馮蓉，劉麗*，陳海念，楊勝竹，雷欽卿，丁志峰

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴陽 550025；2.貴州大學(xué)新型肥料資源與技術(shù)研究所，貴陽 550025）

近年來，隨著化學(xué)農(nóng)藥的過度施用，作物農(nóng)藥殘留超標(biāo)，土壤、水源地污染，耕地退化等現(xiàn)象日趨嚴(yán)重。生物防治方法利用微生物及其代謝產(chǎn)物抑制植物病原菌的生長，正逐漸成為一種植物保護新技術(shù)，其因無殘留和環(huán)境友好等優(yōu)點在植物病害防治中占據(jù)越來越重要的地位[1-4]。解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）能夠分泌蛋白類、脂肽類及其次級代謝產(chǎn)物等抗菌物質(zhì)以抑制植物病原菌的生長，是主要的生防菌種之一[5-8]。其抗菌物質(zhì)主要有兩類：一是核糖體途徑合成的抑菌物質(zhì)（如幾丁質(zhì)酶、抗菌蛋白、β-1，3-葡聚糖酶等），二是非核糖體途徑合成的脂態(tài)類物質(zhì)（包括表面活性素、伊枯草素、豐源素等）[7]。這些抑菌物質(zhì)，不僅能使病原真菌菌絲發(fā)生消融、扭曲[9]，還能抑制菌絲的生長及菌核的形成[8]，也能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抑制孢子增生[10-11]，具有耐受性強、抑菌性廣等特點[12]，對病原菌的生長發(fā)育具有高效廣譜的抑制效果。因此，解淀粉芽孢桿菌在植物病害防治中發(fā)揮著重要的作用。

生防菌的生防機理一直是植物病害生物防治的熱點之一，也是其應(yīng)用于生產(chǎn)實踐的必要的理論依據(jù)。目前，大多數(shù)研究集中于討論生防菌的抑菌物質(zhì)分類及鑒定[13-16]，較少討論該類抑菌物質(zhì)的應(yīng)用價值及應(yīng)用的可行性。本課題組前期已篩選、鑒定出一株解淀粉芽孢桿菌F11，本研究分析了該菌株的發(fā)酵液和胞外粗提取液對煙草黑脛病菌等12 種作物病原菌的抑菌效果及其抑菌物質(zhì)，以期從發(fā)酵液和胞外粗提取液兩個方向討論該生防菌快速高效應(yīng)用的可行性，為其在植物病害防治中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試生防菌：解淀粉芽孢桿菌F11，由本課題組在前期研究中從草莓根際土壤中分離篩選所得，其對草莓灰霉病菌具有拮抗性能，對煙草黑脛病菌等12種常見病原菌抑制率均超過79.88%，具有高效、廣譜的抑菌效果[17]。

供試病原菌：水稻稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）、獼猴桃軟腐病菌（Botryosphaeria dothidea）、煙草黑脛病菌（Phytophthora parasiticavar.nicotianae）、煙草炭疽病菌（Colletotrichum nicotianaeAv.）、樟樹炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、高粱斑點病菌（Pseudomonas syringaepv.syringaeVan Hall）、玉蘭炭疽病菌（Colletotrchum magnoliaeCamara）、核盤病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、高粱炭疽病菌[Colletotrichum graminicola（Cesati）Wilson]、玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）、辣椒炭疽病菌（Colletotrichum capsici）、煙草赤星病菌[Alternaria alternata（Freis）Keissler]，共12 種病原菌，均為貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點實驗室惠贈。

1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖（PDA）液體培養(yǎng)基：馬鈴薯200.0 g（去皮切塊煮沸30 min，紗布過濾后得濾液），蔗糖20.0 g，水1 000 mL，pH 自然，1.0×105Pa 滅菌30 min，冷卻后備用。

PDA 固體培養(yǎng)基：在PDA 液體培養(yǎng)基中加入瓊脂15.0 g，1.0×105Pa 滅菌30 min，冷卻后倒平板，備用。

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，加水至1 000 mL，pH 7.2，1.0×105Pa滅菌30 min，冷卻后備用。

NB 固體培養(yǎng)基：在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中加入15.0 g 瓊脂粉，1.0×105Pa 滅菌30 min，冷卻后備用。

1.3 種子菌液的制備

取一環(huán)菌株F11斜面菌苔于NB 固體培養(yǎng)基平板上劃線，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱（GXZ-258A，寧波江南儀器廠）培養(yǎng)24 h后挑取單菌落接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r·min-1振蕩培養(yǎng)24 h 獲得F11種子菌液。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 菌株F11發(fā)酵液濃度對病原菌抑制效果的影響

采用混菌法[18-19]進行試驗。將菌株F11發(fā)酵液原液及5 倍濃縮液（5×C）、10 倍稀釋液（10×）、100 倍稀釋液（100×）、1 000 倍稀釋液（1000×）分別與45 ℃左右的PDA 固體培養(yǎng)基混勻制成平板。每個濃度重復(fù)3次，以無菌培養(yǎng)液為對照。將直徑為7.5 mm 的病原菌菌餅移至培養(yǎng)皿中央，28 ℃培養(yǎng)6～8 d 后測量病原菌菌落直徑（mm），按公式（1）計算F11 對各病原菌的相對抑制率：

1.4.2 菌株F11發(fā)酵液分離

采用酸沉淀和甲醇提取法對發(fā)酵液進行分離[5，20-21]。菌株F11 發(fā)酵液10 000 r·min-1離心5 min，收集上清液，用無菌濾膜（直徑0.22μm，水系）過濾除菌后獲得無菌上清液（上清液A）。將上清液A 倒入滅菌三角瓶中，加入6 mol·L-1的濃鹽酸至pH=2 后取10 mL 液體裝于10 mL 滅菌離心管中，4 ℃靜置24 h，4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，收集沉淀，得到上清液B，并將上清液B的pH調(diào)至7.0，裝入離心管中備用。用分析純甲醇溶解沉淀，向每管沉淀中加入0.5 mL pH 7.0 的甲醇，混勻后于滅菌離心管中萃取8 h，12 000 r·min-1、4 ℃離心20 min，得上清液1。同樣方法萃取2 次，分別得上清液2、3，合并上清液1、2、3 于滅菌離心管中，保留上清液，用無菌濾膜（直徑0.22μm，有機系）過濾除菌后獲得代謝物粗提液。發(fā)酵液分離所得的上清液A、上清液B 及代謝物粗提液于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.3 菌株F11發(fā)酵液抑菌物質(zhì)分析

采用牛津杯法檢測菌株F11 發(fā)酵液的3 種分離液的抑菌效果。用打孔器（直徑7.5 mm）取病原菌菌塊，將其放置于PDA 平板中央，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，在距病原菌塊四周2.5 cm 處放置無菌牛津杯，每個牛津杯中加入100μL 無菌上清液A，以pH 7的過濾除菌的培養(yǎng)基作對照，重復(fù)3 次，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d 后記錄病原菌受抑制情況，測量抑菌圈半徑。用同樣的方法檢測上清液B 和代謝物粗提液的抑菌活性，重復(fù)3 次。其中上清液B 的對照為鹽酸酸化離心調(diào)回初始酸度的培養(yǎng)液，代謝物粗提液的對照為過濾除菌的甲醇。上清液A、上清液B 及代謝物粗提液中抑菌效果最好的分離液的抑菌情況用顯微鏡進行觀察。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2013 對試驗數(shù)據(jù)進行整理、分析并作圖，采用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)V14.0（杭州睿豐信息技術(shù)有限公司）對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（F11 發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)對病原菌的抑菌效果，Duncan 法）和t檢驗（上清液A 和粗提液對四種病原菌的抑菌圈半徑的影響）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株F11發(fā)酵液濃度對抑菌率的影響

不同稀釋濃度的菌株F11 發(fā)酵液與12 種供試病原菌的拮抗試驗結(jié)果表明，對菌株F11發(fā)酵液進行適當(dāng)稀釋均能獲得良好的抑菌效果。以玉米大斑病菌（Setosphaeria turcica）和煙草黑脛病菌（P.parasiticavar.nicotianae）為例（圖1），當(dāng)對照玉米大斑病病原菌長滿平板時，1 000×處理的病原菌長了約4/5個平板，100×、10×、原液和5×C處理的病原菌仍保持接種時的大??；當(dāng)煙草黑脛病病原菌長滿平板時，1 000×處理無明顯抑菌效果，但其余稀釋處理抑菌效果均十分明顯，尤其是10×、原液和5×C 處理，三者病原菌大小與接種時無異。

圖1 菌株F11發(fā)酵上清液不同稀釋倍數(shù)對玉米大斑病病原菌（a）和煙草黑脛病病原菌（b）生長的影響Figure 1 Effects of different dilution fractions of fermentation supernatant of F11 on the growth of Setosphaeria turcica（a）and Phytophthora parasitica var.nicotianae（b）

菌株F11 對不同植物病原菌的抑菌率如表1 所示。F11 發(fā)酵液對于樟樹炭疽病菌（C.gloeosporioides）的抑菌效果最好，不同稀釋倍數(shù)間抑制效果無顯著差異，1 000 倍稀釋液的相對抑菌率依然達到100%。除樟樹炭疽病菌外，發(fā)酵液濃度對其余11 種病原菌的抑菌效果有顯著影響（P＜0.05）。與發(fā)酵液原液相比，隨著稀釋倍數(shù)的增加，各病原菌直徑都逐漸增大，相對抑制率逐漸下降，而5 倍濃縮液和原液之間無顯著差異。此外，從煙草黑脛病菌、核盤病菌、玉米大斑病菌、獼猴桃軟腐病菌的結(jié)果可以看出，10倍稀釋液與發(fā)酵原液的相對抑制率差異也未達顯著水平?？梢姡趯煵莺诿劜【?、核盤病菌、玉米大斑病菌、獼猴桃軟腐病菌進行防治時，利用10 倍稀釋液即可達到良好的防治效果，而對樟樹炭疽病菌防治時，1 000倍稀釋液也可達到良好的防治效果。

表1 F11發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)對病原菌的相對抑制率（%）Table 1 Relative inhibition rate of different dilution ratios of F11 fermentation broth on pathogenic bacteria（%）

2.2 菌株F11發(fā)酵上清液及粗提液的抑菌活性

根據(jù)拮抗情況和相對抑制率分析結(jié)果，選取獼猴桃軟腐病菌、煙草炭疽病菌、玉米大斑病菌及樟樹炭疽病菌4種病原菌進行了F11發(fā)酵液3種分離液抑菌活性的進一步分析。結(jié)果（圖2）顯示，上清液A 和粗提液對上述4 種病原菌有不同程度的抑菌效果，而經(jīng)上清液A 酸化離心后得到的上清液B 并沒有抑菌效果。可見菌株F11 發(fā)酵液的上清液A 和粗提液中均含有可以抑制病原菌生長的物質(zhì)，而上清液B中不含有此類物質(zhì)。由此可推斷，F(xiàn)11 的抑菌活性物質(zhì)并非細(xì)菌菌體本身，而是一種不溶于酸的蛋白類或脂肽類胞外代謝物。

圖2 菌株F11的上清液A、上清液B和粗提液對獼猴桃軟腐病菌（a）、煙草炭疽病菌（b）、玉米大斑病菌（c）、樟樹炭疽病菌（d）的抑菌拮抗效果Figure 2 Antibacterial and antagonistic effects of liquid A，B and crude extracts of strain F11 on Botryosphaeria dothidea（a），Colletotrichum nicotianae Av.（b），Setosphaeria turcica（c），Colletotrichum gloeosporioides（d）

上清液A 和粗提液的抑菌圈半徑比較結(jié)果如圖3 所示。上清液A 和粗提液對獼猴桃軟腐病、玉米大斑病和樟樹炭疽病3 種病原菌的抑制圈半徑表現(xiàn)出顯著差異（P＜0.05），且均表現(xiàn)為粗提液的抑制效果優(yōu)于上清液A，這可能與上清液A 和粗提液抑菌物質(zhì)濃度不一致（粗提液中抑菌物質(zhì)濃度約為上清液A 的5倍）或二者的物質(zhì)類型差異有關(guān)，但二者對煙草炭疽病菌的抑制效果并未表現(xiàn)出顯著差異。總體而言，二者對各病原菌的抑菌圈半徑超過1.0 cm，表現(xiàn)出較好的抑制效果。由此可見，粗提液中的抑菌物質(zhì)是上清液A 所含抑菌物質(zhì)的主要組成部分，對上清液A 抑菌效果起著重要的作用，該類物質(zhì)對獼猴桃軟腐病菌、玉米大斑病菌、煙草炭疽病菌及樟樹炭疽病菌均表現(xiàn)出良好的抑制效果。在不進行抑菌物質(zhì)提取的情況下，利用無菌體的上清液A進行生物防治也可達到較好的效果。

圖3 上清液A和粗提液對四種病原菌的抑菌圈半徑Figure 3 The bacteriostatic ring radius of liquid A and crude extract against four pathogens

2.3 粗提液對病原菌菌絲的影響

菌株F11 發(fā)酵液胞外代謝物粗提液的抑菌結(jié)果表明4 種病原菌菌落生長明顯受到抑制，菌株F11 對病原菌有較好的抑制效果。抑菌圈邊緣病原菌菌絲的鏡檢結(jié)果如圖4 所示。正常狀態(tài)下，各病原菌菌絲體正常生長，菌絲體平滑、均勻、細(xì)長；粗提液處理后，受抑制的病原菌菌絲均表現(xiàn)出明顯的變形：獼猴桃軟腐病菌菌絲體變得粗大、彎曲、形成分隔（圖4b），煙草炭疽病菌菌絲體內(nèi)原生質(zhì)聚集成塊、生長受到抑制（圖4d），玉米大斑病菌菌絲則出現(xiàn)大泡囊、斷裂、畸形溶解（圖4f），樟樹炭疽病菌菌絲發(fā)生扭曲、蜷縮、纏繞，并出現(xiàn)泡囊（圖4h）。

圖4 粗提液對四種病原菌菌絲形態(tài)的影響Figure 4 Effect of crude extract on mycelial morphology of four pathogens

3 討論

近年來，生物防治技術(shù)已成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中植物病害防治的一項重要措施，探究其生防機理對植物病害防治具有重要意義。大量研究表明，生防菌株對植物病害的防治效果明顯。王奕文等[22]從甜瓜表面分離到1 株解淀粉芽孢桿菌，該菌株對灰葡萄孢、尖孢鐮刀菌、黑曲酶等8 種果蔬采后病原真菌具有廣譜的拮抗作用。本課題組前期研究指出菌株F11 對核盤病、煙草炭疽病等12 種植物病原菌的抑菌率均超過79.88%，表現(xiàn)出高效、廣譜的抑菌效果[17]。本研究對解淀粉芽孢桿菌F11 的生防機理進行了進一步探討。結(jié)果表明，F(xiàn)11 發(fā)酵液不同稀釋倍數(shù)對不同病原菌的抑菌效果不盡相同。與發(fā)酵原液相比，研究中涉及的稀釋倍數(shù)基本不影響該菌株對樟樹炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）的抑制效果，即使稀釋1 000倍其抑菌率依然達到100%；而對其他病原菌的抑制效果則表現(xiàn)為隨著稀釋倍數(shù)的增加，抑菌率逐漸降低，但10 倍稀釋液對煙草黑脛病菌、核盤病菌、玉米大斑病菌、獼猴桃軟腐病菌四種病原菌的抑制率仍達100%，100 倍稀釋液對玉米大斑病菌的抑制率也達80%。說明菌株F11 的發(fā)酵液在不同稀釋倍數(shù)下抑菌效果存在著一定的差異，對上述4 種病原菌而言，其10 倍稀釋液可達到原液的抑制效果，因此稀釋10倍有望實現(xiàn)菌株F11發(fā)酵液應(yīng)用增值保效的目的。該結(jié)果與陳士云等[8]研究結(jié)果一致，其研究也指出解淀粉芽孢桿菌CH-2 稀釋10 倍后對油菜核盤病仍具有強烈的抑制作用。

芽孢桿菌屬（Bacillus）能夠產(chǎn)生大量潛在的抑制植物病原菌生長的生物活性分子，對逆境具有較強的抵抗力，因而被廣泛應(yīng)用于植物病害防治之中[23]。此外它還能夠分泌蛋白類、脂肽類和次級代謝物等抗菌物質(zhì)來抑制有害病原物的生長，是一類重要的生防菌種[24]。柴慶凱等[25]研究表明，解淀粉芽孢桿菌LJ02能通過分泌β-1，3-葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等胞外物質(zhì)抑制黃瓜灰霉病，抑制率達44.26%。汪靜杰等[24]研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌SWB16 粗提物中的芬枯草素、伊枯草素等脂肽類抗菌物質(zhì)能抑制球孢白疆菌的發(fā)生。也有研究表明，解淀粉芽孢桿菌的粗提液中所含的嗜鐵素、伊枯草素、豐源素、酶、酸等物質(zhì)能破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，抑制孢子增生，防治番茄灰霉病和青枯病[10-11]。此外，解淀粉芽孢桿菌還能產(chǎn)生環(huán)二肽等次級代謝產(chǎn)物，抑制植物病原菌的形成[26]。本研究對菌株F11 發(fā)酵液進行分離得到發(fā)酵上清液A（發(fā)酵液離心所得）、上清液B（經(jīng)上清液A 酸化離心所得）和胞外代謝物粗提液，三種分離液對獼猴桃軟腐病、煙草炭疽病、玉米大斑病及樟樹炭疽病等病原菌的抑制試驗得到了一致的結(jié)論。結(jié)果表明，上清液A和粗提液對受試病原菌具有良好的抑制作用，而上清液B對受試病原菌并無抑制作用?？梢娋闒11 發(fā)酵液的上清液A 及粗提液均含有抑制病原菌生長的物質(zhì)，但上清液B中并不含有該物質(zhì)，說明菌株F11是通過分泌胞外代謝抑菌物質(zhì)來拮抗、抑制病原菌生長，該物質(zhì)不溶于酸，根據(jù)劉文波等[27]和程敏等[28]的相關(guān)研究，進一步推測該物質(zhì)為蛋白類或脂肽類胞外代謝物。鏡檢結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)，該胞外代謝活性物質(zhì)還能夠造成該病原菌菌絲消融、溶解、斷裂、扭曲，原生質(zhì)體凝集滲漏、形成泡囊結(jié)構(gòu)，菌絲體扭曲纏繞變形等。該現(xiàn)象與郭金鵬等[9]和鄧建良等[21]的研究結(jié)果類似，前者指出芽孢桿菌HSY-8-1 及其分泌物能使立枯病菌和根腐病菌的菌絲發(fā)生消融、扭曲、分枝及形成泡狀物等現(xiàn)象，且對酸、堿等環(huán)境具有較強的耐受性，該特性與脂肽抗生素相一致；后者則通過定性和定量分析指出解淀粉芽孢桿菌YN-1 的粗提液中能夠產(chǎn)生使棉花枯萎病菌菌絲消融變細(xì)，菌絲體扭曲變形、形成泡囊結(jié)構(gòu)的抑菌活性物質(zhì)C16Iturin A、C14Fengycin A 等9種脂肽抗生素。因此，進一步推測菌株F11的胞外代謝抑菌物質(zhì)為脂肽抗生素類，但其具體種類還有待進一步分析研究。綜上可見，菌株F11 具有高效、廣譜的抑菌效果，具有作為生防菌株的潛能。

4 結(jié)論

（1）解淀粉芽孢桿菌F11 對煙草炭疽病等12 種病原菌均具有良好的防治效果，其對樟樹炭疽病的防治效果最好，發(fā)酵液經(jīng)1 000 倍稀釋后防治效果仍達100%，對煙草黑脛病菌、核盤病菌、玉米大斑病菌、獼猴桃軟腐病菌四種病原菌則可以用10 倍稀釋液代替發(fā)酵原液。

（2）菌株F11 對病原菌產(chǎn)生抑制作用的物質(zhì)并非細(xì)菌本身，而是由其產(chǎn)生的脂肽類胞外代謝物，該胞外代謝物能抑制病原菌菌絲生長，使其發(fā)生消融、斷裂、扭曲等現(xiàn)象。