王彥權(quán)，張鴻翰，呂 鴻，李彩琳，Najib Mohammerd，彭 芳，吳定宇

（1. 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000；2. 大理大學(xué)資產(chǎn)與實(shí)驗(yàn)室管理處，云南大理 671000）

肝癌是世界上高發(fā)病率的腫瘤之一，據(jù)國家衛(wèi)生健康委員會發(fā)布的《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2019年版）》，原發(fā)性肝癌是全球?qū)е滤劳龅牡诙蟀┌Y，86%的肝癌發(fā)生于發(fā)展中國家，我國2018年肝癌死亡率占世界的46.71%，晚期肝癌患者的總體5年生存率低于10%〔1-2〕。肝癌患者對全身化療的腫瘤應(yīng)答率低，容易誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性〔3〕。多藥耐藥性指腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性，是導(dǎo)致腫瘤化學(xué)治療失敗的最重要原因，對肝癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)具有重要影響〔4〕。人體內(nèi)一旦獲得了多藥耐藥性，化學(xué)治療藥物的抗腫瘤作用就會降低，而現(xiàn)有的抗晚期肝癌藥物大部分都容易產(chǎn)生多藥耐藥性作用〔5〕。索拉非尼是首個被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)用于治療人肝細(xì)胞癌（HCC）晚期的分子抑制劑，因?yàn)槟退幮缘漠a(chǎn)生而使其在臨床上的應(yīng)用受阻〔6〕。用于改善多藥耐藥的化學(xué)藥品種類較多，但往往只能針對其中的一種機(jī)制進(jìn)行逆轉(zhuǎn)，逆轉(zhuǎn)效率不高，臨床應(yīng)用受到限制。中草藥具有多靶點(diǎn)、多階段性作用的特點(diǎn)，可針對腫瘤多藥耐藥性的多種機(jī)制進(jìn)行有效逆轉(zhuǎn)。本課題組在前期研究中構(gòu)建了HepG2/ADM細(xì)胞株，在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中證明了美洲大蠊粗提物脫脂膏和CⅡ-3的抗HCC作用〔7〕，并發(fā)現(xiàn)其對多藥耐藥性有一定的逆轉(zhuǎn)作用，主要是通過促進(jìn)耐藥細(xì)胞株細(xì)胞凋亡，使P-gp mRNA表達(dá)量下降，抑制耐藥蛋白表達(dá)從而增加細(xì)胞內(nèi)藥物聚集發(fā)揮作用。同時，我們明確了美洲大蠊中抗腫瘤活性成分主要為小分子肽類，并從中分離得到了一系列小肽，命名為PAE系列多肽，其中美洲大蠊多肽PAE2的抗腫瘤效果較好〔8〕。但是PAE2對HCC多藥耐藥的作用尚未見研究報道。

本研究以耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU為研究對象，使用美洲大蠊多肽PAE2進(jìn)行體外干預(yù)，觀察PAE2是否具有抗HCC細(xì)胞多藥耐藥的作用。

1 材料

1.1 儀器CKX41SF型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；SN255939型酶標(biāo)儀、核酸濃度分析儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；7500型熒光定量PCR儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 藥品與試劑美洲大蠊多肽PAE2（純度98.06%）為實(shí)驗(yàn)室制備；索拉非尼（批號：1017R021）及長春新堿（批號：070603C）均購于北京索萊寶科技有限公司；5-氟尿嘧啶（5-FU，批號：WXBC2167V）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；阿霉素（批號：021411010）、噻唑藍(lán)溶液（MTT，批號：C0009-2）、PCR逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號：070618190813）及PCR熒光試劑盒（批號：032919200421）均購于上海碧云天生物科技有限公司；環(huán)磷酰胺（批號：980910）購于中國食品藥品鑒定研究院；奧沙利鉑（批號：20090202）購于美國Target Mol公司；胎牛血清（FBS，批號：18050302）購于美國Gibco公司；RMPI 1640培養(yǎng)基（批號：8120199）、Trizol試劑（批號：15596-026）均購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 細(xì)胞HCC敏感細(xì)胞株BEL-7402（批號：MXC050）、耐5-FU HCC細(xì)胞株BEL-7402/5-FU（批號：MXC049）均購于上海美軒生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥液的制備用超純水將5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺、奧沙利鉑5種抗腫瘤藥分別配制成1 mg/mL的藥物母液，美洲大蠊多肽PAE2溶液配制成50 mg/mL的母液，于4 ℃保存?zhèn)溆?，試?yàn)時用RPMI 1640培養(yǎng)基等比例稀釋至試驗(yàn)所需的不同濃度。

2.2 MTT法檢測細(xì)胞的多藥耐藥性取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的BEL-7402細(xì)胞和BEL-7402/5-FU細(xì)胞，接種于96孔板上。按照MTT實(shí)驗(yàn)操作，分別加入5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺、奧沙利鉑溶液，其中5-FU、長春新堿、環(huán)磷酰胺、奧沙利鉑的濃度為5、10、20、40、80 μg/mL，阿霉素的濃度為0.162 5、 0.375 0、0.750 0、1.500 0、3.000 0 μg/mL，并設(shè)置溶劑對照孔和空白對照孔（只含細(xì)胞，不加藥物），按以下公式計(jì)算藥物對細(xì)胞生存率和耐藥倍數(shù)（resistance index，RI）：細(xì)胞生存率 = （不同濃度藥物的OD值-溶劑對照孔的OD值）/（空白對照孔的OD值-溶劑對照孔的OD值）×100 %，RI=（BEL-7402/5-FU細(xì)胞株IC50）/（BEL-7402敏感細(xì)胞株IC50）。

2.3 MTT法檢測美洲大蠊多肽PAE2的細(xì)胞毒性作用將BEL-7402/5-FU細(xì)胞株接種于96孔板上，按照MTT實(shí)驗(yàn)操作，各孔加入不同濃度的美洲大蠊多肽PAE2溶液，進(jìn)行MTT檢測，確定美洲大蠊多肽PAE2發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的藥物劑量區(qū)間和有效作用時間。選取IC20的美洲大蠊多肽PAE2進(jìn)行藥物逆轉(zhuǎn)多藥耐藥試驗(yàn)，計(jì)算細(xì)胞生存率和美洲大蠊多肽PAE2的逆轉(zhuǎn)指數(shù)（reversal factor ，RF）。RF =（PAE2處理后BEL-7402/5-FU細(xì)胞株IC50）/（未處理BEL-7402/5-FU細(xì)胞株IC50）。

2.4 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（real time-polymerase chain reaction, RT-PCR）檢測多藥耐藥相關(guān)蛋白mRNA的表達(dá)水平試驗(yàn)設(shè)置6個試驗(yàn)組，分別為敏感組、耐藥細(xì)胞組、索拉非尼（陽性藥物）對照組和美洲大蠊多肽PAE2低、中、高劑量組。在培養(yǎng)皿中對耐藥細(xì)胞進(jìn)行接種與給藥培養(yǎng)。給藥結(jié)束后，每皿中加入Trizol試劑1 mL，冰浴放置5 min后，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞至1.5 mL EP管中，按照Trizol法提取總RNA。用焦碳酸二乙醇水20～50 μL溶解RNA樣品，在核酸濃度分析儀上進(jìn)行RNA濃度檢測。取總RNA按照逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)條件為42 ℃，60 min；80 ℃，10 min。將cDNA 置于實(shí)時熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）上游序列為5′-CCCAAACATTGACAAATCCTAACC-3′，下游序列為5′-CAACCAAGGAGGGTACCAGATG-3′；DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ（topo-isomerase typeⅡ, TopoⅡ）上游序列 為5′-GAAACGGAATCCTTGGTCAGAT-3′，下游序列為5′-TTTCGGCTGCTGCTCTCCTA-3′；谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase-π, GST-π）上游序列為5′-CTGGAAGGAGGAGGTGGTG-3′，下游序列為5′-GACGCAGGATGGTATTGGAC-3′；β-actin上游序列為5′-TGGCACCCAGCACAATGAA-3′，下游序列為5′-CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3′。擴(kuò)增條件為95 ℃ 2 min預(yù)變性，隨后95 ℃ 15 s， 60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進(jìn)行40個循環(huán)，最后95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s延伸。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算各目的基因的相對表達(dá)量。

2.5 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測多藥耐藥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平取處于對數(shù)生長期的所有組別耐藥細(xì)胞株，給藥處理48 h后，4%的多聚甲醛避光處理20 min，將3%過氧化氫溶液與甲醇溶液按一定比例（1∶4）滴于爬片上，封閉10 min后加入一抗孵育過夜，PBS清洗后加入二抗，室溫孵育30 min，隨后根據(jù)DAB顯色試劑盒進(jìn)行操作，于倒置相差顯微鏡下觀察。采用Image J軟件計(jì)算出相對光密度值（ROD），其中陽性指標(biāo)為棕色顆粒團(tuán)塊，陰性指標(biāo)為紫藍(lán)色團(tuán)塊，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0軟件處理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)分析選擇最低顯著性t檢驗(yàn)（LSD-t），數(shù)據(jù)以表示，P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 耐藥性檢測

3.1.1 細(xì)胞的多藥耐藥性檢測結(jié)果 5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑對HCC敏感細(xì)胞株BEL-7402的IC50分別為（12.60±2.48）、（1.58±0.26）、（26.73±1.54）、（28.12±2.61）、（21.21±4.02） mg/mL；5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑對HCC耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU的IC50分別為（7 398.27±330.77）、（6.44±0.39）、（78.01±4.90）、（177.74±4.29）、 （122.75±4.94） mg/mL。計(jì) 算 得BEL-7402/5-FU細(xì)胞對5-FU的耐藥倍數(shù)為587.16，對阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑的耐藥倍數(shù)分別為4.08、2.92、6.32、5.79。結(jié)果表明，BEL-7402/5-FU細(xì)胞對5-FU顯示出較強(qiáng)的耐藥性，對阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑產(chǎn)生了交叉耐藥性，即BEL-7402/5-FU細(xì)胞株為多藥耐藥細(xì)胞。

3.1.2 美洲大蠊多肽PAE2對敏感細(xì)胞和耐藥細(xì)胞的毒性作用 美洲大蠊多肽PAE2對敏感細(xì)胞株 BEL-7402的IC5、IC10、IC20、IC50分別為（53.73±2.91）、 （109.46±6.46）、（332.22±8.32）和（2 155.84±29.05） mg/mL，對耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU的IC5、IC10、IC20、IC50分 別 為（11.48±1.05）、（56.35±5.11）、 （105.23±4.34）和（1 165.53±63.01）mg/mL。結(jié)果顯示，耐藥細(xì)胞株BEL-7402/5-FU對美洲大蠊多肽PAE2更為敏感。

3.1.3 美洲大蠊多肽PAE2逆轉(zhuǎn)BEL-7402/5-FU多藥耐藥性的檢測結(jié)果 本研究選擇IC20高劑量的美洲大蠊多肽PAE2對BEL-7402/5-FU細(xì)胞進(jìn)行多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)試驗(yàn)。將PAE2分別與5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑聯(lián)合使用，并計(jì)算聯(lián)合用藥后BEL-7402/5-FU的細(xì)胞生存率與上述5種藥物的IC50。結(jié)果顯示，合用高劑量的美洲大蠊多肽PAE2后，5-FU、阿霉素、長春新堿、環(huán)磷酰胺和奧沙利鉑的IC50分別為（12.73±1.19）、（0.90±0.06）、（15.22±2.82）、（12.78±1.42）、（46.68±0.42） mg/mL，逆轉(zhuǎn)指數(shù)分別為581.17、7.16、5.13、13.91、2.63。綜上所述，美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥細(xì)胞有較好的逆轉(zhuǎn)耐藥作用。見表1。

表1 不同藥物對BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞的影響（， n=6 ）

表1 不同藥物對BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞的影響（， n=6 ）

藥物IC50 /（mg/mL）RI RF BEL-7402 BEL-7402/5-FU BEL-7402/5-FU+PAE2 5-FU 12.60 ± 2.48 7 398.27 ± 330.77 12.73 ± 1.19 587.16 581.17阿霉素 1.58 ± 0.26 6.44 ± 0.39 0.90 ± 0.06 4.08 7.16長春新堿 26.73 ± 1.54 78.01 ± 4.90 15.22 ± 2.82 2.92 5.13環(huán)磷酰胺 28.12 ± 2.61 177.74 ± 4.29 12.78 ± 1.42 6.32 13.91奧沙利鉑 21.21 ± 4.02 122.75 ± 4.94 46.68 ± 0.42 5.79 2.63

3.2 RT-PCR法檢測美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平的影響與敏感細(xì)胞株相比，耐藥細(xì)胞株的PKC、TopoⅡ及GST-π均呈高表達(dá)狀態(tài)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P< 0.05）。使用藥物作用耐藥細(xì)胞后，索拉非尼與中劑量（IC10）和高劑量（IC20）的美洲大蠊多肽PAE2可明顯下調(diào)PKC mRNA表達(dá)（P< 0.05）；索拉非尼能明顯下調(diào)TopoⅡ及GST-πmRNA的表達(dá) （P< 0.05），不同劑量組的美洲大蠊多肽PAE2也能明顯下調(diào)TopoⅡ及GST-πmRNA的表達(dá)（P< 0.05），并且各劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P> 0.05）。見表2。

表2 美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平的影響（，n=5）

表2 美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關(guān)酶mRNA表達(dá)水平的影響（，n=5）

注：與敏感細(xì)胞組比較*P< 0.05；與耐藥細(xì)胞組比較#P < 0.05；與索拉非尼（陽性藥物）對照組比較△P< 0.05；與美洲大蠊多肽PAE2低劑量組比較○P < 0.05；與美洲大蠊多肽PAE2中劑量組比較□P < 0.05。

組別 PKC相對含量 TopoⅡ相對含量 GST-π相對含量敏感細(xì)胞組 1.00 1.00 1.00耐藥細(xì)胞組 4.71±0.69* 1.18±0.16* 10.63±1.34*索拉非尼（陽性藥物）對照組 0.44±0.09# 0.02±0.00*# 4.42±1.31*#美洲大蠊多肽PAE2 低劑量組 7.12±0.69*#△ 0.55±0.14*#△ 6.94±2.13*#△美洲大蠊多肽PAE2 中劑量組 1.83±0.12*#△○ 0.66±0.16*#△ 5.86±0.52*#美洲大蠊多肽PAE2 高劑量組 0.97±0.10#○□ 0.52±0.12*#△ 5.41±1.92*#

3.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關(guān)酶蛋白表達(dá)水平的影響免疫細(xì)胞化學(xué)染色法實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：敏感細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株均大量表達(dá)PKC，但耐藥細(xì)胞的表達(dá)量明顯高于敏感細(xì)胞（P< 0.05），索拉非尼及美洲大蠊多肽PAE2均能對PKC出現(xiàn)抑制作用，且美洲大蠊多肽PAE2作用呈劑量依賴性。其中，高劑量的美洲大蠊多肽PAE2的作用效果與索拉非尼相當(dāng)（P> 0.05）。見圖1、表3。

表3 美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關(guān)酶相對光密度值（，n=5）

表3 美洲大蠊多肽PAE2對多藥耐藥相關(guān)酶相對光密度值（，n=5）

注：與敏感細(xì)胞組比較*P< 0.05；與耐藥細(xì)胞組比較#P < 0.05；與索拉非尼（陽性藥物）對照組比較△P< 0.05；與美洲大蠊多肽PAE2低劑量組比較○P < 0.05；與美洲大蠊多肽PAE2中劑量組比較□P < 0.05。

組別 PKC TopoⅡ GST-π敏感細(xì)胞組 0.34±0.08 0.12±0.01 0.95±0.04耐藥細(xì)胞組 0.83±0.10* 0.13±0.00* 1.10±0.05*索拉非尼（陽性藥物）對照組 0.24±0.09*# 0.09±0.01*# 0.71±0.06*#美洲大蠊多肽PAE2 低劑量組 0.44±0.07*#△ 0.12±0.00#△ 0.87±0.07*#△美洲大蠊多肽PAE2 中劑量組 0.41±0.10*#△ 0.12±0.00#△ 0.78±0.10*#△○美洲大蠊多肽PAE2 高劑量組 0.22±0.08*#○□ 0.10±0.00*#△○□ 0.65±0.04*#○□

圖1 美洲大蠊多肽PAE2對PKC蛋白表達(dá)的影響（× 200）

敏感細(xì)胞株和耐藥細(xì)胞株均大量表達(dá)TopoⅡ，但耐藥細(xì)胞的表達(dá)量高于敏感細(xì)胞（P< 0.05），索拉非尼及美洲大蠊多肽PAE2均對TopoⅡ有抑制作用。其中，高劑量的美洲大蠊多肽PAE2與索拉非尼相比雖具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P> 0.05），但其抑制效果不如索拉非尼。見圖2、表3。

圖2 美洲大蠊多肽PAE2對TopoⅡ蛋白表達(dá)的影響（× 200）

耐藥細(xì)胞株與敏感細(xì)胞株相比，GST-π蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)（P< 0.05），經(jīng)藥物處理后，GST-π蛋白的表達(dá)量受到了不同程度的抑制（P< 0.05），其中，索拉非尼與高劑量的美洲大蠊多肽PAE2的下調(diào)作用較優(yōu)（P< 0.05），兩者之間的作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；美洲大蠊多肽PAE2的下調(diào)作用呈現(xiàn)出劑量依賴性（P< 0.05）。見圖3、表3。

圖3 美洲大蠊多肽PAE2對GST-π蛋白表達(dá)的影響（× 200）

4 討論

HCC的耐藥機(jī)制較為復(fù)雜，其中包括多藥耐藥酶介導(dǎo)的多藥耐藥性，包括GST-π、PKC、TopoⅡ等〔9〕。PKC是重要的信號分子家族，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、轉(zhuǎn)化和凋亡的作用，并且在腫瘤的促進(jìn)及發(fā)展過程中也參與表達(dá)；GST-π可以保護(hù)細(xì)胞免受細(xì)胞毒性及致癌的危險，被認(rèn)為是腫瘤發(fā)展的標(biāo)志酶，并且在腫瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)；TopoⅡ能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，與惡性腫瘤的進(jìn)程有著密不可分的關(guān)系，并且高表達(dá)于肝癌患者中。

試驗(yàn)證明了美洲大蠊多肽PAE2具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用。通過RT-PCR法在體外的研究結(jié)果表明，與BEL-7402細(xì)胞株相比，在BEL-7402/5-FU細(xì)胞株體外GST-π、PKC、TopoⅡ的mRNA表達(dá)量均明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可以初步確定BEL-7402/5-FU細(xì)胞株產(chǎn)生多藥耐藥性的作用與GST-π、PKC、TopoⅡ高表達(dá)導(dǎo)致藥物外排有關(guān)，從而使藥物攝取不足，細(xì)胞內(nèi)的藥物代謝異常，并且在給藥后均呈現(xiàn)出下降的效果，但美洲大蠊多肽PAE2下調(diào)作用并沒有隨著濃度呈現(xiàn)出劑量依賴的趨勢，并且各劑量組之間的抑制作用也各有不同，這可能與美洲大蠊多肽PAE2對腫瘤細(xì)胞的雙向調(diào)節(jié)作用有關(guān)，提示了腫瘤細(xì)胞活性分子的復(fù)雜性，也可能與美洲大蠊多肽PAE2未達(dá)到有效治療濃度有關(guān)。

在蛋白表達(dá)水平，對于多藥耐藥相關(guān)酶而言，GST-π、TopoⅡ在BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞株中的表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)過不同受試藥物處理后，GST-π、TopoⅡ的表達(dá)量也有所下調(diào)，存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 ；特別是PKC在BEL-7402和BEL-7402/5-FU細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)水平差異明顯，不同受試藥物作用的結(jié)果也相對明顯。本研究表明，對于多藥耐藥相關(guān)酶PCK、GST-π及TopoⅡ，索拉非尼和高劑量的美洲大蠊多肽PAE2的下調(diào)作用相對較優(yōu)；同樣，研究結(jié)果也反映出上述參與細(xì)胞運(yùn)轉(zhuǎn)代謝的酶，對于HCC細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性可能只是存在調(diào)節(jié)，并不一定具有主導(dǎo)作用，在后續(xù)的研究中，需要系統(tǒng)深入地對酶介導(dǎo)的多藥耐藥性作用進(jìn)行進(jìn)一步分析，未來仍需進(jìn)一步尋找上游的調(diào)控靶點(diǎn)，才能更好地為美洲大蠊多肽PAE2的臨床前研究、臨床應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)化提供強(qiáng)有力的依據(jù)。