水麗君，孟艷，鄭圣霞，黃存，錢易

1中國科技大學(xué)附屬第一醫(yī)院（安徽省立醫(yī)院）生殖中心，合肥230001；2南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院江蘇省人民醫(yī)院生殖中心；3馬鞍山婦幼保健院生殖中心

胚胎著床過程包括定位、黏附和植入，其中胚胎植入是人類及哺乳動物成功妊娠的關(guān)鍵一步。子宮內(nèi)膜組織處于受激素調(diào)節(jié)的特定階段，獲得功能性和短暫的卵巢類固醇依賴性狀態(tài)，在這個過程中子宮內(nèi)膜頂端表面經(jīng)歷許多形態(tài)學(xué)、分子和生物化學(xué)變化，從而具備能夠允許和接受胚胎植入的特定狀態(tài)，即為子宮內(nèi)膜容受性（ER）。ER是胚胎成功植入的必要條件之一，改善ER是輔助生殖技術(shù)中提高體外受精、單精子卵母細(xì)胞胞質(zhì)注射—胚胎移植（IVF/ICSI-ET）種植率和妊娠率的關(guān)鍵，對提高人工授精的成功率非常重要［1］。研究顯示，控制性超促排卵（COH）可能通過改變ER從而影響種植率［2］。我們的前期研究顯示，在不同控制性促超排卵方案患者中，種植窗期的子宮內(nèi)膜存在明顯的蛋白差異化表達(dá)，其中氨肽酶N（ANPEP）是變化較大的一個功能性蛋白，經(jīng)生物信息學(xué)分析認(rèn)為其可能是參與調(diào)控ER的潛在靶蛋白［3］。ANPEP是一種鋅依賴性肽酶，是血管形成過程中內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)變化的重要調(diào)節(jié)劑，參與血管生成、腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移以及免疫應(yīng)答［4-7］。ANPEP表達(dá)于人類子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞（hmESCs）生殖周期的各個階段，種植窗期ANPEP蛋白表達(dá)較增生期及種植窗前期明顯升高［8］，提示其可能參與調(diào)節(jié)ER。同源框基因A10（HOXA10）、整合素β3、白血病抑制因子（LIF）、白細(xì)胞介素1（IL-1）是目前公認(rèn)的ER標(biāo)志物。2017—2020年，我們通過腺病毒感染干擾hmESCs的ANPEP表達(dá)，觀察其對細(xì)胞中HOXA10、整合素β3、LIF、IL-1表達(dá)的影響，探討其調(diào)節(jié)ER的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 子宮內(nèi)膜組織來源選擇在南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院行宮內(nèi)節(jié)育器放置術(shù)的健康婦女10例，年齡28～35歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)周期處于增殖中晚期；平素月經(jīng)周期規(guī)則，否認(rèn)痛經(jīng)及性交痛，無其他內(nèi)分泌、免疫和代謝性疾?。恢辽?個月內(nèi)未服用甾體類激素（包括避孕及流產(chǎn)藥物）；無惡性腫瘤史。本研究經(jīng)南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.1.2 ANPEP干擾腺病毒的構(gòu)建ANPEP干擾腺病毒系委托上海吉凱基因公司構(gòu)建?；蛎Q：ANPEP（NM_001150，載 體 名 稱：GV119，元 件 順序：hU6-MCS-CMV-EGF，對照插入序列：TTCTCC?GAACGTGTCACGT，ANPEP干擾插入序列：TGAGC?TACTTCAAGCTCAT。-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑與儀器Ⅰ型膠原酶（Sigma），胎牛血清（HyClone），50μg/mL青霉素和50μg/mL鏈霉素、DMEM/F12培養(yǎng)基（Invitrogen）；波形蛋白抗體、角 蛋 白 抗 體 一 抗（ab9021，Abcam），二 抗（A11037，A32723；Invitrogen）。4，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，CST），抗熒光淬滅劑（Debico），抗ANPEP兔單克隆抗體（ab108310，Abcam），抗GAPDH兔單克隆 抗 體（AP0063，Bioworld），辣 根 過 氧 化 物 酶（CW0103S，CWBIO），PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒（TaKaRa）。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；實時熒光定量PCR儀（Eppendorf，德國），熒光共聚焦顯微鏡（Nikon，日本）。

1.2 hmESCs原代細(xì)胞的分離與培養(yǎng)術(shù)前用刮匙輕刮取得子宮腔內(nèi)膜，將內(nèi)膜組織剪成約1 mm×1 mm×1 mm大小，置于無血清培養(yǎng)基中，加入適量0.125%Ⅰ型膠原酶，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔20～30 min取出培養(yǎng)皿，用一次性移液管輕吹打散組織幫助消化，直至呈黏液絮狀，加入完全細(xì)胞培養(yǎng)基（含12%FBS）終止消化。使用200目和400目過濾器過濾，將濾液離心，懸浮在含12%胎牛血 清、50 μg/mL青 霉 素 和50 μg/mL鏈 霉 素 的DMEM/F12培養(yǎng)基中。將細(xì)胞接種到25 cm2培養(yǎng)瓶中，第2天更換培養(yǎng)基以去除紅細(xì)胞和雜質(zhì)。待細(xì)胞融合至80%～90%，可行細(xì)胞傳代。

1.3 hmESCs純度鑒定采用免疫熒光法。取第3代hmESCs，按5×104/孔接種于24孔板。加入4%多聚甲醛固定30 min，0.4% Triton-100作用10 min進(jìn)行細(xì)胞打孔，室溫封閉1 h。加入5%BSA稀釋的一抗（波形蛋白抗體1∶50，角蛋白抗體1∶50），4℃孵育過夜；加入5%BSA稀釋的熒光二抗（綠色標(biāo)記FITC和紅色標(biāo)記TRITC，稀釋濃度均為1∶500），37℃孵育1 h；使用DAPI進(jìn)行核染色，抗熒光淬滅劑密封玻片。在熒光共聚焦顯微鏡下觀察，TRITC、FITC、DAPI分別在561、488、405 nm波長進(jìn)行拍攝。由于hmESCs表達(dá)波形蛋白而不表達(dá)角蛋白，因此顯微鏡下可見紅色熒光標(biāo)記的波形蛋白表達(dá)，幾乎沒有綠色熒光標(biāo)記的角蛋白表達(dá)，表明細(xì)胞純度良好，可用于后續(xù)實驗。

1.4 hmESCs分組與腺病毒感染取第3代hmESCs，按2×105/孔接種至6孔板，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞融合50%～60%。將細(xì)胞分為干擾組和空載病毒組，分別加入ANPEP干擾腺病毒和相應(yīng)的空載腺病毒。48 h后熒光顯微鏡下觀察GFP蛋白表達(dá)（綠色熒光），確定感染效率。

1.5 hmESCs中ANPEP、HOXA-10、整合素β3、LIF、IL-1基因表達(dá)檢測采用實時熒光定量PCR法。取兩組細(xì)胞，TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計檢測RNA濃度與純度，以O(shè)D260/OD280值1.8～2.0為佳。使用PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。配置熒光定量PCR反應(yīng)體系，設(shè)三復(fù)孔加樣后上機(jī)檢測。ANPEP，HOXA-10，LIF，IL-1和整合素β3的PCR擴(kuò)增引物序列見表1。反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃，10 s；95℃5 s，60℃31 s，共40個循環(huán)。待反應(yīng)結(jié)束后確認(rèn)Real time RT-PCR的擴(kuò)增曲線和熔解曲線，以GADPH作為內(nèi)參，用2-ΔΔct法計算目的基因的相對表達(dá)量。

表1 目的基因與內(nèi)參基因引物序列

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 hmESCs感染ANPEP干擾腺病毒的效果熒光顯微鏡下顯示，幾乎所有細(xì)胞都表達(dá)綠色熒光蛋白，顯示出良好的感染效果?？蛰d病毒組中ANPEP mRNA的相對表達(dá)量為1.015±0.079，干擾組為0.380±0.067，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），干擾組ANPEP mRNA表達(dá)下調(diào)。

2.2 兩組細(xì)胞HOXA10、整合素β3、LIF、IL-1 mRNA表達(dá)比較與空載病毒組比較，干擾組HOXA10、整合素β3、LIF mRNA表達(dá)降低（P<0.05或<0.01），IL-1有下降趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

表2 兩組細(xì)胞HOXA10、整合素β3、LIF、IL-1 mRNA表達(dá)比較（±s）

表2 兩組細(xì)胞HOXA10、整合素β3、LIF、IL-1 mRNA表達(dá)比較（±s）

注：與對照組比較，*P<0.05，*P<0.01。

組別干擾組空載病毒組HOXA10 mRNA 0.639±0.060*1.117±0.888整合素β3 mRNA 0.692±0.088**1.126±0.030 LIF mRNA 0.666±0.031*1.087±0.030 IL-1 mRNA 0.830±0.156 1.142±0.070

3 討論

胚胎的成功著床、ER以及胚胎質(zhì)量是決定最終妊娠結(jié)局的核心因素，而ER尤為重要。促性腺激素釋放激素（GnRH）拮抗劑廣泛用于控制性促超排卵環(huán)節(jié)，具有快速抑制黃體生成素釋放、促性腺激素用量更少、刺激時間更短、卵巢過度刺激風(fēng)險較低等優(yōu)勢。但GnRH拮抗劑在促超排卵周期中存在胚胎低種植率和低妊娠率的現(xiàn)象，考慮可能與藥物改變ER有關(guān)［9］。ANPEP作為GnRH拮抗劑調(diào)節(jié)的下游蛋白，可能參與多個與ER相關(guān)的生物學(xué)事件，包括血管生成、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞遷移以及免疫反應(yīng)等。

ANPEP是一種與膜結(jié)合的鋅依賴性肽酶，通過N端跨膜螺旋區(qū)錨在細(xì)胞膜上，能夠從肽、酰胺或芳酰胺等底物的末端水解釋放出N端的中性氨基酸［10］，參與血管生成及腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移。ANPEP普遍存在于人體器官、組織和細(xì)胞中，在組織上皮及造血細(xì)胞中均有豐富表達(dá)。研究顯示，ANPEP在腫瘤組織中呈高表達(dá)，其與天冬酰胺—甘氨酸—精氨酸基序特異性結(jié)合，可促進(jìn)腫瘤新生血管形成和腫瘤侵襲［11］，抑制ANPEP表達(dá)可影響腫瘤細(xì)胞生長及血管生成［12-13］。目前關(guān)于ANPEP在生殖系統(tǒng)中作用的研究較少。研究顯示，不同年齡段雌性小鼠子宮內(nèi)膜均表達(dá)ANPEP蛋白，在幼齡組最低，性成熟組最高；隨著年齡增長、生育能力的衰退，ANPEP表達(dá)隨之下降［8］。ANPEP蛋白在人類生殖周期各階段hmESCs中均有表達(dá)，種植窗期組表達(dá)較增生期組及種植窗前期組明顯增強。在女性生殖過程中，成功的胚胎著床、胎盤形成及隨后的妊娠均需要良好的ER、母胎界面協(xié)調(diào)、精細(xì)的血管發(fā)育，伴隨細(xì)胞黏附、侵襲、子宮內(nèi)膜血管舒張滲透性增加和新生血管形成及成熟等變化，這一過程與腫瘤侵襲、血管發(fā)生極其相似。YE等［7］報道，ANPEP可能與促進(jìn)胚胎植入及維持妊娠相關(guān)，但具體機(jī)制尚不明確。ANPEP可能通過影響hmESCs中環(huán)磷酸腺苷介導(dǎo)的內(nèi)膜蛻膜化信號，在子宮內(nèi)膜蛻膜化或分化中發(fā)揮重要作用［14］。

HOXA10、整合素β3、LIF、IL-1是目前公認(rèn)的ER標(biāo)志物。HOXA10參與女性生殖系統(tǒng)的發(fā)育和正常子宮內(nèi)膜形態(tài)的形成［15］，在胚胎著床過程中參與子宮內(nèi)膜增殖、蛻膜化及胞飲突的形成、介導(dǎo)胚胎的定位及黏附過程、增強局部血管通透性［16］。整合素是一類黏附分子，可介導(dǎo)細(xì)胞黏附和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與胚胎發(fā)育、創(chuàng)傷修復(fù)、免疫應(yīng)答、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移等生理、病理過程。子宮內(nèi)膜的整合素表達(dá)在月經(jīng)周期和妊娠早期具有時間相關(guān)性和空間特異性，與種植窗的開啟時間一致，可作為ER和種植窗開放的標(biāo)志之一［17］。LIF是一種多效細(xì)胞因子，對多種細(xì)胞具有增殖和分化作用。LIF在某些活化的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中發(fā)揮抗凋亡作用，在蛻膜組織中局部產(chǎn)生的LIF可能以自分泌或旁分泌的方式增強某些活化的子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的活力，并可能在胚胎植入和滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程中保護(hù)細(xì)胞免受損傷［18］。IL-1參與免疫細(xì)胞的增殖與分化，可誘導(dǎo)上皮細(xì)胞表達(dá)黏附分子，增加其對胚泡的黏附性［19］；通過控制其效應(yīng)分子瘦素及其受體的表達(dá)量，參與種植窗開放過程。本課題組前期研究采用腺病毒感染使hmESCs過表達(dá)ANPEP，觀察其對ER相關(guān)因子的影響，發(fā)現(xiàn)HOXA-10、整合素β3、LIF mRNA表達(dá)上調(diào)，IL-1 mRNA有上升趨勢但差異無統(tǒng)計學(xué)意義［8］。本研究通過腺病毒感染干擾hmESCs的ANPEP表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ANPEP表達(dá)降低后，HOXA-10、整合素β3、LIF mRNA表達(dá)下降，IL-1 mRNA無明顯變化。這表明hmESCs中ANPEP的表達(dá)可影響ER因子水平，可能是其參與調(diào)節(jié)ER的機(jī)制之一。

綜上所述，hmESCs中ANPEP的表達(dá)與部分重要的ER因子如HOXA-10、整合素β3、LIF呈正相關(guān)。關(guān)于ANPEP通過何種機(jī)制發(fā)揮調(diào)節(jié)ER因子的作用，直接發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子作用還是通過改變子宮內(nèi)膜環(huán)境間接發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，有待進(jìn)一步深入研究。