王文濤，孔濱

1青島大學(xué)附屬醫(yī)院乳腺外科，山東青島266000；2棗莊市婦幼保健院乳腺外科

新輔助化療（NAC）目前已廣泛應(yīng)用于乳腺癌的治療，對(duì)于局部晚期乳腺癌患者，通過(guò)NAC能夠在早期觀察瘤體對(duì)化療方案的敏感性進(jìn)而評(píng)估療效。研究顯示，CXCL8對(duì)乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用，CXCL8通過(guò)細(xì)胞外結(jié)合兩種G蛋白偶聯(lián)受體CXCR1和CXCR2來(lái)傳導(dǎo)信號(hào)，三者共同在乳腺癌微環(huán)境中表達(dá)，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［1-2］。有學(xué)者認(rèn)為，CXCL8表達(dá)升高可能導(dǎo)致乳腺癌細(xì)胞的多重耐藥［3］。本研究觀察了NAC前后乳腺癌組織中CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達(dá)變化，探討CXCL8-CXCR1/2軸在評(píng)估乳腺癌化療療效及預(yù)后中的作用。

1 資料與方法

1.1 臨床資料選擇2016年1月—2018年12月在青島大學(xué)附屬醫(yī)院接受NAC的62例女性乳腺癌患者，發(fā)病年齡34～66歲、中位發(fā)病年齡50歲，已絕經(jīng)31例、未絕經(jīng)31例。行乳腺腫塊空心針穿刺活檢確診為浸潤(rùn)性乳腺癌，TNM分期Ⅰ期5例、Ⅱ期30例、Ⅲ期27例。Luminal型46例，HER-2陽(yáng)性型8例，三陰型8例。

1.2 治療方法NAC方案選擇以下兩種之一：①TAC×6方 案：多 西 他 賽75 mg/m2，多 柔 比 星50 mg/m2，環(huán)磷酰胺500 mg/m2，21 d為1周期，共6周期。②AC×4-T×4方案：多柔比星60 mg/m2，環(huán)磷酰胺600 mg/m2，應(yīng)用4周期；序貫多西他賽80～100 mg/m2，應(yīng)用4周期，21 d為1周期?；熃Y(jié)束后2～3周行乳腺癌改良根治術(shù)或乳腺癌保乳術(shù)。

1.3 乳腺癌組織CXCL8、CXCR1、CXCR2表達(dá)檢測(cè)方法采用免疫組化法。收集NAC前的穿刺活檢腫瘤組織和NAC后的手術(shù)切除腫瘤組織，石蠟包埋、切片，常規(guī)脫蠟至水，EDTA抗原修復(fù)，BSA封閉30 min。滴加一抗（CXCL8稀釋比例1∶100，CXCR1、CXCR2稀釋比例1∶50），4℃孵育過(guò)夜。滴加相應(yīng)的二抗，37℃孵育30 min。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水封固，顯微鏡下觀察。每張切片隨機(jī)取5個(gè)視野，由2名資深病理醫(yī)師采用雙盲法對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行半定量評(píng)分。CXCL8表達(dá)判定：細(xì)胞質(zhì)呈黃色或褐色且染色細(xì)胞≥10%為陽(yáng)性，染色細(xì)胞<10%或無(wú)染色為陰性。CXCR1和CXCR2表達(dá)判定：先進(jìn)行染色強(qiáng)度評(píng)分，無(wú)染色為0分，淺黃色為1分，黃褐色為2分，棕褐色為3分；然后對(duì)陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分，<5%為0分，5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。兩項(xiàng)積分相加，2～4分為低表達(dá)，5～7分為高表達(dá)。

1.4 NAC療效評(píng)估方法取NAC后的手術(shù)切除腫瘤組織，應(yīng)用Miller-Payne系統(tǒng)進(jìn)行療效評(píng)估。G1：浸潤(rùn)性癌細(xì)胞無(wú)變化或個(gè)別癌細(xì)胞有所改變，但癌細(xì)胞數(shù)量總體無(wú)減少；G2：浸潤(rùn)性癌細(xì)胞數(shù)量輕度減少，減少比例<30%；G3：浸潤(rùn)性癌細(xì)胞數(shù)量減少比例為30%～90%；G4：浸潤(rùn)性癌細(xì)胞減少比例>90%，殘留量極少；G5：原瘤床無(wú)浸潤(rùn)性癌細(xì)胞，但導(dǎo)管原位癌可殘存。

1.5 預(yù)后隨訪方法通過(guò)查詢電子病歷系統(tǒng)、電話溝通等方式進(jìn)行隨訪，記錄患者的無(wú)病生存期（DFS），即從手術(shù)之日起至腫瘤出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或其他原因?qū)е滤劳龅臅r(shí)間。截止日期為2021年3月。

2 結(jié)果

2.1 NAC前后乳腺組織中CXCL8、CXCR1、CXCR2表達(dá)比較NAC前后CXCL8陽(yáng)性率分別為27.4%（17/62）、41.9%（26/62），NAC后CXCL8陽(yáng)性率升高（P<0.05）。NAC前后CXCR1表達(dá)積分分別為（5.6±1.1）、（4.8±1.4）分，CXCR2表達(dá)積分分別為（5.6±1.1）、（4.6±1.4）分，NAC后CXCR1、CXCR2表達(dá)積分均降低（P均<0.01）。

2.2 NAC前后乳腺癌組織中不同CXCL8、CXCR1、CXCR2表達(dá)水平患者的NAC療效比較NAC前CXCL8、CXCR1、CXCR2表達(dá)與Miller-Payne分級(jí)均無(wú)明顯相關(guān)（P均>0.05）。NAC后CXCL8陰性患者M(jìn)iller-Payne分級(jí)G4～G5級(jí)比例高于G1～G3級(jí)患者，CXCR1、CXCR2低表達(dá)患者M(jìn)iller-Payne分級(jí)G4～G5級(jí)的比例高于高表達(dá)患者（P<0.05或<0.01）。見(jiàn)表1。

表1 NAC前后乳腺癌組織中不同CXCL8、CXCR1、CXCR2表達(dá)水平患者NAC療效比較［例（%）］

2.3 影響乳腺癌患者NAC療效的Logistic回歸分析結(jié)果單因素分析顯示，腫瘤T分期、CXCL8（NAC后）、CXCR1（NAC后）與Miller-Payne分級(jí)相關(guān)（P均<0.05）。多因素分析顯示，腫瘤T分期、CXCR1（NAC后）是Miller-Payne分級(jí)的影響因素（OR=0.128，95%CI為0.018～0.920，P=0.041；OR=0.069，95%CI為0.008～0.590，P=0.015）。見(jiàn)表2。

表2 影響乳腺癌患者NAC后Miller-Payne分級(jí)的Logistic回歸分析結(jié)果

2.4 乳腺癌組織中CXCL8、CXCR1、CXCR2不同表達(dá)水平患者的DFS比較CXCL8（NAC前）陽(yáng)性、陰性患者的DFS分別為24.2、44.9個(gè)月，CXCL8（NAC后）陽(yáng)性、陰性患者的DFS分別為26.4、48.3個(gè)月；NAC前后CXCL8陽(yáng)性患者的DFS均較CXCL8陰性患者縮短（P均<0.01）。隨訪期間NAC前CXCR1、CXCR2低表達(dá)組均未出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，未能計(jì)算DFS。CXCR1（NAC后）高表達(dá)、低表達(dá)患者的DFS分別為32.9、47.3個(gè)月。CXCR2（NAC后）高表達(dá)、低表達(dá)患者的DFS分別為31.2、47.5個(gè)月；NAC前CXCR1、CXCR2高表達(dá)與低表達(dá)患者的DFS比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05），NAC后CXCR1、CXCR2低表達(dá)患者的DFS較高表達(dá)患者增加（P均<0.01）。

2.5 影響乳腺癌患者DFS相關(guān)因素的COX回歸分析結(jié)果單因素分析顯示，腫瘤T分期、N分期、HER-2、CXCL8（NAC前）、CXCL8（NAC后）、CXCR1（NAC后）、CXCR2（NAC后）與DFS相關(guān)。多因素分析顯示，腫瘤T分期、CXCL8（NAC后）是DFS的獨(dú)立影 響 因 素（P=0.048，HR=2.620；P=0.004，HR=26.990）。見(jiàn)表3。

3 討論

研究表明，趨化因子和趨化因子受體與乳腺癌的耐藥性和免疫力密切相關(guān)。乳腺癌細(xì)胞既能夠產(chǎn)生趨化因子，也可以表達(dá)趨化因子受體，這些配體和受體在乳腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。基于網(wǎng)絡(luò)的基因表達(dá)譜分析提示，CXCL8在乳腺癌中的作用顯著［4］。SINGH等［5］研究認(rèn)為，CXCL8-CXCR1/2軸可能通過(guò)調(diào)節(jié)癌癥干細(xì)胞增殖和自我更新在腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。CXCL8對(duì)接細(xì)胞膜上的G蛋白偶聯(lián)受體CXCR1和CXCR2傳導(dǎo)信號(hào)，CXCR1和CXCR2在所有乳腺癌細(xì)胞中均有表達(dá)，二者具有76%的序列同源性，并以相似的親和力與CXCL8結(jié)合。CXCL8及其受體CXCR1、CXCR2促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用已有諸多文獻(xiàn)報(bào)道，腫瘤較大且轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)較高的患者，其血清CXCL8水平顯著升高［6］。乳腺癌的晚期腫瘤負(fù)荷可能會(huì)引起血清CXCL8水平升高，并導(dǎo)致乳腺癌的不良結(jié)局，同時(shí)CXCL8升高也與早期癌灶遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)［7］。CXCL8表達(dá)水平增加可能有助于乳腺癌細(xì)胞的多藥耐藥，在胰腺癌裸鼠模型中移植Miapaca-2細(xì)胞后，給予吉西他濱治療，結(jié)果顯示吉西他濱可誘導(dǎo)CXCL8升高，進(jìn)而促進(jìn)新血管形成產(chǎn)生耐藥［8］。本研究結(jié)果顯示，NAC后CXCL8陽(yáng) 性 率 升 高，CXCR1、CXCR2表 達(dá) 降 低。CXCL8陽(yáng)性表達(dá)升高符合化療引起的炎癥刺激作用，CXCL8-CXCR1/2軸的激活和調(diào)節(jié)主要基于炎癥反應(yīng)和免疫細(xì)胞募集［9］，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞周圍的免疫細(xì)胞產(chǎn)生CXCL8增多。CXCR1、CXCR2表達(dá)于乳腺組織中，隨著化療導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞凋亡、腫瘤細(xì)胞數(shù)減少，CXCR1、CXCR2表達(dá)亦降低。提示NAC可能誘導(dǎo)細(xì)胞因子CXCL8增多，改變?nèi)橄侔┠[瘤微環(huán)境，有利于化療耐藥的產(chǎn)生。

研究顯示，乳腺癌組織中CXCR1在NAC后的下降幅度與化療療效相關(guān)［5］，提示CXCR1與乳腺癌化療效果有密切聯(lián)系。CXCR2及其配體有維持化療耐藥性的作用，在化療環(huán)境中靶向CXCR2信號(hào)傳導(dǎo)將有助于規(guī)避化療耐藥［10］。本研究中，NAC前CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達(dá)差異與Miller-Payne分級(jí)未顯示出相關(guān)性，不排除由于患者數(shù)量偏少、臨床分期和分子分型不同等因素影響可能。然而NAC后CXCL8陽(yáng)性和CXCR1、CXCR2高表達(dá)患者的Miller-Payne分級(jí)較低，化療療效較差，而CXCL8陰性和CXCR1、CXCR2低表達(dá)患者的化療療效更好；CXCR1在NAC后 的 表 達(dá) 是Miller-Payne分 級(jí)的獨(dú)立影響因素。提示NAC后CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達(dá)與化療療效相關(guān)，NAC后CXCL8、CXCR1、CXCR2可用于評(píng)估NAC療效。

既往研究顯示，血清CXCL8與激素依賴型乳腺癌［6］、HER2陽(yáng)性乳腺癌［11］患者的預(yù)后不良有關(guān)。雌激素受體陰性的乳腺癌組織中CXCL8 mRNA水平升高［12］，提示預(yù)后不良。胡紫葉等［13］報(bào)道，乳腺癌組織中CXCL8表達(dá)陽(yáng)性患者的預(yù)后較差。加權(quán)基因聯(lián)合表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，CXCL8可能與腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞的化學(xué)耐藥性相關(guān)，并與乳腺癌的預(yù)后不良相關(guān)［14］。宿主和癌細(xì)胞衍生的CXCR2信號(hào)通路在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中表現(xiàn)出非常重要的作用，CXCR2有助于乳腺癌誘導(dǎo)的骨溶解和骨轉(zhuǎn)移，是預(yù)后不良的重要因素之一［15］。本研究顯示，NAC后CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達(dá)與DFS相關(guān)，CXCL8陰性及CXCR1、CXCR2低表達(dá)的DFS更佳；CXCL8在NAC后的表達(dá)狀態(tài)是DFS的獨(dú)立影響因素，CXCL8陽(yáng)性患者預(yù)后不良，提示CXCL8可作為預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后的參考指標(biāo)。CXCL8、CXCR1、CXCR2在NAC后的高表達(dá)提示預(yù)后不良，推測(cè)經(jīng)NAC后局部病灶及全身血液中CXCL8的增多可能有利于身體遠(yuǎn)處微轉(zhuǎn)移灶的形成和進(jìn)展，進(jìn)而影響患者的預(yù)后；抑制或阻斷CXCL8-CXCR1/2信號(hào)傳導(dǎo)可能有助于抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，提高NAC療效，改善患者預(yù)后。

此外，本研究中NAC前的CXCL8表達(dá)與化療療效無(wú)關(guān)，而與DFS相關(guān)；分析患者資料發(fā)現(xiàn)，NAC前CXCL8陰性患者占73%，其中CXCR1/2高表達(dá)者占80%，這可能由于CXCR1/2高表達(dá)通過(guò)其他信號(hào)通路（非CXCL8-CXCR1/2通路）導(dǎo)致腫瘤耐藥，進(jìn)而影響NAC療效，表現(xiàn)為CXCL8陰性卻耐藥的現(xiàn)象；而化療后這些NAC前CXCL8陰性且CXCR1/2高表達(dá)的患者轉(zhuǎn)變?yōu)镃XCL8陰性且CXCR1/2低表達(dá)的患者增多，從而影響了DFS，表現(xiàn)為CXCL8陰性患者的DFS更佳。

綜上所述，NAC后乳腺癌組織中的CXCL8、CXCR1、CXCR2的表達(dá)在評(píng)估化療療效和預(yù)后中有重要作用，可作為標(biāo)志物篩選出化療療效不佳和預(yù)后不良的患者，利于指導(dǎo)治療決策的變更。綜合生物信息學(xué)分析提示，CXCL8是乳腺癌患者精準(zhǔn)治療的潛在靶點(diǎn)［16］，靶向CXCL8-CXCR1/2軸的免疫治療可能為乳腺癌的治療提供廣闊的前景。由于本研究樣本量較小，有個(gè)別指標(biāo)雖然在單因素分析時(shí)顯示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在多因素分析時(shí)通過(guò)對(duì)變量因素的篩選，未能顯示統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，遂未能納入多因素分析，我們將在后續(xù)研究中擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入分析。