張 晨，左其生，鄒藝琛，趙娟娟，張亞妮，李碧春

(揚州大學 動物科學與技術學院，農業(yè)科技發(fā)展研究院，教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯合實驗室，江蘇 揚州 225009)

組蛋白甲基化作為重要的表觀遺傳修飾，在不改變染色質結構的條件下參與許多生物學過程，包括細胞分化、細胞增殖等[1-3]。Xu等[4]發(fā)現，組蛋白H3K4me2能促進自我更新基因的表達,以維持滋養(yǎng)層干細胞生長；Lee等[5]發(fā)現，H3K4me3能夠促進肌肉和脂肪細胞的形成； H3K4me3還能通過在心臟特異基因啟動子區(qū)的富集促進胚胎干細胞向心肌細胞分化[6]。目前，對H3K4甲基化在細胞分化中的作用研究較多，但對胚胎干細胞向生殖細胞分化過程中組蛋白甲基化的作用機制研究尚不多見，尤其是在鳥類研究上。本課題組前期研究發(fā)現，H3K4me2能促進雞原始生殖細胞(Primordial germ cells，PGCs)的形成，色氨酸天冬氨酸重復域5(WD repeat domain 5，WDR5)可改變H3K4me2水平，但是關于WDR5在PGCs形成中的具體調控作用還不清楚。

WDR5是組蛋白甲基化修飾酶的關鍵蛋白之一，參與組蛋白二甲基化和三甲基化的修飾過程[7]，進而參與多種生物學過程[8-11]。 研究表明，小鼠過表達WDR5后，可激活Wnt信號通路，促進軟骨細胞的分化[12]；WDR5還能維持胚胎干細胞的自我更新和重編程[8,13]。在生殖干細胞調控方面，干擾WDR5可控制爪蟾H3K4me3的水平，引起其發(fā)育缺陷[7]；在突變線蟲中，WDR5可引起H3K4me2/3水平降低，最終影響生殖干細胞的正常發(fā)育[14]。目前對WDR5的研究主要集中在哺乳動物上，盡管已有不少WDR5在生殖干細胞方面的研究報道，但其對雞PGCs形成的調控機理尚不清楚。為此，本研究對WDR5進行生物信息學解析，構建重組真核表達載體pcDNA3.1-WDR5-GST，并檢測其對PGCs形成相關基因表達的影響，以期為后續(xù)探究WDR5在雞PGCs形成中的調控機制提供依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

新鮮如皋黃雞受精蛋，由中國農業(yè)科學院家禽研究所試驗禽場提供。PGCs和pcDNA3.1(+)載體，由揚州大學動物科學與技術學院教育部農業(yè)與農產品安全國際合作聯合實驗室保存。高糖DMEM、丙酮酸鈉、胎牛血清、胰酶、雞血清，購自Gibco公司(美國)；L-谷氨酰胺、β-巰基乙醇、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、非必需氨基酸、人干細胞因子(hSCF)，購自Sigma(美國)；青、鏈霉素和牛血清白蛋白，購自(北京)索萊寶科技有限公司；小鼠白血病抑制因子(mLIF)，購自Millipore(德國)；FuGENE?HD，購自Promega公司(美國)；TRNzol Universal 總 RNA 提取試劑、反轉錄試劑盒、定量試劑盒，購自天根生化科技(北京)有限公司；BCA試劑盒、放射免疫沉淀分析(Radio Immunoprecipitation Assay，RIPA)裂解液、超敏ECL化學發(fā)光試劑盒，購自碧云天生物技術有限公司(上海)。GST抗體，購自Abcam公司(美國)；山羊抗兔IgG抗體，購自北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 WDR5氨基酸序列分析 利用NCBI在線網站獲得WDR5(NM_001006198.1)的核酸序列，將其導入ProtParam在線分析網站進行氨基酸序列分析，同時利用NCBI保守結構域分析在線網站對WDR5的結構域進行分析。

1.2.2 WDR5蛋白質理化性質分析 利用Uniport網站、TMHMM Server v. 2.0在線網站和SignalP在線網站，分別對WDR5的親、疏水性及跨膜結構域和信號肽表達進行分析。

1.2.3 WDR5蛋白質三級結構和互作蛋白預測 用SWISS-MODEL對WDR5的氨基酸序列進行同源建模，對獲得結果的可用性、序列一致性、蛋白保守性進行分析。利用String在線網站對WDR5的互作蛋白進行預測，分析保守的互作蛋白。

1.2.4 重組真核表達載體pcDNA3.1-WDR5-GST的構建 利用NCBI網站獲得WDR5的CDS區(qū)序列，在其起始密碼子和終止密碼子的前面分別添加kozak結構(GCCACC)和GST蛋白的編碼序列，5′端和3′端分別添加KpnⅠ和EcoR Ⅰ酶切位點，合成該序列后，利用KpnⅠ和EcoR Ⅰ雙酶切3 h，回收產物。將回收產物與經同樣雙酶切的載體pcDNA 3.1(+)連接，構建重組真核表達載體pcDNA3.1-WDR5-GST。將連接產物轉化入 DH5α感受態(tài)細胞，涂布于氨芐抗性的平板過夜培養(yǎng)，次日挑菌，搖菌后提取重組真核表達載體進行KpnⅠ/EcoR Ⅰ雙酶切鑒定。鑒定成功后，將待測菌液送往南京擎科生物科技有限公司進行測序。

1.2.5 WDR5重組蛋白在PGCs中的表達 (1)mRNA水平的檢測。將pcDNA3.1-WDR5-GST重組真核表達質粒(g)和Fugene轉染試劑(L)按1∶3的體系轉染PGCs細胞，同時設置空白組(未處理組)和對照組(轉染pcDNA3.1(+)空載體組)。培養(yǎng)48 h后收集細胞。用Trizol裂解液進行裂解，提取RNA，按照反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA備用。利用Primer 5.0軟件，針對WDR5基因CDS區(qū)設計引物，交由南京擎科生物科技有限公司合成。引物信息見表1。以β-actin為內參基因，采用實時熒光定量PCR(RT-qPCR)試劑盒檢測WDR5基因mRNA的表達，試驗重復3次，采用2-ΔΔCt法分析相對表達量。

表1 實時熒光定量PCR引物序列Table 1 Real-time fluorescent quantitative PCR primer sequences

(2)蛋白水平的檢測。采用Western blot法檢測WDR5重組蛋白的表達情況。收集轉染后的PGCs細胞，用RIPA裂解液進行蛋白裂解，冰上孵育40 min后，4 ℃、12 000g離心15 min，收集上清液。用BCA試劑盒測定上清液蛋白濃度后,取20 μg蛋白樣品，將其用RIPA裂解液稀釋至20 μL,加入4 μL 6×SDS-PAGE蛋白緩沖液后，100 ℃變性30 min。將各組蛋白用12%的SDS-PAGE進行分離，半干法將蛋白轉移到硝酸纖維素膜。室溫下用體積分數1%的牛血清白蛋白封閉液孵育2 h，4 ℃下將膜和特定一抗(GST抗體)孵育過夜，TBST清洗3次后，加入相應二抗(羊抗免IgG)孵育2 h，TBST洗滌3次，用ECL化學發(fā)光試劑盒進行顯影。

1.2.6 WDR5蛋白過表達對PGCs形成相關基因的影響 以β-actin為內參基因，采用RT-qPCR試劑盒檢測WDR5對PGCs形成相關基因(DDX4、C-KIT、BLIMP1、LIN28B和PRDM14)表達的影響。試驗重復3次，采用2-ΔΔCt法分析相對表達量。利用Primer 5.0軟件，針對上述各基因CDS區(qū)設計引物，交由南京擎科生物科技有限公司合成。引物信息見表1。

1.2.7 數據分析 利用SPSS統(tǒng)計軟件建立數據庫并處理數據，用單因素方差分析檢驗組間差異，采用LSD法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 WDR5氨基酸序列分析

分析結果顯示，WDR5核酸序列可編碼334個氨基酸，分子質量為36 565.41 u，理論等電點(PI)為8.54，半衰期為30 h，不穩(wěn)定指數為30.81。WDR5含有1個保守結構域WD40，該結構域含有7個WD40重復序列。結果說明,WDR5蛋白質為穩(wěn)定蛋白，保守結構域為WD40。

2.2 WDR5蛋白質理化性質分析

結果顯示，WDR5親水性高，不屬于膜蛋白；WDR5不含跨膜結構域，無信號肽表達。結果表明，WDR5不屬于跨膜蛋白，可能為核表達蛋白。

2.3 WDR5三級結構和互作蛋白分析

用SWISS-MODEL對雞WDR5進行同源建模，結果匹配到的蛋白質描述為WDR5，與雞的WDR5一致度為96.71%，大于30%，說明數據可用；全球性模型質量估測(Global Model Quality Estimation, GMQE)值為0.93，說明數據質量較好；匹配度QMEAN4為-0.68，接近0，說明待測蛋白與模板蛋白匹配度高。以上結果說明，雞WDR5蛋白保守性較高。

利用String在線網站對WDR5的互作蛋白進行預測，結果表明雞上預測到的與WDR5結合的蛋白包括DPY30、類ASH2蛋白(ASH2 Like，ASH2L)、RB結合蛋白5(RB Binding Protein 5，RBBP5)和MLL2等組蛋白甲基化酶compass組分。該結果進一步說明，WDR5的保守性較高，屬于compass組分成員(圖1)。

圖1 雞WDR5互作蛋白分析Fig.1 Interaction protein analysis of chicken WDR5

2.4 重組真核表達載體pcDNA3.1-WDR5-GST的鑒定

對構建的pcDNA3.1-WDR5-GST進行KpnⅠ/EcoR Ⅰ 雙酶切，獲得了1 677 bp的目的片段和約5 400 bp的載體片段(圖2)。測序結果顯示，WDR5已插入pcDNA3.1(+)載體，未發(fā)生移碼和突變現象。KpnⅠ/EcoR Ⅰ 雙酶切和測序結果說明，重組真核表達載體pcDNA3.1-WDR5-GST構建成功，可用于后續(xù)試驗。

2.5 WDR5重組蛋白在PGCs細胞中的表達

RT-qPCR結果(圖3-A)顯示，轉染pcDNA3.1-WDR5-GST載體后，WDR5基因的表達水平極顯著高于對照組(P<0.01)。Western blot結果(圖3-B)顯示，重組蛋白分子質量約為62 ku(GST標簽蛋白約26 ku，WDR5約36 ku)。以上結果說明，重組真核表達載體能穩(wěn)定表WDR5重組蛋白。

M.DL10000 DNA Marker；1.Kpn Ⅰ/EcoR Ⅰ雙酶切產物；2.pcDNA3.1-WDR5-GST M.DL10000 DNA Marker;1.Restriction enzyme fragments by Kpn Ⅰ/EcoR Ⅰ;2.pcDNA3.1-WDR5-GST 圖2 重組真核表達載體pcDNA3.1-WDR5-GST的雙酶切鑒定Fig.2 Double enzyme digestion identification of recombinant plasmid pcDNA3.1-WDR5-GST

A.基因水平檢測；B.蛋白水平檢測。**.表示與對照組差異極顯著(P<0.01)，圖4同A.The detection of gene expression;B.The detection of protein expression.**.This means that the difference between the two groups is very significant (P<0.01),the same for Fig.4

2.6 WDR5過表達對PGCs形成相關基因的影響

收集轉染后的PGCs細胞進行RT-qPCR檢測，結果(圖4)顯示，過表達WDR5后，PGCs標記基因DDX4、C-KIT、BLIMP1、LIN28B和PRDM14表達水平均極顯著升高(P<0.01)，說明WDR5過表達對PGCs形成相關基因的表達具有重要的調控作用。

圖4 WDR5過表達條件下PGCs相關基因表達水平的變化Fig.4 Expression of PGCs related genes after overexpression of WDR5

3 討 論

WDR5是組蛋白甲基化復合物組分之一，具有典型的WD40核心亞基。WD40結構域通常以螺旋形式出現，包含7個區(qū)域。特異性的WD40螺旋結構有助于蛋白之間的結合[7,15]。本研究通過生物信息學分析發(fā)現，雞WDR5蛋白具有典型的WD40結構域，該結構域含有7個WD40重復序列，說明在雞上WDR5具有物種保守性。現有研究認為，WD40結構域參與了多種生物學過程，包括信號轉導、囊泡運輸、細胞骨架組裝、細胞周期調控、細胞凋亡、染色質動力學和轉錄調控等[16-20]。含有WD40亞基的WDR5可作為組蛋白甲基化酶復合體成分，基于前期研究得出的H3K4me2參與雞PGCs形成[21]的結果，本研究發(fā)現，WDR5基因過表達會提高PGCs相關基因的表達水平。有研究表明，在雞上降低DDX4會減少PGCs的數量[22]；BLIMP1、PRDM14是決定生殖細胞命運的關鍵基因[23-24]，C-KIT和LIN28B則是PGCs生長發(fā)育必不可少的基因[25]。Robert等[26]發(fā)現，WDR5在維持秀麗隱桿線蟲生殖細胞多能性方面有重要作用。據此推測，WDR5在雞PGCs形成中可能也有重要作用，而其具體機制仍需進一步研究。

本研究發(fā)現，WDR5不含跨膜結構域，親水性高，無信號肽表達，說明其不屬于膜蛋白。研究表明，WDR5是高度保守的核蛋白，參與許多與染色質相關的生物學過程[27]，因此推測雞WDR5可能在細胞核中表達。三級結構分析發(fā)現，雞WDR5具有高度保守性，匹配一致度為96.71%。有研究表明，WDR5通常與ASH2L、DPY30和RBBP5組成甲基化酶復合體[28]，可激活甲基轉移酶MLL家族活性。且WDR5含有特殊的“Win motif”結構，而該結構是其與MLL家族蛋白結合所必需的。以上研究說明，WDR5通常以“支架”蛋白的形式在復合體中發(fā)揮作用[29-30]。本研究發(fā)現，雞WDR5的互作蛋白包括人們所熟知的復合體組分ASH2L、RBBP5和DPY30，復合體蛋白激活的核心蛋白可能為MLL家族的MLL2蛋白。Dias等[30]發(fā)現，果蠅中WDR5與NSL的2個亞基KANSL1和KANSL2發(fā)生相互作用，這與本研究結果(KAT8調控因子NSL復合物亞基3(KAT8 Regulatory NSL Complex Subunit 3，KANSL3)可能與WDR5結合)不同，造成這一差異的原因可能是物種不同所致，但這還需進一步驗證。

基于WDR5蛋白的互作能力，探究WDR5在原始生殖細胞形成過程中的作用機制時，需要可用于Co-IP和CHIP試驗的抗體。然而由于雞種屬的特殊性，目前尚無同時滿足二者要求的商品化抗體。因此，本研究構建了重組pcDNA3.1-WDR5-GST真核表達載體，通過定量和Western blot驗證其活性，以用于后續(xù)Co-IP和CHIP試驗。

4 結 論

雞WDR5蛋白含有典型的WD40亞基，不含跨膜結構域，也無信號肽表達，為親水性蛋白，具有高度保守性，互作蛋白包括ASH2L、RBBP5、DPY30和KANSL3。成功構建了pcDNA3.1-WDR5-GST重組真核表達載體，并驗證了其mRNA和蛋白水平的活性；過表達WDR5可提高PGCs形成相關基因的表達水平。