戴明男

摘 要：為確定微生物法測定米粉中維生素B6含量的不確定度，本文利用SHP-250型生化培養(yǎng)箱，依據(jù)GB 5009.154—2016第二法操作指導(dǎo)，進(jìn)行了米粉中維生素B6的測定。并從樣品稱量、樣品稀釋定容、樣品測量等方面，分析了微生物測定米粉中維生素B6含量不確定度來源。樣品稱量、樣品稀釋定容、樣品測量均可以引入維生素B6含量測定不確定度，需要測定操作者從儀器、操作、環(huán)境等多個(gè)方面嚴(yán)格控制，減小含量測定偏差。

關(guān)鍵詞：微生物法;米粉;維生素B6;含量;不確定度

維生素B6又可稱之為吡哆素，包括吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺等多個(gè)成分，可溶于水，參與人體多種代謝反應(yīng)。維生素B6是米粉中重要營養(yǎng)組成之一，但因含量處于較低的水平，測定難度較大?！妒称钒踩珖覙?biāo)準(zhǔn) 食品中維生素B6的測定》（GB 5009.154—2016）規(guī)定了食品中維生素B6的含量測定方法，微生物法為標(biāo)準(zhǔn)第二法，適用于不同類別食品中維生素B6的測定。本文評估了利用GB 5009.154—2016第二法測定米粉中維生素B6含量的不確定度。

1 材料與方法

1.1 材料

SHP-250型生化培養(yǎng)箱、Thermo酶標(biāo)檢測儀、多管式旋渦混合器、水浴鍋、0.2 μm無菌濾膜[1]。市售嬰幼兒配方米粉、維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品（≥99.0%），檸檬酸鹽緩沖液（pH為4.5）、馬鈴薯酸性磷酸酶、無菌水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 操作步驟

在250 mL錐形瓶內(nèi)，放入2.5 g米粉樣品，利用單標(biāo)線吸量管加入0.05 L檸檬酸鹽緩沖液后、0.025 L馬鈴薯酸性磷酸酶，在多管式旋渦混合器內(nèi)混合均勻。進(jìn)而放置在無光照直射的37.0 ℃室溫環(huán)境中，孵育60 min，間隔手動振蕩[2]。孵育完畢后，加入0.1 L滅菌水逐級稀釋，在95.0 ℃水浴鍋內(nèi)振蕩，在短時(shí)間內(nèi)冷卻至室內(nèi)溫度后過濾、無菌離心取上清液[3]。進(jìn)而依據(jù)GB 5009.154—2016第二法，配制0 mg/100 g、0.002 mg/100 g、0.004 mg/100 g、0.006 mg/100 g、0.008 mg/100 g的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取微孔板條，在30.0 ℃無光照直射條件下孵育。孵育后，在Thermo酶標(biāo)檢測儀中，選擇630 nm波長，進(jìn)行吸光度讀取[4]。

1.2.2 測定計(jì)算

GB 5009.154—2016第二法規(guī)定米粉中維生素B6含量需要依據(jù)下式進(jìn)行計(jì)算：

式（1）中：X為維生素B6含量，C為樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線下讀取的濃度，n為稀釋倍數(shù)，m為樣品量[5]。其中維生素B6含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

式（2）中：Urel（X）為維生素B6含量的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度，Urel（C）為樣品在標(biāo)準(zhǔn)曲線下讀取的濃度的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，Urel（n）為稀釋倍數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)不確定度，Urel（m）為樣品量的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品稱量引入的不確定度

用電子天平精準(zhǔn)稱量樣品2.500 1 g，天平精確度為0.1 mg。

由天平鑒定證書可知天平最大重復(fù)性誤差為0.15 mg，在稱取量大于0 g但小于50 g時(shí)，指示數(shù)值誤差為0.1 mg。利用矩陣分布包含因子為k（）的B類不確定性標(biāo)定，得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.1/=0.057 1，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定式。則樣品稱量時(shí)的相對不確定度為0.080 75/2.500 1≈0.032 30。

2.2 樣品稀釋定容引入的不確定度

上述操作用儀器均為玻璃材質(zhì)，玻璃材質(zhì)校準(zhǔn)、溫度干擾均對液體體積具有影響，進(jìn)而引發(fā)維生素B6測定偏差。根據(jù)最大允許誤差，依據(jù)包含因子k為的均勻分布處理方法進(jìn)行不確定度分量計(jì)算，可得出5 mL單標(biāo)線吸量管最大允許誤差為±0.015，不確定度為0.008 66，相對不確定度為0.001 68;而250 mL單標(biāo)線容量瓶最大允許誤差為±0.15，不確定度為0.086 6，相對不確定度為0.000 339，合成剝離器具校準(zhǔn)引入的不確定度分量為。

考慮到微生物測定區(qū)域溫度變化幅度在5.0 ℃左右，水膨脹系數(shù)為0.000 21 ℃，依據(jù)包含因子k為的矩形分布計(jì)算可知，因室溫變化而引起的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為

0.000 21×5/。合成溫度變化引起的操作用儀器相對不確定度分量可得出結(jié)果為0.000 857 0，則樣品稀釋形容引入的不確定度就為。

2.3 樣品測量中引入的不確定度

樣品測量不確定性主要源于測量重復(fù)性。對定值樣品中的維生素B6含量進(jìn)行平行測定，測定次數(shù)為8，得出結(jié)果分別結(jié)果如表1所示。根據(jù)貝塞爾公式，計(jì)算得出標(biāo)準(zhǔn)不確定度，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度約等于0.000 363。則微生物法測定米粉中維生素B6的總不確定度為：0.032 30+0.087 034 2+0.000 363=0.119 697 2。

3 結(jié)論

微生物法測定米粉中維生素B6含量不確定度主要來源于樣品稱量、樣品稀釋定容、樣品測量等幾個(gè)環(huán)節(jié)，涉及了標(biāo)準(zhǔn)品純度、天平自身精密度、移液器與容量瓶容差、樣品測定重復(fù)性、試驗(yàn)環(huán)節(jié)溫度變化等幾個(gè)方面。測定人員應(yīng)嚴(yán)格依據(jù)GB 5009.154—2016的要求，進(jìn)行微生物法操作，為米粉安全監(jiān)管提供充足支持。

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