劉廣興，張 洋，朱海龍，尹煥才，唐玉國1, *

（1.中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，安徽合肥230026；2. 中國科學(xué)院蘇州生物醫(yī)學(xué)工程技術(shù)研究所，江蘇 蘇州 215163）

1 引 言

隨著社會的進(jìn)步和科技的不斷發(fā)展，在生命科學(xué)、食品藥品檢測、環(huán)境安全等領(lǐng)域中，都有從大量待測目標(biāo)物中識別出少量/稀有（百萬分之一）目標(biāo)的需求，精準(zhǔn)的檢測結(jié)果是后續(xù)分析的前提。針對稀有細(xì)胞或痕量病原微生物的快速實(shí)時(shí)檢測是最為典型的從大樣本中檢測極少目標(biāo)物的代表，如果可以有效解決該問題將對癌癥的早期診斷治療和預(yù)防提供可靠且便捷的監(jiān)控，也可為其他重大疾病的早期診斷和治療提供有力監(jiān)測手段，此外，還可以為保證食品、藥品、空氣等的質(zhì)量與安全提供有效工具[1]。

目前針對稀有細(xì)胞或痕量病原微生物檢測的方法主要有直接計(jì)數(shù)法、顯微熒光計(jì)數(shù)法和流式細(xì)胞術(shù)等。直接計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)準(zhǔn)確，可靠性高且成本低，常用于細(xì)胞/細(xì)菌檢測，但檢測前需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，以實(shí)現(xiàn)稀有細(xì)胞的增殖，使其達(dá)到可觀測水平，其檢測速度較慢，檢測時(shí)長達(dá)48~72 h，不能滿足一些特定的快速、實(shí)時(shí)的檢測需求[2]。顯微熒光計(jì)數(shù)法主要是篩選目標(biāo)細(xì)胞表面的特異性抗原，并對其進(jìn)行特異性熒光標(biāo)記，然后將其置于熒光顯微鏡下觀測，并手動計(jì)數(shù)。利用此方法進(jìn)行檢測時(shí)，顯微鏡單次觀測區(qū)域較小，要實(shí)現(xiàn)對大量樣本的檢測，需要對目標(biāo)物品進(jìn)行多次不同視野的觀測，導(dǎo)致檢測時(shí)間較長。另外，由于高倍顯微鏡的景深較小，觀測中會存在部分目標(biāo)物離焦的現(xiàn)象，因此需要反復(fù)對焦，增加了人工計(jì)數(shù)的難度[3]。流式細(xì)胞術(shù)需要先對目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理，制作單細(xì)胞懸浮液，然后進(jìn)行具有特異性和化學(xué)定量關(guān)系的熒光染色，懸浮液中的細(xì)胞逐一通過流動室，利用激光作為激發(fā)光源，同時(shí)測定目標(biāo)細(xì)胞所攜帶的熒光種類及相對強(qiáng)度，進(jìn)而用于細(xì)胞分群、功能鑒定等[4]。流式細(xì)胞術(shù)具有速度快，多參數(shù)檢測的優(yōu)點(diǎn)，但其要求被測目標(biāo)物濃度不低于102~103/mL數(shù)量級，檢測限過高，用于稀有細(xì)胞（如CTC細(xì)胞）和痕量微生物檢測時(shí)，其系統(tǒng)誤差過大。綜上所述，以上幾種方法都存在著一定的局限性，因此，研制一種新型的大視場生物成像分析儀，在一定范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)大視場和高分辨率，提高稀有細(xì)胞和痕量病原微生物的檢測速度和精度，具有重要的實(shí)際意義。

對于作為大視場生物成像分析儀的核心顯微物鏡部分，本文以同軸三反成像理論為基礎(chǔ)，采用視場離軸的方式設(shè)計(jì)了一款光譜范圍為350~1 100 nm、放大倍數(shù)β=?1，視場范圍為150 mm×20 mm，相對孔徑大于0.1的用于大視場生物成像分析的離軸三反顯微物鏡，模擬分析了該離軸三反顯微物鏡的成像質(zhì)量，建立了大視場生物成像分析儀系統(tǒng)檢出性能評價(jià)方法，最后使用該系統(tǒng)檢測帶有熒光標(biāo)記的靶細(xì)胞，對大視場生物成像分析儀進(jìn)行性能評價(jià)。

2 光學(xué)結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)參數(shù)

2.1 系統(tǒng)技術(shù)指標(biāo)

樣品前處理需要對7.5 ml全血進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，剩余至少7.5×107個(gè)以上的白細(xì)胞和若干稀有細(xì)胞，白細(xì)胞的直徑一般在10~15μm，若將這些細(xì)胞以單層的形式平鋪在載片上，所需面積大于1.687 5×104mm2，為了不影響觀測質(zhì)量，白細(xì)胞不可能一一密排，以細(xì)胞密度覆蓋率為75%計(jì)算，所需的載片面積應(yīng)大于2.25×104mm2。由于CTCs細(xì)胞直徑略大于白細(xì)胞直徑，極限情況下，為保證清晰度，一個(gè)CTC細(xì)胞需占兩個(gè)像素，因此像元要小于5μm，若要獲得更高的清晰度，以一個(gè)CTC細(xì)胞占3個(gè)像素計(jì)算，所設(shè)計(jì)的離軸三反顯微物鏡的成像分辨率要小于3.5μm。因此，光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)指標(biāo)應(yīng)滿足：成像視場≥150 mm×20 mm；成像分辨率≤3.5μm。

2.2 光學(xué)系統(tǒng)方案

對于如此大物面的物方視場，在設(shè)計(jì)上即可采用反射式系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，也可采用折射式系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。其中反射式系統(tǒng)一般包含同軸反射和離軸反射兩種，可采用離軸三反光學(xué)結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)大視場及高分辨成像[5]，折射式系統(tǒng)可在雙高斯結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進(jìn)行復(fù)雜化，從而實(shí)現(xiàn)大視場成像。由于反射式系統(tǒng)的光譜范圍不受限制，因此，可以選用不同種類的熒光試劑，以用于不同細(xì)胞和痕量微生物檢測，而折射式系統(tǒng)在寬光譜范圍內(nèi)，很難消除二級光譜，從而影響整個(gè)儀器的普遍適用性。同時(shí)反射式系統(tǒng)可以設(shè)計(jì)為對稱共軛系統(tǒng)，可以消除系統(tǒng)的畸變像差，提高成像質(zhì)量，而折射式系統(tǒng)的畸變則受到材料的限制，雖然畸變可以矯正到較小的程度，但不能實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)零畸變?？紤]到系統(tǒng)的光譜范圍和畸變特性，所以本設(shè)計(jì)選擇反射系統(tǒng)作為優(yōu)選方案。

離軸三反射光學(xué)系統(tǒng)根據(jù)光路中是否存在中間像，可分為RUG型和COOK型，RUG型結(jié)構(gòu)的光闌位于主鏡處，離軸時(shí)采用光闌離軸方式，系統(tǒng)中間存在像面。COOK型結(jié)構(gòu)的光闌設(shè)置在次鏡處，離軸時(shí)采用視場離軸方式，系統(tǒng)不存在中間像面。由于COOK型離軸三反系統(tǒng)的光路結(jié)構(gòu)具有一定的對稱性，不但可以設(shè)計(jì)成近遠(yuǎn)心光路，還可以很好地矯正畸變。同時(shí)，由于COOK型結(jié)構(gòu)的對稱性，可以將主三鏡設(shè)計(jì)成完全對稱的結(jié)構(gòu)，從而將三片式離軸三反射系統(tǒng)簡化成兩片式，從而能夠減少裝調(diào)時(shí)的調(diào)整自由度，降低裝調(diào)難度[6-7]。

根據(jù)光學(xué)系統(tǒng)的參數(shù)要求，綜合以上分析，本文最終選擇COOK型離軸三反結(jié)構(gòu)進(jìn)行設(shè)計(jì)。

2.3 光學(xué)系統(tǒng)參數(shù)確定

根據(jù)技術(shù)指標(biāo)要求，檢測載片尺寸要求為150 mm×20 mm，檢測精度需達(dá)到3.5μm時(shí)，此時(shí)需要的單列最大像元總數(shù)為：

由于物面尺寸比較大，在保證放大率的同時(shí)還需控制成像焦面的尺寸，此時(shí)應(yīng)盡量減小探測器像元的尺寸，但探測器像元尺寸太小時(shí)，耐奎斯特頻率會很高，此時(shí)成像質(zhì)量又難以保證，結(jié)合現(xiàn)有探測器技術(shù)水平，選用多片像元尺寸為3.1μm的CHR70MCMOS探測器拼接成像，所以此時(shí)像面尺寸為：

所以此時(shí)系統(tǒng)的放大倍數(shù)為

此CCD奈奎斯特頻率為：

當(dāng)系統(tǒng)需要達(dá)到3.5μm的分辨率時(shí)，根據(jù)瑞利判據(jù)

當(dāng)主波長λ=0.56μm時(shí)，可得

考慮到物鏡前大尺寸位移平臺、濾光片模塊等結(jié)構(gòu)的安裝空間，所以顯微物鏡的物象共軛距離不能太短，但如果顯微物鏡的物象工作距離過長，則會導(dǎo)致主鏡、次鏡和三鏡口徑過大，增加加工、檢測及裝調(diào)的難度。綜合結(jié)構(gòu)上的考慮，令顯微物鏡物象共軛距L=3 000 mm。根據(jù)公式：

f′=750 mm

則顯微物鏡焦距 ，所以光學(xué)系統(tǒng)的指標(biāo)確定為：(1)設(shè)計(jì)波段：350~1 100 nm；(2)線視場：150 mm×20 mm；(3)數(shù)值孔徑：0.1；(4)放大倍率：?1；(5)MTF@162 lp/mm：≥0.3；(6)物象共軛距：3 000 mm；(7)焦距：750 mm。

3 光學(xué)系統(tǒng)設(shè)計(jì)及像質(zhì)分析

離軸三反系統(tǒng)一般是在同軸三反系統(tǒng)設(shè)計(jì)完成后采用孔徑離軸、視場離軸方式進(jìn)行離軸得到的，所以離軸三反系統(tǒng)的設(shè)計(jì)一般以求解同軸三反系統(tǒng)的初始結(jié)構(gòu)為出發(fā)點(diǎn)[8]。圖1為同軸三反系統(tǒng)的一般表示形式。M1、M2、M3分別表示主鏡、次鏡和三鏡，它們的曲率半徑分別為R1、R2和R3，其非球面系數(shù)分別為?e12、?e22、?e32，3個(gè)反射鏡的間距分別為d1、d2，l2、l2′、l3和l3′分別表示次鏡和三鏡的物距和像距，系統(tǒng)的像方焦距為主鏡的焦距為

圖1 同軸三反結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Coaxial three-mirror system

在初始結(jié)構(gòu)求解時(shí)，首先將M2設(shè)置為孔徑光闌，并令此時(shí)本系統(tǒng)將變?yōu)橐粋€(gè)像方遠(yuǎn)心光學(xué)系統(tǒng)。然后，根據(jù)三反系統(tǒng)的平場條件，可推導(dǎo)出平場像方遠(yuǎn)心光學(xué)系統(tǒng)中R1、R2、R3、d1、d2、d3與系統(tǒng)焦距f′及次鏡M2對主鏡M1的遮攔比a1的關(guān)系式。再根據(jù)三級像差理論, 即可推導(dǎo)出平像場遠(yuǎn)心三反系統(tǒng)的三級球差SⅠ、彗差SⅡ和像散SⅢ與?e12、?e22、?e32和a1的關(guān)系式。然后令SⅠ、SⅡ、SⅢ為零，d1=|d2|，即可得到主三鏡共面的同軸三反系統(tǒng)的初始結(jié)構(gòu)[9-12]。

將得到的同軸三反系統(tǒng)的初始結(jié)構(gòu)進(jìn)行離軸優(yōu)化，當(dāng)離軸三反系統(tǒng)具有良好的成像質(zhì)量時(shí)，再將無限遠(yuǎn)共軛系統(tǒng)的工作距慢慢調(diào)整為有限遠(yuǎn)。最終設(shè)計(jì)結(jié)果如表1所示，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖如圖2所示。

表1 光學(xué)系統(tǒng)的設(shè)計(jì)結(jié)構(gòu)參數(shù)Tab.1 Configuration parameters of optical system

圖2 系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 Schematic diagram of designed system

系統(tǒng)優(yōu)化后的各個(gè)視場的調(diào)制傳遞函數(shù)（MTF）曲線如圖3所示，各個(gè)視場的MTF值如表2所示。從圖3和表2可以看出，優(yōu)化后的系統(tǒng)在整個(gè)波段和視場范圍內(nèi)的成像質(zhì)量都接近衍射極限，在Nyquist截止頻率178 lp/mm處的MTF均值為0.357。光學(xué)系統(tǒng)的畸變圖如圖4所示。優(yōu)化后離軸三反光學(xué)系統(tǒng)的畸變在全部視場下都為0%。系統(tǒng)的點(diǎn)列圖如圖5（彩圖見期刊電子版）所示，各個(gè)視場的RMS值如表3所示。從圖4和表3可以看出點(diǎn)列圖RMS直徑均值為3.56μm。圖6為系統(tǒng)組裝完成后的實(shí)際測試圖，采用NBS 1963A分辨率測試板，由圖6可知在144 lp/mm處，仍可分辨黑白條紋，由此可得系統(tǒng)實(shí)際分辨率約為3.5μm。

圖5 系統(tǒng)點(diǎn)列圖Fig.5 Systerm spot diagram

圖6 分辨率測試圖Fig.6 Resolution test

表 3系統(tǒng)各個(gè)視場RMS直徑Tab.3 RMS spot sizes of the system with different field of views

圖3 離軸三反系統(tǒng)MTF曲線Fig.3 MTF curves of coaxial three-mirror system

表2 系統(tǒng)各視場MTF值Tab.2 MTF values of the system with different field of views

圖4 系統(tǒng)畸變圖Fig.4 System distortion diagram

4 系統(tǒng)檢出性能評價(jià)方法的建立

4.1 系統(tǒng)檢出率

大視場生物成像分析儀光學(xué)系統(tǒng)需要在數(shù)十萬個(gè)目標(biāo)中精確識別出帶有熒光標(biāo)記的靶細(xì)胞，其檢出率需大于95%，才能滿足現(xiàn)有稀有細(xì)胞的檢測需求。因此，擬采用與實(shí)際細(xì)胞尺寸一致的空白微球制作校準(zhǔn)品，其中M個(gè)空白微球作為待測細(xì)胞，并且摻入N個(gè)熒光微球作為靶細(xì)胞，將其平鋪在大視場載片上后，使用本系統(tǒng)進(jìn)行檢出率評價(jià)。具體判斷標(biāo)準(zhǔn)如下：若本系統(tǒng)檢出熒光微球G個(gè)，那么該系統(tǒng)的目標(biāo)細(xì)胞檢出率為G/N。

4.2 校準(zhǔn)品制備

空白微球采用分散聚合與種子溶脹聚合相結(jié)合的方法，通過調(diào)整聚合單體、引發(fā)劑、分散劑等參數(shù)，實(shí)現(xiàn)低CV值的10μm粒徑微球的合成，其孔徑為30 nm，CV<5%。在此基礎(chǔ)上，將量子點(diǎn)作為熒光染料，進(jìn)一步制備熒光微球，具體流程如下：配置氯仿、正丙醇混合液作為反應(yīng)溶液，體積比為9∶1；將量子點(diǎn)、微球按一定比例加入反應(yīng)溶液，超聲15 min，置于真空干燥箱干燥，至反應(yīng)溶液完全揮發(fā)；揮發(fā)后的體系加入1 ml環(huán)己烷重懸并混勻，采用離心機(jī)以3 000 r/min 離心5 min，經(jīng)過棄上清，留沉淀；重復(fù)上述操作2~3次后，干燥去除環(huán)己烷。干燥好的量子點(diǎn)微球中加入無水乙醇重懸待用。進(jìn)一步對空白微球的形貌及熒光微球進(jìn)行表征，具體結(jié)果如圖7所示。

圖7 (a)空白微球SEM表征及(b)熒光微球MERGE圖Fig.7(a)SEMcharacterization of blank microspheres and(b)fluorescent microsphere MERGE diagram

通過對兩種微球制備并表征后發(fā)現(xiàn)，制備的空白微球尺寸在10μm左右，符合細(xì)胞的尺寸需求。量子點(diǎn)熒光微球制備完成后并未改變微球的形態(tài)，熒光分布均一。本文制備的包含量子點(diǎn)的熒光微球的發(fā)射光譜分別為450，520，638 nm，滿足大視場熒光檢測的需求。進(jìn)一步使用摻入實(shí)驗(yàn)在約10 000個(gè)空白微球中精確摻入100個(gè)熒光微球，使用系統(tǒng)檢測熒光識別出的數(shù)量，用于評判系統(tǒng)檢出率。該試驗(yàn)連續(xù)重復(fù)3次。

4.3 試驗(yàn)結(jié)果

將制作的樣品以單層厚度鋪片到面積為150 mm×200 mm的載玻片上，用大視場生物成像分析儀進(jìn)行檢測，對檢出的熒光微球進(jìn)行計(jì)數(shù)，試驗(yàn)裝置和試驗(yàn)結(jié)果分別如圖8、圖9所示。該試驗(yàn)連續(xù)重復(fù)3次后發(fā)現(xiàn)，在共計(jì)10 100個(gè)微球中系統(tǒng)檢出的熒光微球數(shù)平均為98個(gè)，故系統(tǒng)檢出率為98%，達(dá)到了目標(biāo)細(xì)胞檢出率>95%的設(shè)計(jì)要 求。

圖8 試驗(yàn)裝置圖Fig.8 Test device diagram

圖9 試驗(yàn)結(jié)果Fig.9 Test results

5 結(jié) 論

本文利用離軸三反光學(xué)系統(tǒng)消像散技術(shù)設(shè)計(jì)了一種放大倍數(shù)為?1，視場范圍為150 mm×20 mm，相對孔徑大于0.1的大視場生物成像分析儀的顯微物鏡。在COOK式離軸三反光學(xué)結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了主三鏡一體化式結(jié)構(gòu)，使裝調(diào)時(shí)的調(diào)整自由度減少，從而降低了裝調(diào)難度。設(shè)計(jì)結(jié)果表明，該系統(tǒng)的分辨率可達(dá)3.5μm，在截止頻率178 lp/mm處全視場的MTF均值為0.357，成像質(zhì)量接近衍射極限，滿足大視場生物成像分析儀的設(shè)計(jì)要求。在稀有細(xì)胞以及痕量病原微生物檢測方面進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明其檢出率達(dá)98%。本方法具有視場大、分辨率高、檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，對于稀有細(xì)胞和痕量病原微生物檢測具有重要科學(xué)意義和實(shí)用價(jià)值。