張慶，李誠至，林鈺涓，于曉章

（桂林理工大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣西桂林 541006）

植物激素是植物產(chǎn)生的痕量的并對植物生長發(fā)育起至關(guān)重要作用的信號分子物質(zhì)[1-3]。吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、赤霉素3（GA3）參與了植物從種子休眠、萌發(fā)、營養(yǎng)生長到生殖生長，以及成熟和衰老的整個生命過程，茉莉酸（JA）、水楊酸（SA）是2 種主要的脅迫激素，受到脅迫的調(diào)控，在植物的脅迫耐受性和抗逆性中發(fā)揮著重要作用[4-6]。但是，植物激素在大多數(shù)組織中的含量很低[7,8]，通常在10-6～10-9g 之間，性質(zhì)不穩(wěn)定，與其共存的成分非常復(fù)雜，檢測時容易受到干擾。同時有些植物材料非常珍貴，材料量少，因此要求檢測的方法必須簡便、快速、靈敏、專一[9-11]。

目前植物激素的使用不當或濫用現(xiàn)象導(dǎo)致的食品安全問題日益增多[3]，從食品安全的角度來看，建立一種實用準確的水稻中植物激素殘留分析方法顯得非常必要。目前，植物激素的測定主要采用色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)[12-18]。氣相色譜（GC）/質(zhì)譜（MS）聯(lián)用在靈敏度問題上能滿足植物激素的測定要求，但樣品需要純化、濃縮和衍生化處理，增加了樣品前處理步驟[19,20]。超高效液相色譜（UPLC）-串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）具有高靈敏度和高選擇性，可以滿足植物粗提液中植物激素的定量測定，同時還很大程度上簡化了樣品前處理程序。

目前，基于液相色譜（LC）-串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）聯(lián)用方法對植物激素的分析，大多集中在生長素（IAA）、赤霉素3（GA3）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）和水楊酸（SA）等幾種植物激素，存在可檢測的植物激素種類偏少等問題[2,4,7]。本實驗采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，建立一種同時測定水稻中赤霉素3（GA3）、赤霉素1（GA1）、異戊烯基腺嘌呤（IPA）、水楊酸（SA）、吲哚乙酸（IAA）、脫落酸（ABA）、茉莉酸（JA）、赤霉素7（GA7）、赤霉素4（GA4）、茉莉酸異亮氨酸（JA-ILe）、油菜素甾酮（CS）、12 氧代植物二烯酸（12-OPDA）和香蒲甾醇（TY）等13 種植物激素含量的分析方法，為水稻中植物激素的分析提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290 超高液相色譜儀串聯(lián)AB SCIEX 5500 Qtrap 質(zhì)譜儀。美國MET QL-866 渦旋混勻儀（13111-V-220）。冷凍離心機（H1650-W）。色譜柱Waters，ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×100 mm，i.d.1.7 μm）。甲酸購自Fluka，乙腈、甲醇購自Merck。所有植物激素的標準品均購自O(shè)lchemim。實驗用水均為Milli-Q plus 去離子水。

1.2 標準物質(zhì)的配制

準確稱取1.0 mg 的赤霉素3、赤霉素1、異戊烯基腺嘌呤、水楊酸、吲哚乙酸、脫落酸、茉莉酸、赤霉素7、赤霉素4、茉莉酸異亮氨酸、油菜素甾酮、12氧代植物二烯酸和香蒲甾醇溶解在甲醇溶液中，配制成濃度為1 mg/mL 的單標儲備溶液。取適量的單標準儲備溶液，配制成混合標準儲備溶液。其中，各植物激素濃度為1 μg/mL。將上述溶液用甲醇逐級稀釋，用于繪制標準工作曲線。

1.3 色譜質(zhì)譜條件

色譜條件：流動相，A 液為0.04%甲酸-水溶液，B 液為0.04%甲酸-乙腈溶液。樣品置于4℃自動進樣器中，柱溫45℃，流速為400 μL/min，進樣量4 μL。梯度洗脫設(shè)置如下：0～10 min，B 液從2%線性變化到98%，A 液相應(yīng)的從98%線性變化到2%；10～11.1 min，B 液從98%線性變化至2%，A 液相應(yīng)的從2%線性變化到98%；11.1～13 min，B 液維持在2%，A 液相應(yīng)的維持在98%。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離子源（ESI），掃描方式為負離子掃描多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）。ESI 條件如下：Source Temperature（離子源溫度）：500℃；Ion Source Gas1（輔助加熱氣1）：45；Ion Source Gas2（輔助加熱氣2）：45；Curtain Gas（氣簾氣）：30；Ion Sapary Voltage Floating（電噴霧電壓）：-4500 V。

1.4 植物激素的提取

植物激素的提取參考文獻[21,22]。具體實驗方法如下，將水稻葉片組織樣品液氮研磨，取100 mg 樣品于2 mL 離心管中，加入1 mL 甲醇-乙腈-水溶液（40:40:20，V/V），震蕩混勻2 min；4℃避光抽提12 h，14000 r/min 離心10 min，取上清液800 μL，氮氣吹干，用200 μL 甲醇-水溶液（50:50，V/V）定溶，14000 r/min 離心10 min，取上清液進樣分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 定容溶劑選擇

實驗比較了水、甲醇-水（50:50，V/V）、甲醇、乙腈、甲醇-乙腈（50:50，V/V）和乙腈-水（50:50，V/V）6 種定容溶液的對植物激素峰形、響應(yīng)強度以及出峰時間的影響[21,22]，結(jié)果分別如圖1a、1b、1c、1d、1e 和1f 所示。結(jié)果表明，純水作為定容溶劑，部分目標分析物（3 號峰異戊烯基腺嘌呤和10 號峰茉莉酸異亮氨酸）響應(yīng)強度較低（圖1a）。甲醇作為定容溶劑，出峰時間較早的目標分析物如赤霉素3、赤霉素1等的色譜峰出現(xiàn)明顯分叉（圖1c）。含有乙腈的溶液[乙腈-水（50:50，V/V）、乙腈和甲醇-乙腈（50:50，V/V）]，出峰時間普遍較長（圖1d、1e 和1f），并且吲哚乙酸、12 氧代植物二烯酸、香蒲甾醇峰形拖尾嚴重。定容溶劑選擇甲醇-水（50:50，V/V）時目標分析物的響應(yīng)強度較高，且目標分析物峰形均較好（圖1b）。綜合考慮，本文以甲醇-水（50:50，V/V）為定容溶劑。

圖1 不同定容溶劑時13 種植物激素的總離子流圖 Fig.1 Total ion chromatogram (TIC) of thirteen plant hormones at different solvents

2.2 色譜柱的選擇

對于植物激素這類弱極性物質(zhì)，實驗選擇Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱。ACQUITY UPLC BEH C18 色譜柱具備pH=1～12 范圍內(nèi)的化學(xué)穩(wěn)定性，能夠影響可電離化合物的保留性、選擇性和靈敏性，同時還能在低pH 和高pH 條件下保持優(yōu)異的柱穩(wěn)定性。

2.3 色譜條件優(yōu)化

考察了流動相對分離的影響，直接以乙腈-水溶液作為流動相時，13 種植物激素的混合標準樣品不能完全分離，色譜峰拖尾嚴重。甲酸可以抑制樣品基質(zhì)的電離，改善色譜峰的拖尾現(xiàn)象，因此流動相中需要加入甲酸。

實驗對流動相中甲酸的用量（0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%）進行了考察，發(fā)現(xiàn)甲酸含量為0.04%時分離效果最佳，既保證了13 種植物激素混合標樣的有效分離，又改善了拖尾現(xiàn)象。因此最終確定流動相A 為甲酸-水溶液（0.04:99.6），B 為甲酸-乙腈溶液（0.04:99.6），并采用梯度洗脫方式進行洗脫。

2.4 質(zhì)譜條件優(yōu)化

植物激素的檢測有采用正離子模式，也有采用負離子模式[12,13]。在正離子模式下，部分物質(zhì)產(chǎn)生了[M+Na]+、[M+K]+的離子峰。其中，[M+Na]+和[M+K]+可能是水中的Na+，K+引起的。在負離子模式ESI(-)下，13 種植物激素都產(chǎn)生了響應(yīng)較強的[M-H]-。綜合考慮，本實驗選擇負離子模式[ESI(-)]。其次，優(yōu)化化合物的子離子和碰撞能量，選擇豐度較高的兩個子離子作為化合物的特征離子對，并對電噴霧電壓、離子源溫度、碰撞氣、掃描駐留時間，去簇電壓及碰撞電壓等參數(shù)優(yōu)化，確定出最佳的質(zhì)譜參數(shù)。所有植物激素的質(zhì)譜參數(shù)見表1。最佳色譜質(zhì)譜條件下的13 種植物激素總離子流圖如圖1b 所示。

表1 13 種植物激素的質(zhì)譜參數(shù) Table 1 The mass spectrum of thirteen plant hormones

2.5 線性關(guān)系和檢出限

標準物質(zhì)儲備液用甲醇稀釋配制成10 μg/mL 標準溶液，然后再稀釋至ng/mL 標準工作液系列。以上述色譜質(zhì)譜條件，對系列標準工作液進行分析，以植物激素濃度為x 軸，所對應(yīng)的峰面積為y 軸，繪制標準曲線，并進行線性回歸，得到回歸方程和相關(guān)系數(shù)（R2），以信噪比（S/N）為3 確定化合物的檢出限（LOD），具體見表2。線性范圍在1～500 ng/mL 之間，R2均大于0.9980，LOD 最低至0.310 ng/mL。

表2 13 種植物激素的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限（LOD）Table 2 Linearity,correlation coefficient (R2) and detection limits of thirteen plant hormones

2.6 回收率和精密度

在處理的樣品中添加標準混合溶液，制備1、50、100 ng/mL 三個濃度加標水平的樣品，每個濃度水平設(shè)3 個平行樣品。用本方法進行測定，平均回收率和相對標準偏差見表3。添加3 個不同濃度（1、50、100 ng/mL）的植物激素標準溶液，13 種植物激素的平均加標回收率為81.90%～118.80%，RSD 均小于8.12%，方法的準確度和精密度均符合檢測要求。各植物激素在保留時間區(qū)域內(nèi)無干擾，故本方法具有較好的選擇性。

表3 回收率與相對標準偏差試驗結(jié)果 Table 3 Recovery and relative standard deviation (RSD) of thirteen plant hormones (n=3)

2.7 實際樣品分析

研究選取湘早秈45 號、汕優(yōu)63 號和桂朝2 號三個品種的水稻樣品。將測得的植物激素的峰面積代入上述工作曲線中，經(jīng)過換算，得到相應(yīng)的水稻中植物激素含量，如表4 所示。從表4 中可以看出，三個品 種水稻中GA3 和ABA 含量較多，研究表明GA3 和植物生長、細胞伸長相關(guān)并且促進代謝，而ABA 對植物成花的誘導(dǎo)和發(fā)育具有重要調(diào)控作用[21]。此外，GA4 是具有生物活性的赤霉素，能夠促進莖的生長[21]；GA7 可以打破某些種子的休眠，提高結(jié)實率[22]；JA-ILe 可以增強植物遭遇損傷或者蟲鳥取食后產(chǎn)生局部防御反應(yīng)能力[22]；CS 是一種能促進植物莖桿伸長和細胞分裂的高活性物質(zhì)，亦可防御環(huán)境脅迫[23,24]。最后，通過比較可以看出，不同品種的水稻中植物激素含量有些差異。

表4 水稻樣品中的13 種植物激素含量 Table 4 The content of thirteen plant hormones in rice samples

2.8 方法對比分析

將本研究所得的結(jié)果與文獻中的檢測方法檢出限進行了對比，結(jié)果如表5 所示。從表5 中我們可以看出，本研究建立的多種激素測定方法大部分都比文獻中所報道的檢測方法檢出限更低，并且檢出的植物激素種類更多。關(guān)于GA1、IPA、GA4、GA7、JA-ILe、CS、12-OPDA 和TY 含量測定的方法文獻中鮮有報道。本研究建立的測定方法，能夠很好地應(yīng)用于GA1、IPA、GA4、GA7、JA-ILe、CS、12-OPDA 和TY 等植物激素含量的檢測。

表5 植物激素測定方法的檢出限對比 Table 5 Detection limit comparsion of plant hormones

3 結(jié)論

本研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定水稻組織中赤霉素3，赤霉素1，異戊烯基腺嘌呤，水楊酸，吲哚乙酸，脫落酸，茉莉酸，赤霉素7，赤霉素4，茉莉酸異亮氨酸，油菜素甾酮，12 氧代植物二烯酸和香蒲甾醇的方法。該方法簡便快速，能夠滿足水稻中植物激素含量的要求，具有一定的實際應(yīng)用價值。這將對深入研究水稻生長與發(fā)育過程、揭示水稻響應(yīng)生物與非生物環(huán)境機制、提高水稻產(chǎn)量和品質(zhì)以及鑒定植物激素殘留限量等方面具有重要的實際應(yīng)用與參考價值。