李 芬，肖佳敏，秦宇輝，林永慧，孔祥仕，何興兵*

（1.吉首大學 生物資源與環(huán)境科學學院，湖南 吉首 416000；2.吉首大學 生態(tài)旅游重點實驗室，湖南 張家界 427000）

【研究意義】內(nèi)源真菌（Endophytic fungi），又稱為內(nèi)生真菌，一般以共生關(guān)系存在于植物組織中[1-2]。然而，目前的一些研究顯示內(nèi)源真菌可以參與凋落物分解且對分解過程產(chǎn)生了一定程度的影響[3]。內(nèi)源真菌作為一種先鋒定殖者，可以直接利用凋落物的有機成分，同時也可以通過拮抗作用以及微生物間的資源競爭，而改變后定殖腐生分解者群落組成，從而影響整個凋落物分解過程，即優(yōu)先定殖效應(yīng)[4-5]?！厩叭搜芯窟M展】盡管國內(nèi)外進行了一些初探研究，但仍然無法準確理解內(nèi)源真菌在生態(tài)系統(tǒng)尤其在腐生系統(tǒng)中的功能地位。目前，對于內(nèi)源真菌由共生系統(tǒng)轉(zhuǎn)為腐生系統(tǒng)這一生態(tài)過程變化僅僅只是提出了一個概念，而沒有真正的方法能夠研究清楚。一項基于野外實驗的真菌構(gòu)建歷史影響群落、生態(tài)系統(tǒng)的研究表明，即使在自然環(huán)境變化水平下，群落構(gòu)建歷史也會對生態(tài)系統(tǒng)功能產(chǎn)生強烈影響[6]。此外，這些群落構(gòu)建的歷史影響的強度已經(jīng)被證明取決于捕食[7-9]、干擾[10]、生產(chǎn)力[8]、生態(tài)系統(tǒng)規(guī)模[11]和其他環(huán)境條件[12]?！颈狙芯壳腥朦c】香樟是亞熱帶常綠闊葉林的生態(tài)優(yōu)勢樹種之一，香樟人工林中植物群落以香樟喬木為主，生物量在90%以上，對其凋落物分解影響驅(qū)動力的研究對于區(qū)域碳循環(huán)過程具有重要的意義?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究選擇亞熱帶地區(qū)具有代表性的人工林優(yōu)勢樹種香樟（Cinnamomum camphora（L.）Presl.）凋落葉作為底物材料，通過模擬內(nèi)源真菌參與的真菌群落組成，分析對后續(xù)凋落物分解過程的影響。

1 材料與方法

1.1 研究樣地與采樣

試驗樣地位于湖南省湘西土家族苗族自治州吉首市（28°17'19″N，109°43'12″E），以吉首大學后山香樟人工林作為研究地。湘西地區(qū)氣候?qū)僦衼啛釒Ъ撅L濕潤性氣候，兼具大陸性氣候，四季分明，春秋短、夏冬長，年平均溫度16.7°C，年均降水量1 200～1 450 mm。湘西地區(qū)地形復(fù)雜，區(qū)域內(nèi)森林植被資源豐富，亞熱帶地區(qū)常見闊葉樹、針葉樹、灌木以及草本植物在該地區(qū)均有廣泛分布，具有亞熱帶山區(qū)植被的典型特征。

在試驗樣地隨機選取5個10 m×10 m 的樣方，將尼龍網(wǎng)掛在空中，落葉季節(jié)3—4月收集24小時內(nèi)新凋落的香樟葉，戴無菌手套收集后用滅菌報紙包好放入自封袋中，自然晾干，然后用直徑為1.5 cm 打孔器將香樟葉分成葉片直徑為1.5 cm 的圓片，烘干，按每袋3 g的干質(zhì)量分別裝入錐形瓶中，最后用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，以便完全除去香樟葉內(nèi)的微生物。

試驗所用內(nèi)源真菌、腐生真菌和菌根真菌均來源于實驗室保存已有的菌種。其中，內(nèi)源真菌基于其優(yōu)勢度分布狀況篩選了3種優(yōu)勢菌，腐生真菌和菌根真菌均是在樣地系統(tǒng)分離的常見菌種中采用隨機方式進行選擇。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 內(nèi)源真菌參與的真菌群落構(gòu)建 以6株不同腐生真菌構(gòu)成的1種腐生菌群落為基本組成成分，用3 株內(nèi)源真菌、1 株菌根真菌，設(shè)立空白對照組不加內(nèi)源真菌（以研究內(nèi)源真菌的影響），人工構(gòu)建8 個真菌群落；以1株內(nèi)源真菌為基本組成成分，分別用6株不同腐生真菌構(gòu)成的3種不同腐生菌群落和1株菌根真菌人工構(gòu)建6個真菌群落。共構(gòu)建了14種真菌群落，構(gòu)建情況表1所示。

表1 14種真菌群落的組成成分Tab.1 The composition of 14 fungal communities

1.2.2 香樟凋落物分解試驗設(shè)計 在錐形瓶中放入10 g細河沙和3 g干質(zhì)量的香樟凋落葉，高溫高壓完全滅菌后，接種10 mL內(nèi)源真菌的菌懸液，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d。然后依次接種10 mL腐生真菌和菌根真菌的菌懸液。凋落物分解周期為6個月，每3 個月取一次樣，每次取7 個含有凋落葉的錐形瓶，依次測定凋落物干濕質(zhì)量、凋落物呼吸速率（CO2釋放量）及相應(yīng)的微生物酶活性。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 干濕質(zhì)量測定 錐形瓶中的樣品先稱量濕質(zhì)量，后置于60 ℃恒溫干燥箱中烘干至恒重，測定干質(zhì)量[11]。

1.3.2 凋落物分解CO2釋放量測定 微觀空間的二氧化碳濃度為取樣前后3 d 內(nèi)，每隔2 h 測量一次，以估計累積3個月潛伏期的CO2釋放量[14]。測量時，用紅外線氣體分析器的探頭插入到錐形瓶中，測量CO2釋放量[14]。

1.3.3 微生物酶活性測定 凋落物分解酶活性采用先提取粗酶液后用紫外可見分光光度計測定酶活性的方法：纖維素酶和淀粉酶的酶活性均采用二硝基水楊酸法測定[15-16]。木質(zhì)素酶的酶活性采用鄰聯(lián)甲苯胺法測定[17]。酶活性均表示為μmol glucose g/h。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010 軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計作圖，用SPSS19.0 軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)表示為平均值±標準誤。分別對前、后兩時期不同處理之間的變量進行方差分析（采用Duncan 多重比較法分析兩兩之間的差異性，顯著性水平設(shè)定為α=0.05）。為深入探討不同真菌群落對后續(xù)凋落物分解過程的影響，運用R 軟件（3.2.2）中的Vegan 包進行影響因素與響應(yīng)變量關(guān)系的主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 香樟葉內(nèi)源真菌的豐富度

由表2 可知，形態(tài)型PM01、PM02、PM03 分別為炭疽菌屬（Colletotrichum）、煙管菌屬（Bjerkandera）和炭角菌屬（Colletotrichum），且這3種的相對豐富度較高，篩選出這3種作為優(yōu)勢內(nèi)源真菌。

表2 香樟葉6種內(nèi)源真菌豐富度Tab.2 Relative abundance of 6 species of endophytic fungi from Cinnamomum camphora leaves

2.2 群落構(gòu)建對凋落物失重率的影響

整體來看，分解后期的失重率普遍高于分解前期（圖1）。由于腐生真菌群落的不同，引起失重率提高最顯著的，以群落F1 為主；由于內(nèi)源真菌的不同，以真菌Ba 為主的真菌群落引起失重率的提高最顯著。

圖1 群落構(gòu)建對香樟凋落物分解前期（a）和后期（b）失重率的影響Fig.1 The effects of community construction on the mass loss rate of Cinnamomum camphora litters at the former and later stages of litter decomposition

2.3 群落構(gòu)建對凋落物分解CO2釋放量的影響

在所有的真菌群落處理中，分解前期的呼吸速率明顯高于分解后期（表3和表4）。在同一個分解時期中，由于腐生真菌群落的不同，引起累積CO2釋放量最高的，分別以群落F1 為主；由于內(nèi)源真菌的不同，以真菌Ba為主的真菌群落引起累積CO2釋放量最高。

表3 以內(nèi)源真菌（Ba）為基本組成成分的群落構(gòu)建對凋落物分解在前期和后期24 h內(nèi)累積CO2釋放量的影響Tab.3 The effects of community construction with endophytic fungi（Ba）on the CO2 release from litter decomposition within 24 hours during the early and late stage %

表4 以腐生真菌群落（F1）為基本組成成分的群落構(gòu)建對凋落物分解前期和后期24 h內(nèi)累積CO2釋放量的影響Tab.4 The effects of community construction with saprophytic fungi community（F1）on the CO2 release from litter decomposition within 24 hours during the early and late stage %

2.4 群落構(gòu)建對凋落物分解酶活性的影響

不同真菌群落對凋落物分解的影響因分解時期的不同而出現(xiàn)差異性（圖2）。Cx 酶在分解前期普遍高于分解后期；C1 酶在分解前期普遍低于分解后期。在分解前期中，由于腐生真菌群落的不同，引起Cx 酶和C1 酶的酶活性最高的，以群落F1 為主；由于內(nèi)源真菌的不同，引起Cx 酶和C1 酶的酶活性最高的，以真菌Cf 為主（圖2a 和圖2c）。在分解后期中，由于腐生真菌群落的不同，引起Cx 酶和C1 酶的酶活性最高的，以群落F3 為主；由于內(nèi)源真菌的不同，引起Cx 酶和C1 酶的酶活性最高的，以真菌Th 為主（圖2b 和圖2d）。

圖2 群落構(gòu)建對香樟凋落物分解前期（a，c）和后期（b，d）纖維素酶酶活性的影響Fig.2 The effects of community construction on the cellulase of Cinnamomum camphora litters at the former and later stages of litter decomposition

不同真菌群落對凋落物分解的影響因分解時期的不同而出現(xiàn)差異性（圖3）。過氧化氫酶分解后期的酶活性明顯高于分解前期；漆酶分解后期的酶活性普遍低于分解前期。在分解前期中，由于腐生真菌群落的不同，引起過氧化氫酶和漆酶的酶活性最高的，分別以群落F2 和F1 為主；由于內(nèi)源真菌的不同，引起過氧化氫酶和漆酶的酶活性最高的，分別以對照組CK 和真菌Cf、Ba 為主（圖3a 和圖3c）。在分解后期中，由于腐生真菌群落的不同，引起過氧化氫酶和漆酶的酶活性最高的，以群落F2為主；由于內(nèi)源真菌的不同，引起過氧化氫酶和漆酶的酶活性最高的，分別以對照組CK 和真菌Ba 為主（圖3b 和圖3d）。

圖3 群落構(gòu)建對香樟凋落物分解前期（a，c）和后期（b，d）木質(zhì)素酶酶活性的影響Fig.3 The effects of community construction on the ligninase of Cinnamomum camphora litters at the former and later stages of litter decomposition

2.5 主成分（PCA）分析

在香樟凋落物分解前期和后期，PC1 分析分別解釋了33.14%和22.80%的總方差，PC2 分別解釋了19.56%和19.30%的總方差（圖4）。

在分解前期，真菌Ba 與漆酶（laccase）、失重率（mass loss）、CO2釋放量（CO2release）等變量關(guān)聯(lián)性較大，均為正面影響；真菌Ba、Cf 與C1 酶（exo-1,4-β-glucanase）、Cx 酶（carboxymethyl cellulase）等酶活性關(guān)聯(lián)性較大；真菌Th、群落F1 與過氧化氫酶（peroxidase）變量關(guān)聯(lián)性較大，均為正面影響（圖4A）。在分解后期，真菌Th 與C1酶、CO2釋放量等變量關(guān)聯(lián)性較大；真菌Ba 與失重率、漆酶、Cx 酶等變量關(guān)聯(lián)性較大；群落F2、F3與過氧化氫酶活性關(guān)聯(lián)性較大，均為正面影響（圖4B）。

圖4 群落構(gòu)建后香樟凋落物在分解前期（A）和后期（B）失重率、CO2釋放量及微生物酶活性的主成分分析Fig.4 Principal component analyses（PCA）of mass loss，CO2 release and associated microbial enzyme activities in degrading Cinnamomum camphora litters after community construction

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)源真菌從共生系統(tǒng)轉(zhuǎn)為腐生系統(tǒng)的過程中，由于其本身優(yōu)先定殖的獨特性以及生活史的改變，對后續(xù)定殖的腐生真菌、菌根真菌可能產(chǎn)生拮抗作用，從而影響凋落物分解。結(jié)果表明，3 種不同內(nèi)源真菌參與構(gòu)建的真菌群落對凋落物分解的影響各不相同，真菌Ba（煙管菌）對失重率的影響和漆酶過氧化氫酶等木質(zhì)素分解酶的影響一致，均具有明顯促進作用。這可能是由于煙管菌作為一種常見的白腐真菌，是產(chǎn)漆酶的主要菌種，在木質(zhì)素的分解過程中發(fā)揮了主要作用[18]。真菌在凋落物分解過程中扮演重要角色且凋落物分解是一個極其復(fù)雜的過程，需要多種真菌共同協(xié)調(diào)發(fā)生，因此，真菌群落組成的變化也同樣與凋落物分解緊密相關(guān)[19]。群落F1（木霉菌+日本曲霉菌+葉鞘腐敗菌+擬盤多毛孢菌+青霉菌+刺孢曲霉菌）在香樟凋落物分解過程中對失重率的影響顯著提高，且菌根真菌Tp（牛肝菌）的加入導(dǎo)致凋落物分解加速。群落F1 中的青霉菌相比于群落F2（木霉菌+日本曲霉菌+葉鞘腐敗菌+擬盤多毛孢菌+極細枝孢霉+刺孢曲霉菌）中的極細枝孢霉、群落F3（木霉菌+日本曲霉菌+葉鞘腐敗菌+擬盤多毛孢菌+白囊耙齒菌+青霉菌）中的白囊耙齒菌，在其他真菌的作用下對凋落物分解的促進效應(yīng)更具有優(yōu)勢，同時菌種之間相互聯(lián)系增強了促進效應(yīng)[20]。并且牛肝菌的加入提高了群落的多樣性，使真菌群落對凋落物分解具有更加明顯的效果[21]。真菌Cf（茶樹炭角菌）對失重率的影響也顯著提高，隨著時間推移，6個月后的分解后期，對失重率的影響增強?？赡苁且驗樘拷蔷哂蟹纸獾蚵湮镏心举|(zhì)素和纖維素的強大能力，是凋落物葉分解最主要的物種之一[22]。

群落結(jié)構(gòu)現(xiàn)在被認為是生態(tài)系統(tǒng)功能的關(guān)鍵決定因素[23]。群落構(gòu)建歷史，或在群落構(gòu)建期間物種到達的順序，可以影響物種的建立和群落結(jié)構(gòu)，這些效應(yīng)被稱為構(gòu)建歷史效應(yīng)，反過來又會影響群落和生態(tài)系統(tǒng)功能，包括生產(chǎn)力、分解和養(yǎng)分循環(huán)[12,24-25]。本研究中不同真菌群落對凋落物分解的影響因分解時期和真菌群落的不同而存在差異。分解酶是微生物活性的重要指標，是微生物分解的直接因素。然而，在大多數(shù)情況下，分解酶活性的差異規(guī)律與失重率的差異規(guī)律不完全一致，這可能是由于不同的分解酶對失重率的貢獻并不完全一致。PCA 結(jié)果顯示煙管菌Ba、毛栓菌Th、茶樹炭角菌Cf 對香樟凋落物過程中各項酶活性指標的影響是顯著提高的。這可能是由于內(nèi)源真菌參與真菌群落構(gòu)建對凋落物分解過程的影響存在一定的功能冗余[26]。另外，在內(nèi)源真菌優(yōu)先定殖完成后，可以為后續(xù)定殖的腐生菌以及菌根菌提供營養(yǎng)元素，促進了群落多樣性，更利于凋落物的分解[21]。其次，在分解過程中，真菌群落的變化會導(dǎo)致凋落物的質(zhì)量發(fā)生變化，與凋落物分解相關(guān)的微生物的活性也相應(yīng)地發(fā)生變化，這些變化反映了真菌群落的分解代謝能力[27-28]。

目前對內(nèi)源真菌的研究主要集中在內(nèi)源真菌與植物體的共生關(guān)系方面[29]。隨著研究的深入，研究者開始關(guān)注內(nèi)源真菌在植物組織死亡后由共生系統(tǒng)進入腐生系統(tǒng)的生態(tài)效應(yīng)，但是對于內(nèi)源真菌在腐生系統(tǒng)中養(yǎng)分循環(huán)的生態(tài)學意義并不了解[30]。每一種進入凋落物分解過程的內(nèi)源真菌都可能具有不同的功能作用，筆者的研究結(jié)果也顯示在凋落物分解過程中不同的內(nèi)源真菌參與構(gòu)建的真菌群落對凋落物分解的影響具有差異性。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的真菌群落構(gòu)建在一定程度上影響凋落物分解及其酶活性。因此，論文顯示了微生物群落組成在土壤碳循環(huán)過程中扮演了重要的角色，同時對真菌群落多樣性影響凋落物分解過程具有一定的理論參考意義。