孫小杰 宗凌麗 應(yīng)月 楊軍麗

摘 要：建立了免疫親和柱-高效液相色譜測定餅干中赭曲霉毒素A的分析方法。樣品經(jīng)80%甲醇水溶液提取，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化，采用C18色譜柱，以乙腈-水-冰乙酸為流動相，用高效液相色譜儀對餅干中赭曲霉毒素A的含量進行了測定。赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.999 1，方法的定量限為1.0 μg/kg。樣品的加標回收率為80.33%～97.20%，測定結(jié)果的相對標準偏差均小于7.22%（n=6）。該方法具有快速，定量準確，線性相關(guān)性理想，可適用于餅干中赭曲霉毒素A的測定。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜柱;免疫親和柱;赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素是一組結(jié)構(gòu)類似的真菌毒素，有A、B、C、D 4種化合物，主要危及人和動物腎臟，其中毒性最大、與人類健康關(guān)系最密切、產(chǎn)毒量最高、對農(nóng)作物的污染最重及分布最廣的是赭曲霉毒素A[1]。赭曲霉毒素A致癌、致畸、破壞免疫系統(tǒng)，對肝、腎臟造成損害，還可以導致神經(jīng)中毒[2]。為了保障人民的身體健康，《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規(guī)定了谷物及其制品（不包括焙烤食品）中赭曲霉毒素A的限量為5.0 μg/kg[3]。

2021年4月，瑞典通過歐盟食品和飼料快速預(yù)警系統(tǒng)通報出口至我國的薄脆餅干中赭曲霉毒素A含量不合格，目前文獻報道的赭曲霉毒素A的方法主要涉及糧食及其制品、咖啡、酒[4-6]，針對餅干中赭曲霉毒素A測定技術(shù)的研究較少。因此有必要建立餅干中赭曲霉毒素A的檢測方法，為開展餅干中赭曲霉毒素A的風險監(jiān)測提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀：島津LC-20AD型，配有熒光檢測器，日本島津公司;電子天平：XS205型，瑞士 Metler—Toledo公司;固相萃取裝置：Wat200609，美國Waters公司;免疫親和柱：3mL，青島普瑞邦生物工程有限公司;氮吹儀：N-EVAP，美國Organomation公司;離心機：ROTINA 35，德國Hettich公司;甲醇、乙腈，色譜純，美國ROE公司;冰乙酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、吐溫20，分析純，國藥集團化學試劑有限公司;赭曲霉毒素標準物質(zhì)，上海安譜實驗科技股份有限公司;實驗室用水為經(jīng)Mili-Q凈化系統(tǒng)（0.22 μm過濾膜）過濾的超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制

（1）赭曲霉毒素A標準儲備液。稱取赭曲霉毒素A標準品

1.0 mg，用乙腈-甲醇溶液（50︰50）溶解并定容至100 mL，配成10 μg/mL的標準儲備液，-20 ℃保存。赭曲霉毒素A標準工作液：準確移取赭曲霉毒素A標準儲備液5 μL、10 μL、50 μL、100 μL和200 μL至100 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，分別配成0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、20 ng/mL的標準工作液，4 ℃保存。

（2）真菌毒素清洗緩沖液。①先將12.5 g氯化鈉、2.5 g碳酸氫鈉溶于約250 mL水中，加入0.05 mL吐溫20，用水定容至500 mL。②磷酸鹽緩沖液。將4.0 g氯化鈉、0.6 g磷酸氫鈉、0.1 g磷酸二氫鉀、0.1 g氯化鉀溶于約490 mL水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，用水定容至500 mL。

1.2.2 樣品提取

稱取粉碎均勻的試樣25.0 g，加入100 mL甲醇-水溶液（80︰20），高速均質(zhì)5 min后用定量濾紙過濾，準確移取4 mL濾液于離心管中，加入26 mL磷酸鹽緩沖液后混勻，混合液備用。

1.2.3 樣品凈化

將免疫親和柱連接于20 mL玻璃注射器下，將混合液分兩次注入玻璃注射器中。調(diào)節(jié)流速約1滴/s，直至空氣進入親和柱中，依次用真菌毒素清洗緩沖液10 mL、水10 mL連續(xù)淋洗親和柱，調(diào)節(jié)流速1～2滴/s，棄去全部流出液，抽干親和柱。加入1.5 mL甲醇，調(diào)節(jié)流速約為1滴/s，用試管收集全部洗脫液，在45 ℃下水浴氮氣吹干，用500 μL流動相溶解，供檢測用。

1.2.4 提取溶劑的選擇

甲醇-水溶液（80︰20）與乙腈-水溶液（60︰40）作為提取溶劑，回收率能達到90%以上，但考慮到乙腈的毒性，選擇甲醇-水溶液（80︰20）作為提取溶劑。

1.2.5 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse plus-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 ?m，美國agilent公司）;柱溫35 ℃;熒光檢測器激發(fā)波長333 nm，發(fā)射波長460 nm;流動相：乙腈-水-冰乙酸（48︰51︰1），等度洗脫;流速：1.0 mL/mL;進樣量：50 ?L。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性方程與定量限

赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，標準溶液的質(zhì)量濃度x與色譜峰面積y呈良好的線性關(guān)系（r≥0.999 1），線性方程為y=9 915.48x+1 391.31，以信噪比為S/N≥10時確定定量限為1.0 μg/kg，歐盟規(guī)定餅干中赭曲霉毒素A限量值為3.0 μg/kg，方法定量限滿足檢測的需求。

2.2 方法回收率與精密度試驗

通過向陰性樣品中添加1.0 μg/kg、3.0 μg/kg、10.0 μg/kg

3個濃度水平的赭曲霉毒素A標準溶液，進行方法回收率和精密度試驗，測定結(jié)果見表1。

由表1可見，赭曲霉毒素A的回收率在80.33%～97.20%，相對標準偏差為3.44%～7.22%，符合GB/T 27404—2008中檢測方法確認的要求。

3 結(jié)論

對餅干進行前處理，然后采用高效液相色譜法對赭曲霉毒素A進行測定，從而建立了餅干中赭曲霉毒素A測定的檢測方法。本方法簡便準確，實用性強，可為餅干中赭曲霉毒素A風險監(jiān)測提供可靠的技術(shù)支持。

參考文獻

[1]Petzinger E，Ziegler K.Ochratoxin A from a toxicological perspective[J].J Vet Pharm Ther，2010，23（2）：91?98.

[2]Reddy L，Bhoola K.Ochratoxins-food contaminants：impact on human health [J].Toxins，2010（2）：771-779.

[3]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量：GB 2761—2017[S].北京：中國標準出版社，2017.

[4]呂相征，謝妮，李業(yè)鵬，等.用高效液相色譜法測定糧食樣品中的赭曲霉毒素A[J].中國醫(yī)科大學學報，2002（4）：47-48.

[5]樊祥，禇慶華，周瑤，等.液-液萃取結(jié)合免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜測定烘焙咖啡中赭曲霉毒素A[J].理化檢驗（化學分冊），2008（8）：736-739.

[6]楊超，林洪，張輝珍，李惠潁.免疫親合柱凈化高效液相色譜檢測啤酒中赭曲霉毒素A[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2007（12）：127-129.