陳言偉，毋琦，楊曉鵬，丁金璽，佟建燁，李 浩，李啟萌，郭殊君

（1.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八九醫(yī)院檢驗科，河南 平頂山 467000；2.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九八九醫(yī)院，病理科；河南 平頂山 467000；3.平煤神馬醫(yī)療集團總醫(yī)院檢驗科，河南 平頂山 467000）

脂血既是生理現(xiàn)象也是病理現(xiàn)象，血常規(guī)是臨床常規(guī)檢測和急診檢測項目，標本沒有要求空腹采集，其脂血發(fā)生率較高，我們更應該關注脂血標本對血常規(guī)結果的影響。脂血標本對血小板計數特別是光學法血小板計數(platelet-Optical count,PLT-O)的影響罕見報道，更缺乏系統(tǒng)的數據分析。筆者工作中發(fā)現(xiàn)兩例血小板減少同時輸注脂肪乳注射液（C14-24）的患者，多次PLT-O、阻抗法血小板計數(platelet-Impedance count,PLT-I)檢驗結果與臨床不符，且同一標本PLT-O、PLT-I 結果相差甚大[1]，初步考慮脂類物質輸入體內后在某個時間段干擾了PLT-O、PLT-I的計數結果。為了進一步深入研究，我們模擬脂肪乳注射液在體內的代謝環(huán)境和濃度，分別于不同時間段對模擬脂血標本進行分析，觀察PLT-O、PLT-I計數結果隨時間延長的變化，同時與對照組比較，分析脂血對血小板計數及其形態(tài)的影響，報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2019年5 月17 日本院體檢中心5 名血型相同的健康體檢人員。受試對象肝功能、腎功能、血脂及血糖等各指標正常，血小板結果PLT-I和PLT-O 均在130～300×109/L 之間，血細胞計數參數均在參考區(qū)間。清晨空腹各采集EDTA-K2 抗凝血2ml。

1.2 儀器與試劑 血小板計數使用日本Sysmex 公司XT-4000i型全自動血細胞分析儀及原裝配套試劑、質控物，血細胞分析儀每半年校準1 次，且校準合格，每日測定3 個水平原廠配套質控品，室內質控在控。使用日本OLYMPUS CX-21 顯微鏡觀察血小板形態(tài)，ABO、RhD 血型定型檢測卡及抗人球蛋白檢測卡（交叉配血用）購于長春博迅生物技術有限責任公司。瑞氏-姬姆薩染液按照《全國臨床檢驗操作規(guī)程》第4 版配制后備用[2]，由中級職稱以上形態(tài)學老師定期就染液對血涂片實際染色效果進行評價；蘇丹Ⅲ、蘇木精-伊紅染液按照《臨床技術操作規(guī)范·病理學分冊》 第1 版配制后備用[3],以腸系膜脂肪組織的冰凍切片做陽性對照。脂肪乳注射液（C14-24）由安徽豐原藥業(yè)股份有限公司提供,國藥準字H34023480,批號：2118120301。

1.3 方法 將符合要求的5例標本混合均勻(混勻后排除脂血、溶血、黃疸對檢測的影響),共計10ml?；旌蠘颖窘徊媾溲z測無凝集、無溶血、相合。取1.8ml 混合標本加入100μl 原裝稀釋液EPK，立即連續(xù)上機檢測3 次，記錄PLT-I、PLT-O 結果，分別取均值作為對照組I和對照組O 血小板計數結果。根據常永紅等[4]報道，血小板計數隨放置時間變化較小，故取此次計數結果作為所有時間點觀察組結果的對照。提取7.2ml 混合標本按照說明書配比添加400μl 脂肪乳注射液（C14-24）與其充分混合作為實驗組。將實驗組樣本37°水浴箱孵育，每60min 顛倒混勻5 次，每間隔2 小時分別以PLT-O和PLT-I 方法用全自動血細胞分析儀的CBC+DIFF+RET 模式計數血小板3 次并取均值，22h 內共檢測12 次。記錄所有時間段PLT-I和PLT-O 數值。每個時間點檢測后立即推兩張血片，選擇結果最高的時間點的血片染色，一張進行瑞氏-姬姆薩染色，另一張甲醛固定后先用蘇丹Ⅲ初染，再用蘇木精-伊紅復染，分別鏡檢觀察。另用全自動血細胞分析儀的CBC+DIFF+RET 模式對脂肪乳注射液（C14-24）原液計數血小板3 次取均值并記錄PLT-I、PLT-O 數值，并分析其直方圖與散點圖情況。

1.4 統(tǒng)計學處理 統(tǒng)計結果采用平均值±標準差的方式表示,使用OriginPro 9.0 進行t-檢驗單因素方差分析（ANOVA），以P＜0.05 為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 脂血標本血小板計數結果的影響 結果顯示各個時間段脂血標本血小板計數結果與對照組結果差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見表1。其中PLTO 組各時間段之間的差異只有0h與2h 之間結果無統(tǒng)計學意義（P=0.285），其余各時間段之間的結果差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1A 所示。而PLT-I 組從0h 到8h 血小板計數逐漸升高，時間點間血小板計數有統(tǒng)計學差異，8h 到16h 時間段血小板計數無顯著變化（P>0.05），見圖1B。

圖1 脂血標本血小板計數隨時間變化

表1 不同時間段脂血標本PLT-O、PLT-I結果與對照組結果比較（均值±標準差）

2.2 脂血標本血小板鏡下形態(tài)觀察在血小板結果最高點PLT-O 1362×109/L、PLT-I 442×109/L 時，即20h 進行推片瑞氏-姬姆薩染色見圖2A，蘇丹Ⅲ、蘇木精-伊紅染色結果見圖2B。由圖片可見，雖然儀器報警有RBC 碎片、血小板聚集，但鏡下均未查見紅細胞溶解、碎片及白細胞碎片，血小板也未見聚集現(xiàn)象。圖2A 中可見大量大小不一的類血小板顆粒物質，蘇丹Ⅲ、蘇木精-伊紅染色結果圖2B中可見脂類物質著色良好，形態(tài)大小與血小板相似。

圖2 脂血標本對血小板鏡下形態(tài)觀察

2.3 脂血標本及脂肪乳注射液（C14-24）原液血小板計數直方圖及散點圖 脂血標本血小板計數的直方圖及散點圖如圖3A 所示（僅展示計數最高點圖形），脂血標本PLT-O和PLT-I 血小板計數在第20h 時分別為1362×109/L和442×109/L，脂肪乳注射液（C14-24）原液PLT-O和PLT-I 血小板計數分別為170×109/L和102×109/L；此外，脂血標本的“血小板”在圖形的橫坐標上熒光強度較弱，且分布集中、偏左，其左側的熒光部分基本與脂肪乳散點圖的熒光部分重疊?？梢娭救閷LT-O和PLT-I 血小板計數均有影響，并且對于PLT-O計數結果的影響要大于PLT-I計數結果。

圖3 脂血標本(A)及脂肪乳注射液（C14-24）原液(B)血小板計數直方圖及散點圖

3 討論

我們在工作中對低值血小板和假性血小板減少關注較多，而且常將PLT-O 作為異常PLT-I的復檢方法[5,6]。由于臨檢工作量大，有的實驗室應用了自動審核系統(tǒng)，如果復檢規(guī)則設置的不全面，很難實現(xiàn)對散點圖和直方圖逐一審核。日常工作中對正常值血小板結果審核發(fā)送不是十分嚴謹，正常值也可能是個假象,低值血小板的假性正?；蛘呱邥砀訃乐氐暮蠊?特別是手術患者出血風險明顯增加[7,8]。所以我們在關注低值血小板的同時更應該關注低值血小板假性正常和假性增高的病例。表1 中可見脂肪乳加入后立即檢測PLT-O和PLT-I 均明顯增高，與對照組結果差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且兩者各個時間段結果與對照組結果差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。圖1A 中可知PLT-O 結果在0h 至2h 時間段較穩(wěn)定，結果增高不明顯，隨著時間的延長脂類物質逐漸被代謝成類似血小板大小的顆粒物質，計數結果顯著增高，于20h 到達峰值1362×109/L，是對照組結果的7.5 倍之多。圖1B 中可見隨著時間的延長PLT-I結果增高幅度沒有PLT-O 明顯，同時也在20h 達到峰值PLT-I 442×109/L，也是對照組結果的2.3倍。兩種檢測原理對PLT 結果的影響都非常顯著，如果是低值血小板患者必定會誤導臨床造成嚴重的后果。

PLT-O 結果隨著時間的延長遠高于PLT-I的結果，我們分析認為：PLT-I 結果對血小板體積大小敏感，大血小板或者說顆粒物質平均體積大于12.1fl 時會造成結果偏低,另外SysmexXT-4000i 血細胞分析儀器檢測PLT的下限鑒別線浮動界標為2-6fl 之間，即小于6fl的顆粒物質有可能也不會計數在內[9]。而PLT-O的檢測原理是從血小板質的角度對血小板進行染色計數，彌補了阻抗法許多弊端[10]，而且近年來的研究報道證明了PLT-O在血細胞分析中的價值，已經常規(guī)用于對PLT-I 檢測異常結果的復檢[11,12]。但是PLT-O的檢測原理的優(yōu)越性也決定了它的弊端[13]。比如圖3A 中PLT-O 散點圖與脂肪乳的散點圖圖3B對比可以得到驗證，脂血標本的“血小板”在圖形的橫坐標上熒光強度較弱，且分布集中、偏左，其左側的熒光部分基本與脂肪乳散點圖的熒光部分重疊。進而說明這些沒有被PLT-I計數進去的脂類顆粒被PLT-O 當作血小板進行了計數，從而造成脂血標本中PLT-O比PLT-I 結果假性增高更加顯著。

圖3A 中可見儀器RBC/RET 報警區(qū)提示“碎片？”，同時也為了觀察假性增高是否由于隨著放置時間的延長，造成WBC 崩裂或/和RBC 破碎影響PLT計數[13,14]，于是在血小板結果最高點PLT-O 1362×109/L、PLT-I 442×109/L，即20h 推片兩張染色鏡檢，瑞氏-姬姆薩染色如圖2A，紅細胞形態(tài)完整無紅細胞碎片、白細胞裂解物質等著色的類血小板顆粒物質。另外RBC計數并未減少，而且WBC計數隨著時間的延長不但沒有降低反而有所增高，對照組WBC計數為6.37×109/L，實驗組0 時WBC6.49×109/L，至血小板計數最高點20 時WBC計數為13.27×109/L，WBC Flag（s）提示“幼稚粒細胞？、難溶紅細胞？”等，散點圖異常（原因有待進一步探討）?？梢哉f明PLT-O和PLT-I的增高并非RBC和WBC的影響。同時圖2B 中可見大量不著色、形態(tài)大小類似血小板的顆粒物質，疑似脂類物質，且這些形態(tài)大小類血小板顆粒物質被蘇丹Ⅲ染為紅色。由此推測RBC/RET 報警提示的“碎片？”也是由此類物質所致。本文從金標準形態(tài)學上證實了脂血標本對血小板計數的影響，尤其對PLT-O 結果影響更為顯著。由于PLT-O計數血小板原理主要是依據細胞通過核酸熒光染色后的光散射差異區(qū)別血小板和其他類血小板顆粒物質，從而明確了PLT-O 增高的原因在于脂類物質在體內分解代謝成相當于PLT 體積大小，經核酸熒光染料RET-SEARCH(Ⅱ)染色呈現(xiàn)與血小板類似的熒光強度，因此被儀器誤認成血小板進行計數[15]。

綜上所述，血常規(guī)標本沒有嚴格要求空腹采血而且不能離心，脂血標本相對較多且不易發(fā)現(xiàn)，對結果的影響很容易被忽視。脂血標本代謝的不同時間段對阻抗法和光學法均有顯著的影響，病情允許的情況下建議空腹采血，特別是對于既往血小板減少癥的患者強烈推薦空腹采血，需要長期監(jiān)測對照的患者盡量控制在同一時間采血。在審核儀器分析結果時懷疑有脂血等干擾的標本，必要時行等量血細胞稀釋液置換，或者手工復核。