四季桂先后被作為變種、類、組或一個品種而記載，陸瑞林[3]和季春峰[4]指出四季桂的特征，與Loureiro[5]在原始描述中的特征一致，因此支持四季桂是桂花的原變種的處理；胡紹慶等[6]則認(rèn)為四季桂是新變種，定名為Osmanthusfragransvar.subpaniculatusS. Q. Hu。郭世權(quán)[7]在木犀屬分子系統(tǒng)學(xué)研究中，將華東木犀和桂花的幾個品種歸聚為一類，并且得到很高的支持，說明華東木犀的分類學(xué)位置還有待探究。齒葉木犀被認(rèn)為是桂花和柊樹的雜交種[3]，由于缺乏證據(jù)支持，《Flora of China》沒有處理，它們之間的關(guān)系還不清楚[8]。對于上述問題，前人多從形態(tài)學(xué)和微解剖學(xué)方面提供證據(jù)[9-12]，但在染色體倍性及基因組大小方面還鮮有報道[13-14]。

流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry，F(xiàn)CM)在植物學(xué)研究中主要用于檢測植物倍性水平及基因組大小[15]。基因組大小亦稱C值，指一個染色體組DNA含量[16]。近緣物種的C值相似程度很高，基因組大小的獲取對于構(gòu)建物種系統(tǒng)進(jìn)化樹、鑒定雜交種、分析種間親緣關(guān)系有著重要的意義[17]。

本研究以水稻品種‘日本晴’(Oryzasativa‘Nipponbare’)為參照樣品，用流式細(xì)胞術(shù)對桂花代表品種及其近緣種的倍性和基因組大小進(jìn)行測定分析，旨在從細(xì)胞學(xué)領(lǐng)域?yàn)楣鸹ǚ诸愄峁┳C據(jù)，為今后開展木犀屬植物的基因組測序、物種分類以及種群進(jìn)化研究提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

所用材料及采集地點(diǎn)見表1，其中憑證標(biāo)本存放于南京林業(yè)大學(xué)標(biāo)本館(館代碼：NF)。以相關(guān)材料剛萌發(fā)的新生嫩葉為實(shí)驗(yàn)材料。參照樣品為水稻品種‘日本晴’(Oryzasativa‘Nipponbare’)，由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

表1 材料來源Table 1 Source of plant material used in the study

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞核懸浮液的制備

采集剛萌發(fā)的新生嫩葉，裝入自封袋放置冰盒保存。用蒸餾水清洗2～3次，再用濾紙吸干葉片上的水分。滴入0.5 mL預(yù)冷的裂解液于塑料培養(yǎng)皿中，之后剪取葉片(去除中脈和葉緣鋸齒)約1 g，分別放入培養(yǎng)皿中，再加入預(yù)冷的裂解液0.5 mL，然后用鋒利的刀片垂直快速地將葉片切碎，使其與裂解液充分接觸。使用1 mL移液槍吸取塑料培養(yǎng)皿內(nèi)的溶液，用孔徑37 μm(400目)尼龍網(wǎng)過濾，將獲得的濾液裝入1.5 mL離心管中，用錫紙避光處理，再在4 ℃下轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心15 min。棄上清后，加入500 μL預(yù)冷的PI(碘化丙啶)和RNA酶進(jìn)行染色，參照田新民等[18]配方，然后置于4 ℃ 冰箱避光染色10 min左右。

1.2.2 細(xì)胞裂解液的選擇

流式細(xì)胞術(shù)中，細(xì)胞裂解液的作用是使細(xì)胞中游離出完整的細(xì)胞核，其選擇至關(guān)重要，合適的裂解液能使樣品的分析更加準(zhǔn)確可靠。參照前人經(jīng)驗(yàn)選擇Chopping、Galbraith’s、Tris·MgCl2、LB01、GPB和WPB 6種裂解液分別對桂花及其近緣種進(jìn)行檢測[18-20]。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測

采用BD Influx 流式細(xì)胞儀對制備的樣品細(xì)胞核懸浮液進(jìn)行測定，通過488 nm藍(lán)光激發(fā)，每個樣品重復(fù)3次并且每次檢測至少收集10 000個細(xì)胞。變異系數(shù)CV值控制在5%之內(nèi)，測定所得的圖像由流式細(xì)胞儀自帶的軟件(BD FACS sortware 1.0.0.650 軟件)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。通過下列公式計算基因組大小(C值)：

待測樣本基因組大小=參照樣本基因組大小×(待測樣本G0或G1峰熒光均值/參照樣本G0或G1峰熒光均值)

標(biāo)準(zhǔn)物的選取包括內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)。本研究采用外標(biāo)法，以已知二倍體的柊樹(2n=46)[13]作為參照樣本，先上機(jī)對其進(jìn)行檢測，隨后調(diào)整流式細(xì)胞儀閾值，依次檢測14個桂花品種及其近緣種(表1)的倍性。選用已知基因組大小的水稻品種‘日本晴’(420 Mb)[21]為內(nèi)標(biāo)，分別對水稻與待測樣本的混合樣品進(jìn)行上機(jī)檢測，比較水稻與待測樣本DNA峰值的熒光均值比值關(guān)系，計算桂花品種及其近緣種的基因組大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 桂花及其近緣種倍性分析

根據(jù)流式細(xì)胞儀測定圖像，已知二倍體的柊樹和其他被檢測的樣本主峰都位于相對熒光強(qiáng)度值=10附近，故分析待測樣本在誤差范圍內(nèi)均為二倍體。這與Taylor[13]1945年發(fā)表的結(jié)果一致。部分樣品檢測結(jié)果見圖1，其中橫坐標(biāo)為DNA相對熒光強(qiáng)度，縱坐標(biāo)為細(xì)胞數(shù)量。

圖1 部分樣本的流式檢測結(jié)果Fig.1 The results of partial samples using flow cytometry

2.2 桂花及其近緣種基因組大小測定

各桂花品種及其近緣種與水稻混合樣品上機(jī)檢測的部分結(jié)果見圖2，參照水稻的峰值，計算14個桂花品種及其3個近緣種基因組大小，結(jié)果見表2，所選桂花品種及其近緣種基因組大小存在一定差異。桂花的基因組大小的平均值為755.24 Mb。華東木犀的基因組最大，為817.19 Mb，其次為柊樹(769.50 Mb)和齒葉木犀(729.11 Mb)。齒葉木犀和桂花、柊樹都為700 Mb左右，支持齒葉木犀為桂花和柊樹的雜交種的觀點(diǎn)。華東木犀的基因組大小(817.19 Mb)與桂花品種‘雄黃’(801.15 Mb)、‘金球’(808.57 Mb)和‘云田彩’(832.79 Mb)比較接近，初步表明它們之間具有較為親密的關(guān)系。桂花品種群中四季桂品種群的基因組大小為777.24 Mb，金桂品種群為760.85 Mb，銀桂品種群為739.06 Mb，丹桂品種群為717.29 Mb，彩葉桂品種群為781.76 Mb，其中‘四季’最大，達(dá)到903.14 Mb，和其他樣品的差異較大，是否可以推斷四季桂品種群具有更獨(dú)立的分類位置還需進(jìn)一步研究的支持。

P3.水稻‘日本晴’(Oryza sativa ‘Nipponbare’);P4.樣品材料sample。圖2 混合樣本的流式檢測結(jié)果Fig.2 The results of mixed samples using flow cytometry

表2 木犀屬待測樣品與水稻樣品的流式細(xì)胞儀結(jié)果Table 2 Test results of Osmanthus and Oryza sativa species using flow cytometry

2.3 木犀科植物的C值

在該研究中，木犀屬(Osmanthus)C值平均值為0.77 pg。在植物C值數(shù)據(jù)庫中對木犀科進(jìn)行檢索，共16條數(shù)據(jù)，主要有梣屬(Fraxinus)、丁香屬(Syringa)、夜花屬(Nyctanthes)、素馨屬(Jasminum)、女貞屬(Ligustrum)和木犀欖屬(Olea)[22]。統(tǒng)計分析表明，C值平均值小于1的為木犀屬(0.77 pg)和梣屬(0.93 pg)，大于1的為夜花屬(1.23 pg)、丁香屬(1.25 pg)、素馨屬(1.44 pg)、女貞屬(1.57 pg)和木犀欖屬(1.95 pg)，這7個屬呈遞增的趨勢，其中木犀屬的平均值最小，顯著低于其他屬。Leitch等[23]研究表明，陸生植物基因組大小的進(jìn)化趨勢是增大，越古老的植物基因組越小。木犀科植物基因組大小是否也遵循這一規(guī)律還需進(jìn)一步研究。此次研究中17個木犀屬植物的C值為首次測定結(jié)果，在增加植物C值數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)的同時，對了解木犀屬植物C值特征具有重要的意義。

3 討 論

此次實(shí)驗(yàn)選擇的6種不同裂解液提取的懸浮液經(jīng)上機(jī)檢測后，WPB和LB01的效果較好，碎片峰與樣本峰可以明顯地區(qū)分開來，CV值低于7%，說明細(xì)胞核完整性較好，變異系數(shù)低，保證了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。

植物內(nèi)標(biāo)可以將熒光抑制因子的效果最小化，減小實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的技術(shù)誤差。因此，一般采用植物內(nèi)標(biāo)來測定植物的基因組大小。標(biāo)準(zhǔn)植物的選擇應(yīng)該具備以下3個條件：①標(biāo)準(zhǔn)植物的基因組大小已知且穩(wěn)定，和待測樣品的染色體結(jié)構(gòu)相似；②標(biāo)準(zhǔn)樣品峰不能同待測樣品峰重疊；③標(biāo)準(zhǔn)植物要易于培養(yǎng)，能獲取大量樣品。

選擇合適的內(nèi)標(biāo)植物是保證流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確分析基因組大小的前提。該實(shí)驗(yàn)在前期曾嘗試培養(yǎng)番茄作為內(nèi)標(biāo)，但在其與待測樣品混合上機(jī)檢測后，二者的細(xì)胞核不易分開，吸收峰重疊較多，說明番茄不適合作為內(nèi)標(biāo)植物測定桂花及其近緣種的基因組大小。最后，確定水稻品種‘日本晴’為內(nèi)標(biāo)，待測樣品與水稻基因組大小的測定峰并無重疊且區(qū)分度良好，充分保證了用已知基因組大小的水稻品種‘日本晴’作為內(nèi)標(biāo)來測定基因組大小結(jié)果的準(zhǔn)確性。

此次實(shí)驗(yàn)測定結(jié)果表明，所選桂花品種及其近緣種都是二倍體，沒有出現(xiàn)多倍化的現(xiàn)象。之前有研究表明：櫻花(Cerasussp.)[24]、桑樹(Morussp.)[25]及菊花(Chrysanthemunsp.)[26]等在長期自然選擇和人工選擇的作用下形成了豐富的類型，多倍體普遍存在，這可能是因?yàn)樗鼈冏匀浑s交比較容易。另外糧食作物，如小麥(Triticumaeestivum)和水稻(Oryzasativa)[27-28]也都有多倍化現(xiàn)象，此次實(shí)驗(yàn)所選的桂花及其近緣種沒有多倍化，可能是因?yàn)樗x桂花品種和近緣種少，還需進(jìn)一步研究。

前人研究表明：在某些特定的條件下，基因組大小的差異可能與基因的重復(fù)或丟失有關(guān)，另外，緯度、海拔以及氣候之間的差異也都可能造成DNA含量的變異。這種種內(nèi)DNA含量的變化在其他被子植物中也存在，如Bennett[29]檢測了24種被子植物基因組大小，提出植物種內(nèi)DNA含量的變化是普遍存在的。吳麗萍等[30]以毛果楊(Populustrichocarpa)為內(nèi)標(biāo)，測定6種棗屬(Ziziphus)植物基因組大小，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各棗品種的基因組大小存在差異。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，桂花14個代表品種及其近緣種都是二倍體，但基因組大小各不相同，其中‘四季’的基因組大小最大，為903.14 Mb，達(dá)到了屬內(nèi)物種間的水平；實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步表明華東木犀與桂花品種間具有較為緊密的關(guān)系；支持齒葉木犀為桂花和柊樹的雜交種的觀點(diǎn)。這些結(jié)果為桂花及其近緣種分類上的問題提供了一定證據(jù)，進(jìn)而為木犀屬物種分類、基因組學(xué)研究、基因組文庫的建立及全基因組測序提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

致謝南京林業(yè)大學(xué)現(xiàn)代分析測試中心林峰老師在實(shí)驗(yàn)過程中給予幫助與支持；江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院及常州市芳芝林現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)園區(qū)提供實(shí)驗(yàn)材料。