揭仕春 三明市將樂縣黃潭鎮(zhèn)鄉(xiāng)村振興綜合服務(wù)中心 福建將樂 353300

實驗按照國家獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范（試行）和消毒和滅菌相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行研究，以大腸桿菌作為殺菌對象，進(jìn)行定量殺菌試驗、定性殺菌試驗，觀察三種消毒劑的殺菌效果，為實際消毒中提供參考。

1 材 料

1.1 試驗菌株 大腸桿菌（CMCC44103），購于上海北諾生物科技有限公司。

1.2 藥品 戊二醛癸甲溴銨溶液，含戊二醛5%、癸甲溴銨5%，四川永諾生物科技有限公司研制，批準(zhǔn)文號：獸藥字221306245。聚維酮碘溶液，含碘10%，廣州中冠藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號：獸藥字191071577。月芐三甲氯銨，含烴銨鹽以C22H40CIN計為9.30%~10.70%，成都民生消毒劑有限公司產(chǎn)品，批準(zhǔn)文號：獸藥字（2015）220432015。

1.3 試劑 吐溫-80、甘氨酸、硫代硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氧化鈉均為分析純，試驗用水為純化水，培養(yǎng)基為營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基。

1.4 儀器 超凈工作臺（SW-CF-IF）、普通生化培養(yǎng)箱（LRH-250型）、高壓滅菌器（DSX-280-B型）、電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9023A型）、電子天平（BS2140型）、數(shù)顯恒溫水浴鍋（HH-2型）。

2 方 法

2.1 試驗依據(jù) 參考獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范（1992年試行）[1]、GB15981-1995消毒與滅菌效果的評價方法與標(biāo)準(zhǔn)[2]。

2.2 試驗菌種的制備及活菌計數(shù)

2.2.1 菌種復(fù)蘇 取第三代大腸桿菌復(fù)蘇，培養(yǎng)于固體培養(yǎng)基平皿上，37℃培養(yǎng)至細(xì)菌達(dá)到生長平衡期時選擇單菌落在固體培養(yǎng)基斜面上傳代，作為消毒劑鑒定試驗菌種。

2.2.2 配制菌懸液 將固體斜面上的菌種接種到液體培養(yǎng)基中，經(jīng)37℃培養(yǎng)24 h。

2.2.3 活菌計數(shù) 用10倍稀釋和平板計數(shù)法計數(shù)，試驗2次。吸取0.1 mL菌液，用倒板和涂布作平行，接種5個梯度（10-4、10-5、10-6、10-7、10-8），將菌液搖勻或涂布均勻后，置37℃培養(yǎng)24 h，選取平均菌數(shù)30~300個的平板計數(shù)。大腸桿菌10-6稀釋梯度的平板符合計數(shù)規(guī)則，菌落平均數(shù)為281個，最終結(jié)果為2.8×108CFU/mL。

2.2.4 試驗菌液 用0.03 mol/L的PBS將菌懸液稀釋成含菌107CFU/mL的試驗菌液。

2.3 中和劑選擇 根據(jù)《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》（1992）和參考文獻(xiàn)[3]進(jìn)行消毒劑中和劑配制，戊二醛癸甲溴銨溶液（戊二醛+癸甲溴銨）配制3%吐溫-80+1%甘氨酸；聚維酮碘及月芐三甲氯銨溶液配制0.5%硫代硫酸鈉溶液。分六組進(jìn)行中和劑性能鑒別，一組：消毒劑+菌懸液；二組：（消毒劑+菌懸液）+中和劑；三組：中和劑+菌懸液；四組：（消毒劑+中和劑）+菌懸液；五組：PBS+菌懸液；六組：PBS+中和劑。

2.4 定量殺菌試驗 采用參考文獻(xiàn)[4]定量殺菌試驗，比較三種消毒劑在不同稀釋比及作用不同時間對大腸桿菌的殺滅效果。具體操作步驟：按要求配制消毒液；配制菌懸液，濃度為1×107～5×107CFU/mL；取無菌試管，加入0.5 mL菌懸液；取消毒液4 mL注入其中，混勻并記時；待兩者相互作用至各預(yù)定時間，分別取0.5 mL試驗菌與消毒劑混合液加于4.5 mL經(jīng)滅菌的中和劑中，混勻；各管試驗菌與消毒劑混合液經(jīng)加中和劑作用10 min后，分別取1 mL樣液，按活菌計數(shù)法計算活菌數(shù)，每管樣液接種2個平皿；用稀釋液代替消毒液進(jìn)行平行試驗，作陽性對照。試驗樣本均置37℃、48 h后觀察結(jié)果，試驗重復(fù)3次。消毒劑殺菌率計算方法：殺菌率=(初始活菌數(shù)-平板計數(shù)×相應(yīng)的稀釋倍數(shù))/初始活菌數(shù)×100%。

2.5 定性法

2.5.1 消毒劑濃度選擇 將試管排列于試管架上，標(biāo)記管號，每個試管加滅菌蒸餾水2.5 mL，置于20±2℃水浴中。于第1管內(nèi)加消毒液2.5 mL，混勻；取2.5 mL移入第2管，混勻；從第2管中取2.5 mL移入第3管，以此類推直至第9管，混勻后棄去2.5 mL；第10管中不加消毒液，作為對照。用此方法對三種消毒劑分別進(jìn)行試驗。

2.5.2 消毒劑與細(xì)菌作用 將菌液進(jìn)行活菌計數(shù)，用稀釋液配制成含菌量為5×105～5×106CFU/mL的菌液。加菌懸液2.5 mL于各管中，混勻并記錄各管加菌時間，使菌藥混合液中含菌量均為105～106CFU/mL。各管分別于加菌2、5、10、30 min后，取出0.5 mL加入4.5 mL中和劑內(nèi)中和10 min后，取出0.5 mL加入4.5 mL營養(yǎng)肉湯管內(nèi)，置37℃、48 h，觀察結(jié)果，無菌生長管繼續(xù)培養(yǎng)至第7 d。

3 結(jié) 果

3.1 中和劑試驗結(jié)果 根據(jù)《獸用消毒劑鑒定技術(shù)規(guī)范》（1992）消毒劑中和劑判定標(biāo)準(zhǔn)即評價規(guī)定，試驗結(jié)果符合以下條件，所測中和劑判為合格：一組不長菌，二組長菌數(shù)超過100CFU/mL，三、四、五組間菌數(shù)相差不超過10%，六組不長菌。根據(jù)中和劑鑒定試驗標(biāo)準(zhǔn)，判斷所選中和劑及濃度適宜，連續(xù)3次試驗結(jié)果合格。

表1 中和劑試驗結(jié)果

3.2 定量殺菌試驗結(jié)果

3.2.1 消毒劑在不同濃度、不同作用時間下的殺菌效果 三種消毒劑在不同條件下的殺滅率結(jié)果見表2，由表可知，聚維酮碘、月芐三甲氯銨、戊二醛癸甲溴銨在MBC下作用3 min對大腸桿菌的殺滅率均達(dá)到100%。

表2 三種消毒劑不同條件下對大腸桿菌的殺滅率

3.3 定性殺菌試驗結(jié)果 三種消毒劑分別按1:128、1:64倍稀釋，與大腸桿菌作用2 min，戊二醛癸甲溴銨溶液、月芐三甲氯銨溶液殺菌率均達(dá)到100%，而聚維酮碘溶液有菌生長；三種消毒劑分別按1:256、1:512倍稀釋，與大腸桿菌作用5 min，戊二醛癸甲溴銨溶液殺菌率達(dá)到100%（見表3）。

表3 消毒劑對大腸桿菌的定性殺菌作用

4 討 論

1）通過試驗可知，戊二醛癸甲溴銨對大腸桿菌的殺菌作用好于聚維酮碘、月芐三甲氯銨，但是在實際運(yùn)用中長時間用一種消毒藥容易產(chǎn)生耐藥性，要每隔一段時間跟換消毒藥。而消毒藥更換后，根據(jù)本試驗結(jié)果配制溶液的濃度和作用時間就會不同，養(yǎng)殖場在執(zhí)行消毒措施時，應(yīng)注意結(jié)合消毒劑對病原菌的殺滅效果來配制一定濃度的消毒劑，以確保消毒劑產(chǎn)生有效的消毒效果。雖然試驗結(jié)果顯示戊二醛癸甲溴銨溶液消毒效果最佳，但由于其刺激性大、對人體有害等原因，應(yīng)用在人員消毒通道時推薦選擇對體表和黏膜消毒效果更佳的聚維酮碘。而在場外、道路、環(huán)境和場內(nèi)消毒上，出于價格等因素考慮則可以選擇戊二醛癸甲溴銨溶液及月芐三甲氯銨等進(jìn)行定期輪換使用。

2）規(guī)模養(yǎng)殖場在實際消毒過程中，要綜合考慮消毒場所的大小及地理位置、消毒對象周圍的環(huán)境、被消毒物品的性質(zhì)、天氣狀況、氣溫的高低、所處環(huán)境病原微生物的種類及多少等因素，決定選擇采取消毒的方式方法、消毒藥的品種、劑量的大小?？傊还懿捎檬裁捶绞椒椒ㄏ?，消毒劑品種都要定期更換，進(jìn)行交叉使用，并制定科學(xué)的消毒程序、建立嚴(yán)格的消毒制度，才能確實保證得到良好的消毒效果。

3）養(yǎng)殖場應(yīng)該采用全進(jìn)全出的模式，并在每次出欄后按照清理-沖洗-消毒液消毒-熏蒸消毒-火焰消毒的順序進(jìn)行一次徹底的消毒，注意沖洗時盡量將污物洗干凈，消毒液噴灑時可適當(dāng)增加消毒藥且消毒液要全面濕潤環(huán)境表面。

4）本試驗雖然證實消毒劑戊二醛癸甲溴銨溶液對革蘭氏陰性菌大腸桿菌的消毒效果較好，但是該消毒劑對革蘭氏陽性菌及其它細(xì)菌、芽孢和病毒的消毒試驗還需進(jìn)一步研究，為幫助養(yǎng)殖場消毒用藥的選擇提供更全面的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。