許瑾 邵云華 黃靜怡 沈廣勝 朱娟 王梅仙 唐順明 沈興家

摘要：【目的】明確家蠶（Bombyx mori）二化性品系胚胎早期發(fā)育過程中己糖激酶基因（BmHK）不同轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)特性，為深入探究BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)功能及揭示其在家蠶胚胎早期發(fā)育中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。【方法】從NCBI檢索并下載家蠶等12種昆蟲的HK氨基酸序列，采用MEGA 7.0的鄰接法（NJ）構(gòu)建基于HK氨基酸序列相似性的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。以家蠶二化性品系秋豐活化越年蠶卵（丙2胚胎）為材料，分別制備非滯育命運(yùn)卵（ND）、滯育命運(yùn)卵（DD）和即時(shí)浸酸卵（IA），采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本在家蠶二化性品系胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)特性。【結(jié)果】BmHK基因?qū)儆贖SP70-actin家族，存在4個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，其長(zhǎng)度分別為4610、4608、2818和1520 bp，依次命名為BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。BmHK-a在3種蠶卵胚胎早期發(fā)育過程中整體上呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵，IA蠶卵中的BmHK-a相對(duì)表達(dá)量于發(fā)育2 h達(dá)峰值，在ND蠶卵和DD蠶卵中于發(fā)育48 h達(dá)峰值，此后其表達(dá)快速下調(diào)，至發(fā)育96 h均處于較低水平;BmHK-b在3種蠶卵中的表達(dá)水平整體上表現(xiàn)為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵，3種蠶卵中的BmHK-b相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，均隨發(fā)育時(shí)間推移呈逐漸上升趨勢(shì);BmHK-c在3種蠶卵中的表達(dá)差異明顯，初產(chǎn)蠶卵中已有較高的表達(dá)水平，受精后迅速升高，至發(fā)育72 h后BmHK-c在3種蠶卵中的相對(duì)表達(dá)量再次升高;BmHK-d在3種蠶卵中的相對(duì)表達(dá)量整體上呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為ND蠶卵>IA蠶卵>DD蠶卵，但I(xiàn)A蠶卵中BmHK-d表達(dá)峰值出現(xiàn)的時(shí)間早于DD蠶卵和ND蠶卵?！窘Y(jié)論】BmHK-a和BmHK-d主要在家蠶胚胎早期發(fā)育（產(chǎn)卵或浸酸后3 d）過程中發(fā)揮重要作用;BmHK-b雖然也參與家蠶胚胎早期發(fā)育過程，但不是主要的糖代謝相關(guān)酶;BmHK-c與家蠶胚胎早期發(fā)育關(guān)系密切，通過糖酵解為胚胎發(fā)育提供能量。

關(guān)鍵詞： 家蠶;己糖激酶（HK）;轉(zhuǎn)錄本;滯育;糖酵解;胚胎早期發(fā)育

Abstract：【Objective】To clarify the expression characteristics of the different transcripts of the hexokinase gene （BmHK） in the early embryonic development stage of bivoltine silkworm（Bombyx mori）， and in order to provide a theoretical basis for further exploring the biological functions of each transcript of the BmHK gene and revealing the mechanism of action in the early embryonic development of silkworm. 【Method】The HK amino acid sequences of 12 species of insects including B. mori were obtained and downloaded from NCBI， and a phylogenetic tree based on the similarity of HK amino acid sequences was constructed using the neighbor-joining method（NJ） of MEGA 7.0. The non-diapause-destined eggs （ND）， diapause-destined eggs（DD） and immediately acid-treated eggs（IA） were prepared using Qiufeng activated hibernating eggs（C-2 embryos） of the silkworm bivoltine strain. Real-time fluorescence quantitative PCR was used to detect the expression characteristics of each transcript during the early embryonic development of silkworm. 【Result】The BmHK gene belonged to the HSP70-actin family， and there were 4 different transcripts with lengths of 4610， 4608， 2818， and 1520 bp， respectively named BmHK-a， BmHK-b， BmHK-c and BmHK-d. BmHK-a showed an overall trend of increasing first and then decreased during the early embryonic development of the three kinds of silkworm eggs. At each time point， it was expressed as IA silkworm eggs>ND silkworm eggs>DD silkworm eggs， in IA silkworm eggs the relative expression of BmHK-a reached a peak at 2 h of development， and reached a peak at 48 h of development in ND silkworm eggs and DD silkworm eggs. After that， its expression was rapidly down-regulated and remained at a low level until 96 h of development; expression level of BmHK-b in silkworm eggs in three species was as follows：IA silkworm eggs>ND silkworm eggs>DD silkworm eggs. The relative expression levels of BmHK-b in the three silkworm eggs had basically the same trend， and they all showed a gradual upward trend with the development time. The expression of BmHK-c in the three silkworm eggs was greatly different. The expression level in the first-laying silkworm eggs was already high， and it increased rapidly after fertilization. The relative expression level of BmHK-c in the three silkworm eggs at 72 h after deve-lopment increased again; the relative expression of BmHK-d in the three silkworm eggs showed an overall trend of first increasing and then decreasing， and at each time point it was ND silkworm eggs>IA silkworm eggs>DD silkworm eggs， but the peak of BmHK-d expression in IA silkworm eggs appeared earlier than DD silkworm eggs and ND silkworm eggs. 【Conclusion】 BmHK-a and BmHK-d mainly play an important role in the early embryonic development of the silkworm （3 d after laying eggs or soaking in acid）; although BmHK-b is also involved in the early embryonic development of the silkworm， it is not the main sugar metabolism related enzymes; BmHK-c is closely related to the early embryonic deve-lopment of the silkworm， and provides energy for embryonic development through glycolysis.

Key words： Bombyx mori; hexokinase（HK）; transcript; diapause; glycolytic; early embryonic development

0 引言

【研究意義】家蠶（Bombyx mori）是世界上最重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲之一，也是鱗翅目的一種重要模式生物（唐芬芬等，2019）。根據(jù)家蠶在自然條件下一年發(fā)生的世代數(shù)，可分為一化性、二化性和多化性品系，而多化性品系又分為有滯育多化性和無滯育多化性（呂鴻聲，1991）。家蠶胚胎滯育發(fā)生時(shí)的能量代謝途徑一直被認(rèn)為是揭示家蠶滯育調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵（沈張飛等，2018;解鴻青等，2018）。糖酵解是糖代謝的重要方式，也是很多動(dòng)物組織能量的源頭。己糖激酶（Hexokinase，HK）是糖酵解最先出現(xiàn)的生物酶，能反應(yīng)生成丙酮酸參與三羧酸循環(huán)。HK廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物中，包含4種不同亞型，在進(jìn)化過程中高度保守且與多種生理活動(dòng)密切相關(guān)。HK能促進(jìn)磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移，將葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6-磷酸，其活性的升高有助于家蠶胚胎發(fā)育，是家蠶發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑（許瑾，2020）。HK在滯育解除過程中還能催化葡萄糖轉(zhuǎn)化為氨基酸和脂肪等物質(zhì)，產(chǎn)生大量能量，促進(jìn)家蠶胚胎頭部和胸節(jié)的分化。因此，分析HK基因在家蠶胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)特性，對(duì)解析二化性家蠶滯育的生理生化機(jī)制具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】家蠶滯育是一種非常典型的對(duì)光周期和環(huán)境溫度等主動(dòng)適應(yīng)機(jī)制（卓德干等，2010;張曉燕等，2015），二化性品系蠶卵常溫（25 ℃）明催青時(shí)產(chǎn)下滯育卵，而低溫（20 ℃以下）暗催青時(shí)產(chǎn)下非滯育卵（黃君霆，2003;顧燕燕等，2008）。在家蠶親代胚胎發(fā)生期，尤其是器官形成期，環(huán)境條件（高溫和長(zhǎng)光照等）的變化會(huì)影響子代蠶卵形成階段蛹期咽下神經(jīng)節(jié)（SG），促使其分泌滯育激素（DH）（Homma et al.，2006;梁瀚清等，2014）;分泌至血淋巴中的DH與卵巢細(xì)胞上的受體結(jié)合，啟動(dòng)卵巢中海藻糖酶基因的表達(dá)，促進(jìn)糖元積累，糖元再轉(zhuǎn)化為山梨醇和甘油，即滯育發(fā)生（黃君霆，2003;Hull et al.，2004;王力剛等，2011）。DH在滯育準(zhǔn)備期通過調(diào)節(jié)碳水化合物即糖代謝，為家蠶卵滯育作準(zhǔn)備。糖代謝是生物體內(nèi)廣泛存在的代謝方式，包括由一系列酶促反應(yīng)構(gòu)成的分解代謝和合成代謝，是生命活動(dòng)的能量和物質(zhì)基礎(chǔ)（許瑾，2020）。在以家蠶二化性品系制備的滯育卵、非滯育卵及即時(shí)浸酸卵中，其超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、丙酮酸激酶（PK）、乙酰膽堿酯酶（AchE）和乳酸脫氫酶（LDH）的活性存在明顯差異（范蘭芬等，2011）。在昆蟲體內(nèi)的能量代謝過程中，HK是糖代謝途徑的限速酶，具有催化己糖磷酸化的作用，生成的葡萄糖-6-磷酸是參與海藻糖合成、糖原合成及糖酵解過程的重要中間代謝產(chǎn)物（王力剛等，2011）。至今，有關(guān)果蠅（Drosophila melanogaster）、麥紅吸漿蟲（Sitodiplosis mosellana）、蔥蠅（Delia antiqua）及棉鈴蟲（Bombyx mori）等物種的HK基因表達(dá)特征及功能研究已有較多報(bào)道。成衛(wèi)寧等（2009）研究表明，在麥紅吸漿蟲解除滯育過程中，其HK活力明顯升高，以促進(jìn)體內(nèi)糖酵解的順利進(jìn)行;郭強(qiáng)等（2015）研究發(fā)現(xiàn)，蔥蠅的2個(gè)HK基因在夏季滯育時(shí)具有相同的表達(dá)規(guī)律，但在冬季滯育時(shí)呈現(xiàn)出相反的表達(dá)規(guī)律;Lin和Xu（2016）研究表明，HK在棉鈴蟲的滯育和壽命調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，且非滯育蛹中的HK表達(dá)水平顯著高于滯育蛹。【本研究切入點(diǎn)】家蠶滯育卵胚胎發(fā)育早期的糖代謝以能量和物質(zhì)貯存為主，而非滯育卵和即時(shí)浸酸卵的糖代謝以物質(zhì)分解代謝為主（許瑾等，2020）。大部分真核生物轉(zhuǎn)錄的mRNA前體是以同一方式剪接出一類mRNA，但也有某些基因的mRNA前體是通過不同剪接方式而形成不同剪接異構(gòu)體（Lee and Rio，2015）。通過NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索到家蠶HK基因（BmHK）存在4個(gè)不同轉(zhuǎn)錄本，均由同一基因可變剪接產(chǎn)生，但至今鮮見BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本在家蠶胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)特性及其影響家蠶滯育作用機(jī)制的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】根據(jù)NCBI檢索到BmHK基因的4個(gè)轉(zhuǎn)錄本設(shè)計(jì)特異引物，檢測(cè)各轉(zhuǎn)錄本在家蠶二化性品系胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)特性，為深入探究BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本的生物學(xué)功能及揭示其在家蠶胚胎早期發(fā)育中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

供試家蠶二化性品系秋豐由江蘇省蠶桑生物學(xué)與生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存提供。TRIzon總RNA提取試劑盒、HiFiScript gDNA Removal RT MasterMix反轉(zhuǎn)錄試劑盒及UltraSYBR Mixture試劑盒購(gòu)自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1. 2 BmHK基因進(jìn)化分析

從NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）檢索并下載12種昆蟲的HK氨基酸序列信息（表1），基于HK氨基酸序列相似性，采用MEGA 7.0的鄰接法（Neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1. 3 蠶卵樣品制備

以家蠶二化性品系秋豐活化越年蠶卵（丙2胚胎）為材料，一部分蠶卵采用17 ℃暗催青，孵化后常規(guī)新鮮桑葉飼養(yǎng)，羽化后蛾區(qū)內(nèi)交配，制備非滯育命運(yùn)卵（Non-diapause-destined eggs，ND）;另一部分采用25 ℃明催青，飼養(yǎng)后制備滯育命運(yùn)卵（Diapause-destined eggs，DD），25 ℃保護(hù);20 h后取一部分DD蠶卵用鹽酸溶液（1.075 g/mL）于46 ℃下浸泡5 min，清水漂洗10 min后獲得即時(shí)浸酸卵（Immediately acid-treated eggs，IA），IA蠶卵從浸酸后計(jì)算其發(fā)育時(shí)間。IA蠶卵在浸酸前的發(fā)育同DD蠶卵，為滯育發(fā)育;浸酸后蠶卵滯育被打破，胚胎繼續(xù)發(fā)育，類似于ND蠶卵。3種蠶卵分別于發(fā)育0、2、6、12、24、48、72和96 h時(shí)取樣，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 引物設(shè)計(jì)與合成

從NCBI檢索BmHK基因（LOC101745054）的4個(gè)轉(zhuǎn)錄本（XM_004932593.3、XM_021352245.1、XM_004932595.3和XM_004932594.3），以ClustalW（http：//www.clustal.org/）進(jìn)行多序列比對(duì)分析，篩選出各轉(zhuǎn)錄本的特異片段，采用Primer 6.0分別設(shè)計(jì)上、下游引物（表2），并委托浙江尚亞生物技術(shù)有限公司合成。

1. 5 總RNA提取及cDNA合成

按TRIzon總RNA提取試劑盒說明提取蠶卵樣品總RNA：稱取100 mg不同蠶卵樣品，加200.0 μL TRIzon試劑，電動(dòng)研磨器冰浴研磨30 s，4 ℃下12000 r/min離心5 min;收集上清液并轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中，加入800.00 μL TRIzon試劑，混勻，室溫靜置5 min;加入200.00 μL氯仿，劇烈振蕩呈乳化狀，靜置5 min;4 ℃下12000 r/min離心15 min，小心吸取上層水相轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL EP管中;加入等體積異丙醇，振蕩混勻，冰浴30 min，4 ℃下12000 r/min離心10 min;棄上清液，加入75%乙醇，離心后棄上清液，并向沉淀物中加入DEPC水，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ?00 μL反應(yīng)管中加入16.00 μL去RNA酶的ddH2O，4×gDNA wiper Mix 4.00 μL，RNA模板（總RNA）約1 μg，42 ℃孵育2 min，除去DNA;然后加入4.00 μL 5×qRT SuperMix II進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件：50 ℃ 15 min，85 ℃ 2 min，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物即為cDNA。

1. 6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平

以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板、 Actin3基因?yàn)閮?nèi)參基因，參照蔣濤（2017）的方法進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系10.00 μL：SYBR Primix Ex Taq 1.00 μL，ROX Reference Dye 6.00 μL，cDNA模板0.50 μL，上、下游引物各0.25 μL，ddH2O 2.00 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性2 min;94 ℃ 30 s，58 ℃ 25 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行45個(gè)循環(huán);95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 min。通過2-△△Ct法換算BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本相對(duì)表達(dá)量（Zhu et al.，2019），采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)（Moribe et al.，2010），并以GraphPad Prism 6.0制圖。

2 結(jié)果與分析

2. 1 BmHK基因結(jié)構(gòu)

BmHK基因?qū)儆贖SP70-actin家族，存在4個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本，其長(zhǎng)度分別為4610、4608、2818和1520 bp（圖1），依次命名為BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d。其中，BmHK-a的編碼區(qū)（CDS）序列為16～1440 bp，全長(zhǎng)1424 bp;BmHK-b的CDS序列為14～1438 bp，全長(zhǎng)1424 bp;BmHK-c的CDS序列為1466～2818 bp，全長(zhǎng)1352 bp;BmHK-d的CDS序列為159～1520 bp，全長(zhǎng)1361 bp。

2. 2 BmHK基因進(jìn)化分析結(jié)果

由圖2可看出，12種昆蟲的HK氨基酸序列可分為兩大分支，保守性較高;其中，BmHK氨基酸序列（XP_004923503.1）與野桑蠶HK氨基酸序列（XP_028037827.1）和煙草天蛾HK氨基酸序列（XP_030021779.1）聚類在一起，形成一個(gè)進(jìn)化分支，說明三者在系統(tǒng)分類上親緣關(guān)系較近，而與菜粉蝶HK氨基酸序列（XP_022112731.1）所在分支的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2. 3 BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)特性分析結(jié)果

2. 3. 1 BmHK-a表達(dá)特性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖3）顯示，BmHK-a在IA蠶卵、ND蠶卵和DD蠶卵胚胎早期發(fā)育過程中（0～96 h）整體上呈先升高后降低的表達(dá)變化趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵。在IA蠶卵中，BmHK-a相對(duì)表達(dá)量于發(fā)育2 h達(dá)峰值，且在48 h內(nèi)均保持高水平，但至發(fā)育48 h后快速下調(diào);在ND蠶卵和DD蠶卵中，BmHK-a相對(duì)表達(dá)量在發(fā)育2～48 h期間均呈逐漸上升趨勢(shì)，至發(fā)育48 h達(dá)峰值，此后BmHK-a的表達(dá)也快速下調(diào)。至發(fā)育96 h，3種蠶卵中的BmHK-a相對(duì)表達(dá)量均處于較低水平。說明BmHK-a主要在蠶卵胚胎早期發(fā)育（產(chǎn)卵或浸酸后3 d）過程中發(fā)揮重要作用，為胚胎發(fā)育提供能量。

2. 3. 2 BmHK-b表達(dá)特性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖4）顯示，BmHK-b在家蠶二化性品系不同處理蠶卵中的表達(dá)水平整體上表現(xiàn)為IA蠶卵>ND蠶卵>DD蠶卵。在DD蠶卵中，BmHK-b相對(duì)表達(dá)量隨發(fā)育時(shí)間的推移呈非常緩慢上升趨勢(shì)，但變化差異不明顯;在ND蠶卵中，BmHK-b相對(duì)表達(dá)量的變化趨勢(shì)與DD蠶卵的基本一致;在IA蠶卵中，BmHK-b的表達(dá)在浸酸處理后72 h內(nèi)呈緩慢上調(diào)趨勢(shì)，從72 h后開始快速上調(diào)，至發(fā)育96 h達(dá)峰值。說明BmHK-b參與家蠶胚胎早期發(fā)育過程，但不是主要的糖代謝相關(guān)酶。

2. 3. 3 BmHK-c表達(dá)特性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖5）顯示，DD蠶卵發(fā)育2 h后，BmHK-c相對(duì)表達(dá)量快速升高，然后逐漸下降，于發(fā)育24 h降至最低值，而后又逐漸上升;在ND蠶卵中，BmHK-c相對(duì)表達(dá)量呈上升—下降—上升的變化趨勢(shì)，于發(fā)育12 h達(dá)峰值，然后迅速下降，至發(fā)育24 h達(dá)最低值，之后又呈逐漸上升趨勢(shì);在IA蠶卵中，BmHK-c相對(duì)表達(dá)量在浸酸處理后2 h快速上升至較高水平，之后下降并穩(wěn)定在較低水平，至發(fā)育72 h后再次快速上升。說明BmHK-c與家蠶胚胎早期發(fā)育密切相關(guān)，通過糖酵解為胚胎發(fā)育提供能量。

2. 3. 4 BmHK-d表達(dá)特性 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果（圖6）顯示，BmHK-d在家蠶二化性品系不同處理蠶卵中的相對(duì)表達(dá)量整體上呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為ND蠶卵>IA蠶卵>DD蠶卵。在DD蠶卵中，BmHK-d相對(duì)表達(dá)量在發(fā)育前12 h處于較低水平且變化不明顯，然后快速上升，至發(fā)育24 h達(dá)峰值，隨后逐漸下降;在ND蠶卵中，BmHK-d表達(dá)水平最高，其相對(duì)表達(dá)量在發(fā)育前24 h呈逐漸升高趨勢(shì)，至發(fā)育24 h達(dá)峰值，之后逐漸下降，但仍維持在較高水平;在IA蠶卵中，BmHK-d相對(duì)表達(dá)量于發(fā)育12 h達(dá)峰值，之后逐漸下降，從發(fā)育72 h后快速下降。IA蠶卵中BmHK-d表達(dá)峰值出現(xiàn)的時(shí)間早于DD蠶卵和ND蠶卵，可能與IA蠶卵以浸酸后為計(jì)時(shí)起點(diǎn)有關(guān)，峰值出現(xiàn)時(shí)間實(shí)際是在產(chǎn)卵后32 h。BmHK-d主要在蠶卵胚胎早期發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，但在ND蠶卵發(fā)育48～96 h仍有較高水平的穩(wěn)定表達(dá)，可能與ND蠶卵胚胎發(fā)育迅速有關(guān)。

3 討論

真核生物mRNA前體剪接是基因轉(zhuǎn)錄后表達(dá)調(diào)控的重要步驟，可變剪接廣泛存在于高等生物中（Kim et al.，2007）。人類基因平均含有8個(gè)外顯子，所有的基因都能發(fā)生可變剪接，并產(chǎn)生2個(gè)以上的mRNA異構(gòu)體（Lee and Rio，2015）。已有研究證實(shí)，家蠶神經(jīng)肽Orcokinin基因（BmOK）存在選擇性剪接，產(chǎn)生2個(gè)轉(zhuǎn)錄本（BmOKA和BmOKB），BmOK參與色素合成調(diào)控，是2種類鶉斑突變體（q-lp和q-lb）形成的主要原因（Wang et al.，2019）;家蠶通過對(duì)Bmdsex結(jié)合蛋白的選擇性剪接，而調(diào)控其性別分化（Zheng et al.，2019）。HK在棉鈴蟲滯育中發(fā)揮重要作用，且非滯育蛹中的HK表達(dá)水平顯著高于滯育蛹（Lin and Xu，2016）。本課題組的前期研究也表明，家蠶非滯育卵和即時(shí)浸酸卵中的BmHK表達(dá)水平明顯高于滯育卵（許瑾等，2020）。

由于BmHK基因存在4個(gè)不同的轉(zhuǎn)錄本（BmHK-a、BmHK-b、BmHK-c和BmHK-d），為此本研究設(shè)計(jì)4個(gè)轉(zhuǎn)錄本的特異引物，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各轉(zhuǎn)錄本在家蠶二化性品系不同處理蠶卵中的表達(dá)情況。BmHK-a在DD蠶卵、ND蠶卵和IA蠶卵胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)模式相似，受精（發(fā)育2 h）后的相對(duì)表達(dá)量迅速上升，其峰值基本接近且均出現(xiàn)在產(chǎn)卵或浸酸后48 h，此后BmHK-a相對(duì)表達(dá)量快速下降，至發(fā)育96 h達(dá)最低，說明BmHK-a是家蠶胚胎早期發(fā)育過程中HK的主要活性形式。BmHK-b在3種蠶卵中的表達(dá)模式基本一致，在初產(chǎn)蠶卵中已有一定的表達(dá)量，隨著發(fā)育時(shí)間的推移，其相對(duì)表達(dá)量緩慢上升，說明BmHK-b參與家蠶胚胎早期發(fā)育過程，但不是胚胎早期發(fā)育過程中HK的主要活性形式。IA蠶卵中的BmHK-b相對(duì)表達(dá)量隨著發(fā)育時(shí)間的推移呈逐漸上升趨勢(shì)，并在發(fā)育96 h達(dá)峰值，可能是其胚胎（戊3～己1）快速發(fā)育需要更多能量。BmHK-c在DD蠶卵、ND蠶卵和IA蠶卵中的表達(dá)差異明顯，初產(chǎn)蠶卵中有較高的表達(dá)水平，可能是母體為子代胚胎發(fā)育所提供，受精后迅速上升至較高水平，推測(cè)BmHK-c可能參與蠶卵的受精過程;在DD蠶卵和IA蠶卵中，受精后（6～72 h）的BmHK-c相對(duì)表達(dá)量降至較低水平（接近產(chǎn)卵初期），在ND蠶卵中于發(fā)育12 h出現(xiàn)峰值，與ND蠶卵胚胎快速發(fā)育有關(guān);至發(fā)育72 h后，BmHK-c在3種蠶卵中的相對(duì)表達(dá)量再次升高，成為HK的主要活性形式。BmHK-d在3種蠶卵中的相對(duì)表達(dá)量整體上呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，且各時(shí)間點(diǎn)均表現(xiàn)為ND蠶卵>IA蠶卵>DD蠶卵;IA蠶卵中BmHK-d表達(dá)峰值出現(xiàn)的時(shí)間早于DD蠶卵和ND蠶卵，可能與IA以浸酸后為計(jì)時(shí)起點(diǎn)有關(guān)，實(shí)際是在產(chǎn)卵后32 h出現(xiàn)峰值，說明浸酸處理并未影響B(tài)mHK-d表達(dá)。此外，在DD蠶卵和IA蠶卵（源自滯育命運(yùn)蠶卵）中，BmHK-d相對(duì)表達(dá)量在發(fā)育96 h均降至最低水平，而ND蠶卵中的BmHK-d表達(dá)仍維持在較高水平，表明BmHK-d在DD蠶卵和IA蠶卵胚胎早期發(fā)育過程中發(fā)揮作用，之后的作用減弱;而在ND蠶卵中即使96 h后仍發(fā)揮重要作用，可能與ND蠶卵胚胎發(fā)育迅速有關(guān)。

綜上所述，BmHK基因4個(gè)轉(zhuǎn)錄本在來源于家蠶二化性品系滯育蠶卵、非滯育蠶卵和即時(shí)浸酸蠶卵胚胎早期發(fā)育過程中的表達(dá)水平存在差異，且各自在不同發(fā)育階段和水平上發(fā)揮功能作用，但有關(guān)BmHK基因參與二化性蠶卵滯育的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探究。因此，下一步將采用Western blotting從蛋白水平研究這些轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)水平，或通過RNAi分別抑制BmHK基因各轉(zhuǎn)錄本表達(dá)，進(jìn)而深入探究BmHK基因的生物學(xué)功能。

4 結(jié)論

BmHK-a和BmHK-d主要在家蠶胚胎早期發(fā)育（產(chǎn)卵或浸酸后3 d）過程中發(fā)揮重要作用;BmHK-b雖然也參與家蠶胚胎早期發(fā)育過程，但不是主要的糖代謝相關(guān)酶;BmHK-c與家蠶胚胎早期發(fā)育關(guān)系密切，通過糖酵解為胚胎發(fā)育提供能量。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）