劉少榮 楊 揚 田紅麗 易紅梅 王 璐 康定明 范亞明 任 潔 江 彬 葛建镕 成廣雷,* 王鳳格,*

1 北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米研究中心 / 玉米DNA指紋及分子育種北京市重點實驗室, 北京 100097; 2 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 北京100193

玉米是中國重要的糧飼兼用作物, 2019年種植面積為4128萬公頃[1], 超過稻谷和小麥, 位居農(nóng)作物第一。隨著中國糧改飼產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整及畜牧業(yè)發(fā)展, 飼用玉米, 特別是青貯玉米的種植面積在逐步擴大, 為畜牧業(yè)供給充足的優(yōu)質(zhì)飼料[2]。青貯玉米作為優(yōu)質(zhì)飼料, 具有產(chǎn)量高、品質(zhì)好、飼用價值高等特點, 已在畜牧業(yè)發(fā)展、生態(tài)環(huán)境保護(hù)、農(nóng)業(yè)增收中占有不可或缺的地位, 大力開展青貯玉米的品種選育是解決當(dāng)下畜牧業(yè)迅速發(fā)展帶來的飼料缺乏問題的有效途徑[3]。然而中國青貯玉米研究起步較晚,雖然審定了不少品種, 但對這些品種的遺傳來源并不清楚, 所以亟需摸清我國青貯玉米品種遺傳背景現(xiàn)狀。近年來, 對青貯玉米的研究主要集中在高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)[4-5]、生態(tài)適應(yīng)性[6-8]和配套栽培技術(shù)[9-10]等方面,關(guān)于青貯玉米遺傳多樣性分析的報道不多。

遺傳多樣性分析是作物種質(zhì)資源研究的一種重要手段, 旨在了解和掌握不同品種之間的遺傳差異,為推動植物育種與遺傳改良奠定基礎(chǔ)。遺傳多樣性分析可以從形態(tài)學(xué)性狀和分子標(biāo)記2個方面進(jìn)行,形態(tài)學(xué)性狀是從植物的表型性狀來區(qū)分品種差異,分子標(biāo)記是通過遺傳物質(zhì)反映品種間遺傳變異程度[11]。迄今為止, 形態(tài)學(xué)性狀已被廣泛應(yīng)用到玉米[12]、谷子[13]、水稻[14]、馬鈴薯[15]等農(nóng)作物的遺傳多樣性研究中。在利用形態(tài)學(xué)性狀對青貯玉米品種進(jìn)行遺傳多樣性研究方面, 柴華[16]用10個形態(tài)學(xué)標(biāo)記將36個青貯玉米自交系劃分為五大類, 為選育優(yōu)質(zhì)青貯玉米品種提供依據(jù); 吳建忠等[17]基于22個品質(zhì)性狀對14個青貯玉米品種進(jìn)行遺傳變異分析, 發(fā)現(xiàn)脂肪、木質(zhì)素和淀粉的變異系數(shù)較大, 分別為20%、19%和16%, 為青貯玉米的品質(zhì)改良提供了參考。SSR標(biāo)記具有檢測簡便快捷、多態(tài)性高和重復(fù)性好等優(yōu)點, 被迅速推廣應(yīng)用。李齊向等[18]采用23對SSR標(biāo)記對4個代表國內(nèi)主要雜種優(yōu)勢群的普通玉米品種和65個青貯玉米自交系進(jìn)行聚類分析, 將大部分未知系譜來源的青貯玉米劃分為Lancaster群、旅大紅骨類群、塘四平頭群和Reid群, 初步明確了其系譜來源。

國內(nèi)外關(guān)于玉米遺傳多樣性的研究, 主要聚集在種質(zhì)資源多樣性評價、雜種優(yōu)勢群劃分等方面,而針對青貯玉米品種遺傳多樣性的評估鮮有報道。本研究對141個來源于2002—2020年國家及各省區(qū)(市)審定的青貯玉米品種, 基于其13個農(nóng)藝及品質(zhì)性狀和40個SSR標(biāo)記, 并結(jié)合品種來源的生態(tài)區(qū),進(jìn)行了遺傳多樣性分析, 以了解各生態(tài)區(qū)青貯玉米品種的農(nóng)藝、品質(zhì)性狀及遺傳分化特點, 為青貯玉米的新品種選育及推廣種植提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料選自2002—2020年通過國家及各省區(qū)(市)審定的141個青貯玉米雜交種。參照2016年國家青貯玉米品種區(qū)域試驗的生態(tài)組別劃分, 并結(jié)合播種區(qū)域、播種時間、品種類型和選育單位等因素將供試品種劃分為4個生態(tài)區(qū), 分別為東華北區(qū)、黃淮海區(qū)、西北區(qū)和南方區(qū), 詳細(xì)品種審定來源及生態(tài)區(qū)分布見表1。農(nóng)藝及品質(zhì)分析材料: 在141個青貯玉米品種中, 有19個品種具有多個生態(tài)區(qū)或年份審定來源, 其中13個品種具有2個審定來源, 3個品種具有3個審定來源, 3個品種具有4個審定來源,即青貯玉米樣品由141個擴增到169個。SSR標(biāo)記分析材料: 包括141個青貯玉米品種和5個普通玉米品種(德美亞1號、鄭單958、蘇玉29、先玉335、農(nóng)大108)。從試驗材料中選用5個國家或省區(qū)(市)級青貯玉米區(qū)試對照品種(雅玉青貯8號、雅玉青貯26、大京九26、京九青貯16、桂青貯1號)、2個推廣面積較大的糧飼兼用品種(中玉335、京科968)和5個國家普通玉米區(qū)試對照品種作為參考對照。

表1 樣品信息統(tǒng)計Table 1 Sample information statistics

1.2 試驗方法

1.2.1 農(nóng)藝及品質(zhì)性狀 農(nóng)藝及品質(zhì)數(shù)據(jù)均來自于國家及各省區(qū)(市)青貯玉米審定公告, 其中包括13個性狀, 分別為生育期、株高、穗位高、綠葉數(shù)、穗長、穗行數(shù)、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、淀粉、干重、鮮重和種植密度。凱氏定氮法測定粗蛋白含量, 旋光法測定淀粉含量, Van Soest法測定中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量, 具體步驟參見GB/T25882-2010[19], 其他性狀測定方法參見審定公告。

1.2.2 SSR標(biāo)記 采用的40對SSR引物, 均為玉米品種鑒定行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中發(fā)布的引物, 具有多態(tài)性好,均勻分布在玉米的10條染色體上的特征, 具體引物名稱、序列及片段長度等信息參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[20-21]。

1.2.3 DNA制備和SSR基因分型 采用改良CTAB法[22]提取供試材料基因組DNA, DNA濃度和質(zhì)量用紫外分光光度計(Nanodrop 2000)測定, 根據(jù)測量值調(diào)節(jié)工作液濃度。SSR-PCR體系: 反應(yīng)液總體積為20 μL, 包括2×TaqPlus Master Mix 10 μL,ddH2O 7.75 μL, 引物0.25 μL和DNA樣品2 μL。PCR程序: 預(yù)變性95℃ 5 min;變性94℃ 40 s,退火60℃35 s, 延伸72℃ 45 s, 35個循環(huán); 延伸72℃ 10 min;4℃保存。PCR產(chǎn)物檢測: 采用10重PCR產(chǎn)物電泳檢測的方法。向96孔電泳板的單個孔中分別加入2 μL 10重PCR的混合產(chǎn)物、10 μL含有1% GS3730-500分子量內(nèi)標(biāo)的甲酰胺。將上述混合樣品放入PCR儀中95℃變性5 min, 4℃保存10 min, 2000轉(zhuǎn) min–1離心30 s后, 于ABI 3730XL DNA分析儀上進(jìn)行熒光毛細(xì)管電泳。預(yù)電泳時間2 min, 15 kV, 電泳時間30 min, 15 kV, 電泳原始數(shù)據(jù)由Data Collection軟件收集, 用SSR Analyser (v1.2.4)指紋分析器[23]對電泳數(shù)據(jù)基因分型分析。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 25軟件對農(nóng)藝及品質(zhì)數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值、標(biāo)準(zhǔn)差和極值的統(tǒng)計, 并進(jìn)行方差分析; 利用Microsoft Excel 2016計算變異系數(shù)和Simpson多樣性指數(shù)。基于R語言scale函數(shù)對農(nóng)藝及品質(zhì)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理, 再利用dist函數(shù), 選擇“euclidean”方法計算出品種間的歐式距離。將上述品種間的歐式距離矩陣導(dǎo)入PowerMarker V3.25[24]軟件得到農(nóng)藝及品質(zhì)性狀NJ (Neighbor-Joining)聚類結(jié)果,結(jié)合MEGA7[25]軟件繪制聚類圖。采用Power Marker V3.25軟件對SSR基因型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計算不同生態(tài)區(qū)品種的等位變異數(shù)、基因型數(shù)、基因多樣性、雜合度和PIC值。同時基于Nei’s(1973)方法計算品種間的遺傳距離, 得到SSR標(biāo)記NJ聚類結(jié)果, 結(jié)合MEGA7軟件繪制聚類圖?；跉W式距離矩陣和遺傳距離矩陣, 選用多變量統(tǒng)計分析軟件MVSP V3.22[26]對品種進(jìn)行主成分分析并繪制PCA圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 農(nóng)藝及品質(zhì)性狀遺傳多樣性分析

對169個青貯玉米樣品的13個農(nóng)藝及品質(zhì)性狀進(jìn)行了描述性統(tǒng)計(表2), 各性狀存在不同程度的變異, 變異系數(shù)分布在10.30%~30.31%之間,平均為16.01%, 其中干重和酸性洗滌纖維的變異系數(shù)超過20%, 其他性狀變異系數(shù)在10%~20%之間。Simpson多樣性指數(shù)的變化區(qū)間在0.50~0.71, 平均為0.60,穗長多樣性指數(shù)最高, 粗蛋白多樣性指數(shù)最低。在青貯玉米品質(zhì)性狀中, 粗蛋白和酸性洗滌纖維表現(xiàn)出較豐富的遺傳多樣性。

表2 169個樣品的農(nóng)藝及品質(zhì)性狀特征Table 2 Agronomic and quality characteristics of 169 samples

基于13個農(nóng)藝及品質(zhì)性狀對供試品種進(jìn)行聚類分析, 從圖1-A可知, 169個青貯玉米樣品可被劃分為5個組, 大部分樣品聚集在X3、X4組。X1組包括以桂青貯1號為代表的19個樣品, X2組包括以中玉335為代表的13個樣品, X3組包括以京九青貯16、京科968及雅玉青貯8號為代表的72個樣品, X4組包括以大京九26為代表的45個樣品, X5組包括以雅玉青貯26為代表的20個樣品。對農(nóng)藝及品質(zhì)性狀聚類組群進(jìn)行主成分分析(圖1-B), 根據(jù)5個聚類組群的具體分布情況將坐標(biāo)圖劃分為I、II、III、IV四個區(qū)域, 從整體上來看, 各組群分布均相對集中, X1、X5組分布在I、III區(qū), 但主要集中在III區(qū),X2組主要分布在I區(qū), X3組主要分布在I、II區(qū), X4組分布在III、IV區(qū)。各組群坐標(biāo)分布結(jié)果與聚類分組結(jié)果基本一致。

2.2 SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析

40對SSR引物在141個青貯玉米品種中共檢測到482個等位變異, 每對引物等位變異數(shù)量范圍為3~27個, 平均為12.05個; 基因多樣性的變化范圍為0.29~0.90, 平均為0.71; 雜合率的變化范圍為0.27~0.94, 平均為0.68; PIC的變化區(qū)間為0.27~0.88, 平均為0.68。

以普通玉米為參考對照, 分析青貯玉米品種的遺傳背景, 對141個青貯玉米品種和5個普通玉米品種進(jìn)行聚類分析(圖2-A), 供試品種被劃分為5個組。S1組包括以雅玉青貯28、雅玉青貯8號和德美亞1號為代表的33個品種, S2組包括以大京九26為代表的24個品種, S3組包括以京科968和鄭單958為代表的14個品種, S4組包括以京九青貯26、蘇玉29和先玉335為代表的62個品種, S5組包括以中玉335和農(nóng)大108為代表的13個品種。SSR標(biāo)記聚類組群的主成分分析顯示, 雖然存在極少數(shù)的離散品種, 但整體上各組群分布相對集中(圖2-B),基本上各自占據(jù)相應(yīng)的位置。S1、S3組分布均主要集中在II區(qū), S2、S5組在III和IV區(qū)均有分布, S4組分布在I、II、III區(qū), 但主要聚集在I、III區(qū)。各組群坐標(biāo)分布結(jié)果與聚類分組結(jié)果一致, 且兩者分析結(jié)果可以相互佐證。

2.3 不同生態(tài)區(qū)品種遺傳多樣性分析

為了探究各生態(tài)區(qū)品種間是否存在遺傳差異,對不同生態(tài)區(qū)品種進(jìn)行方差分析及遺傳多樣性比較(表3和表4)。結(jié)果表明, 東華北品種各性狀相對居中, 基因多樣性、雜合度和PIC均最低, 分別為0.68、0.65和0.64; 黃淮海品種生育期最短, 達(dá)到顯著水平, 等位變異數(shù)最低, 為7.40; 西北品種生育期、穗位高、干重和鮮重最高, 且均達(dá)到顯著水平,等位變異數(shù)和基因型數(shù)均最高, 分別為9.13和16.30;南方品種穗長、穗行數(shù)和鮮重最低, 粗蛋白最高, 且均達(dá)到顯著水平, 基因型數(shù)最低, 為10.30, 基因多樣性、雜合度和PIC均為最大, 分別為0.71、0.72和0.68。結(jié)果表明, 西北和南方品種表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性, 出現(xiàn)不同程度的性狀分化, 產(chǎn)生了具有地方性特征的性狀特點。

表3 4個生態(tài)區(qū)品種農(nóng)藝及品質(zhì)性狀的方差分析Table 3 Analysis of variance of agronomic and quality traits of varieties from four ecological regions

表4 4個生態(tài)區(qū)品種間的遺傳多樣性比較Table 4 Comparison of genetic diversity among varieties from four ecological regions

分析不同生態(tài)區(qū)品種在兩類方法的聚類分布情況。由農(nóng)藝及品質(zhì)性狀聚類可知(圖2-A), 有3個生態(tài)區(qū)的大多數(shù)品種聚在相同的組群, 其中37個西北樣品(62.7%)聚于X4組, 28個黃淮海樣品(84.8%)和13個南方樣品(59.1%)聚于X3組, 但東華北樣品分布相對離散, 24個樣品(43.6%)聚于X3組, 11個樣品(20%)聚于X1組。各生態(tài)區(qū)品種之間的遺傳距離結(jié)果表明, 南方品種與東華北、黃淮海和西北品種遺傳距離較大, 分別為0.054、0.047、0.046, 而東華北、黃淮海和西北品種兩兩間遺傳距離較小, 均在0.01左右。由SSR標(biāo)記聚類可知(圖2-A), 15個南方品種(75%)聚于S1組, 東華北、黃淮海和西北品種主要聚于S4組, 分別為23個(48.9%)、11個(40.7%)和22個(46.8%)。比較2種聚類結(jié)果發(fā)現(xiàn), 兩者都能將南方品種聚集在一起, 但農(nóng)藝及品質(zhì)性狀還能將黃淮海、西北品種聚集在一起。

3 討論

3.1 青貯玉米雜交品種的品質(zhì)性狀評價及遺傳多樣性分析

粗蛋白、酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維和淀粉是反映青貯玉米品質(zhì)的重要指標(biāo)。粗蛋白提供動物的蛋白質(zhì)和氨化物兩大營養(yǎng)物質(zhì), 其含量越高, 青貯玉米品質(zhì)越好。中性洗滌纖維和酸洗洗滌纖維是評價動物消化率的重要指標(biāo), 其含量越低, 動物可消化的干物質(zhì)越多。根據(jù)2010年國家頒布的青貯玉米品質(zhì)分級標(biāo)準(zhǔn)[19], 在本研究2002—2020年通過國家及各省區(qū)(市)審定的169個青貯玉米樣品數(shù)據(jù)中,136個樣品達(dá)到粗蛋白國家一級標(biāo)準(zhǔn)(≥7%), 56個樣品達(dá)到中性洗滌纖維國家一級標(biāo)準(zhǔn)(≤45%), 86個樣品達(dá)到酸性洗滌纖維國家一級標(biāo)準(zhǔn)(≤23%), 40個樣品達(dá)到淀粉含量國家一級標(biāo)準(zhǔn)(≥25%), 且品種質(zhì)量呈現(xiàn)為逐年提高的趨勢。以上表明育種家在青貯玉米的研究方面得到深度和廣度拓展, 更加注重飼喂效果, 把為牲畜養(yǎng)殖提供更多能量作為出發(fā),使選育品種的目標(biāo)更明確, 體現(xiàn)中國培育出的青貯玉米新品種質(zhì)量越來越好[27]。

青貯玉米品種遺傳多樣性評價可為新品種選育、品種生產(chǎn)應(yīng)用提供重要參考。在供試品種的產(chǎn)量及品質(zhì)性狀分析中, 發(fā)現(xiàn)干重、粗蛋白和酸性洗滌纖維遺傳多樣性較豐富。本文研究結(jié)果與吳建忠等[17]、吳欣等[28]相比較, 干重、粗蛋白和酸性洗滌纖維的變異系數(shù)均高出許多, 這可能與品種數(shù)目及種植區(qū)域差異大有關(guān)。以上研究表明青貯玉米品種的干重、粗蛋白和酸性洗滌纖維存在較大的改良空間, 可為以后優(yōu)質(zhì)品種選育提供方向。本研究在王鳳格等[29]分析32個青貯玉米品種遺傳多樣性的基礎(chǔ)上將樣品數(shù)增至141個, 發(fā)現(xiàn)等位變異數(shù)、基因多樣性、PIC、雜合率普遍升高, 但與易紅梅等[30]研究參加2014—2019年國家區(qū)試的127個青貯玉米品種結(jié)果基本一致, 這可能受樣品總數(shù)大小的影響。

3.2 不同生態(tài)區(qū)品種遺傳多樣性

從生態(tài)區(qū)角度來對青貯玉米進(jìn)行遺傳多樣性分析, 能更精準(zhǔn)的了解中國各種植區(qū)域品種的遺傳分化特點。根據(jù)方差分析及遺傳多樣性結(jié)果表明, 西北和南方品種基因多樣性、雜合度、PIC指標(biāo)略高于東華北和黃淮海品種, 顯現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性,且出現(xiàn)了明顯的性狀分化現(xiàn)象。分析其可能原因,有如下3點: (1) 生態(tài)環(huán)境差異。不同生態(tài)區(qū)的地形、氣候、土壤條件等因素影響玉米品種形態(tài)性狀表達(dá)。(2) 生態(tài)區(qū)地理跨度及需求區(qū)域差異。東華北和黃淮海品種種植區(qū)域跨度較小, 而西北和南方品種種植區(qū)域跨度較大, 且青貯玉米主要需求區(qū)域在西北和南方地區(qū), 兩地區(qū)品種類型多, 故遺傳多樣性較高。(3) 不同生態(tài)區(qū)畜牧結(jié)構(gòu)及生產(chǎn)要求不同。西北生態(tài)區(qū)畜牧業(yè)發(fā)展迅速, 飼料相對缺乏, 對青貯玉米品種的產(chǎn)量要求較高, 故西北品種生育期及生物產(chǎn)量等性狀指標(biāo)高, 產(chǎn)生性狀分化現(xiàn)象。

農(nóng)藝及品質(zhì)性狀聚類顯示, 同一生態(tài)區(qū)的大部分品種聚集在一起。分析其可能原因為不同生態(tài)區(qū)的育種目標(biāo)及生產(chǎn)需求不同, 即不同生態(tài)區(qū)形成了適應(yīng)當(dāng)?shù)匦枨蟮挠N模式, 對目標(biāo)性狀存在定向選擇, 導(dǎo)致品種出現(xiàn)一定的性狀分化。除此之外, 該結(jié)果體現(xiàn)了我國青貯玉米的品種選育正在逐步出現(xiàn)針對于特點區(qū)域、生態(tài)區(qū)進(jìn)行品種改良的情況。SSR標(biāo)記聚類顯示, 15個南方品種(75%)聚于S1組, 而其他組群中各生態(tài)區(qū)品種摻雜, 單生態(tài)區(qū)品種無明顯聚集現(xiàn)象, 結(jié)合不同生態(tài)區(qū)之間的遺傳距離, 表明僅南方品種有傾向于聚在一起。分子聚類結(jié)果說明,東華北、西北和黃淮海生態(tài)區(qū)品種基因來源復(fù)雜,關(guān)鍵種質(zhì)資源接近, 不同品種間存在基因交流, 造成親緣關(guān)系接近、遺傳差異較小。同時, 南方地區(qū)品種與其他生態(tài)區(qū)品種的遺傳分化現(xiàn)象在一定程度上反映出青貯玉米親本具有區(qū)域選擇差異。比較兩種聚類分析結(jié)果發(fā)現(xiàn), 兩者均能將大多數(shù)南方品種聚集在一起, 但農(nóng)藝及品質(zhì)性狀還能將黃淮海、西北品種聚在一起。究其原因為這兩種分析方法是青貯玉米品種遺傳多樣性在不同層面上的體現(xiàn), 形態(tài)學(xué)聚類方法是依據(jù)作物的表型性狀來區(qū)分不同品種間的遺傳差異, 然而表型性狀易受很多復(fù)雜因素影響如標(biāo)記數(shù)量少、人為測量誤差、環(huán)境條件等, 造成遺傳表達(dá)不穩(wěn)定或不同基因型的品種表現(xiàn)出相同表型特征的結(jié)果。相比之下, 分子標(biāo)記是從DNA水平上反映不同個體間的遺傳變異現(xiàn)象, 不受外界環(huán)境影響, 結(jié)果相對準(zhǔn)確。因此, 農(nóng)藝及品質(zhì)性狀與分子標(biāo)記的分析結(jié)果不完全一致是合理的, 將兩類方法相結(jié)合能夠更加準(zhǔn)確、全面的了解物種的遺傳變異并描述和解釋其遺傳背景。

本文利用農(nóng)藝及品質(zhì)性狀與SSR標(biāo)記評價了我國4個生態(tài)區(qū)青貯玉米品種的遺傳多樣性, 了解了各生態(tài)區(qū)品種的農(nóng)藝、品質(zhì)性狀及遺傳分化情況,其結(jié)果對不同生態(tài)區(qū)的育種策略調(diào)整具有參考價值,但僅從生態(tài)區(qū)角度對我國主要生產(chǎn)利用的青貯玉米品種進(jìn)行了分析評價, 今后還有待從統(tǒng)一田間試驗方面對品種進(jìn)行更深層次了解, 以期更加客觀評價不同品種間形態(tài)差異, 為優(yōu)質(zhì)品種推廣種植提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

通過利用農(nóng)藝、品質(zhì)性狀和SSR標(biāo)記分析141個國審和各省區(qū)(市)青貯玉米品種的遺傳多樣性,發(fā)現(xiàn)我國青貯玉米品種存在豐富的遺傳多樣性, 尤其是西北和南方品種出現(xiàn)明顯的性狀分化現(xiàn)象; 南方品種在農(nóng)藝及品質(zhì)性狀和分子遺傳上均具有特異性, 西北和黃淮海品種在農(nóng)藝及品質(zhì)性狀上具有特異性; 綜合兩類方法能更準(zhǔn)確、全面揭示品種遺傳多樣性, 其研究結(jié)果對不同生態(tài)區(qū)育種策略調(diào)整具有一定參考價值。