吳磊磊 張俊忠

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院運(yùn)動(dòng)損傷骨科，山東 濟(jì)南 250014)

骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)指由多種因素引起關(guān)節(jié)軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率約為2%～6%，以中老年患者多見(jiàn)，女性多于男性[1-2]。OA在40歲人群的發(fā)病率為10%～17%，60歲以上則達(dá)50%，而在75歲以上人群，患病率可達(dá)80%，最終致殘率高達(dá)53%，隨著醫(yī)療條件改善和人類壽命的延長(zhǎng)，OA成為影響老年人生活質(zhì)量和健康狀態(tài)的重要疾病之一[3]。主要病變是關(guān)節(jié)軟骨的退行性變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生，好發(fā)于負(fù)重大、活動(dòng)多的關(guān)節(jié)，如脊柱、膝、髖關(guān)節(jié)等。臨床表現(xiàn)為疼痛、活動(dòng)障礙、僵硬、腫大畸形等。發(fā)病因素目前尚不明確，有學(xué)者認(rèn)為主要與高齡、肥胖、關(guān)節(jié)疲勞、機(jī)械損傷、寒冷、過(guò)度運(yùn)動(dòng)和遺傳等相關(guān)[4]。

OA在中醫(yī)上屬于“骨痹”“痹證”范疇，最早可見(jiàn)于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，《素問(wèn)·長(zhǎng)刺節(jié)論篇》：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹?！惫顷P(guān)節(jié)炎在國(guó)內(nèi)，中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎仍是優(yōu)先選擇手段[5]。中醫(yī)藥治療骨關(guān)節(jié)炎具有療效顯著、副作用小、費(fèi)用低等優(yōu)勢(shì)[6]。

桃紅四物湯出自《醫(yī)宗金鑒》，由桃仁、紅花、川芎、當(dāng)歸、熟地黃、白芍六味藥組成，具有祛瘀、行氣、活血功效，方中以桃仁、紅花為君，主活血化瘀之功；熟地黃、當(dāng)歸性甘溫，佐以滋陰養(yǎng)肝之效；白芍養(yǎng)血和營(yíng)，以增強(qiáng)補(bǔ)血之力；川芎活血行氣、調(diào)暢氣血，加強(qiáng)活血。全方配伍得當(dāng)，藥性和緩，補(bǔ)血而不滯血，和血而不傷血。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)(Network pharmacology)由Hopkins在2007年提出的一門新興學(xué)科，通過(guò)系統(tǒng)觀察藥物對(duì)疾病的干預(yù)和影響，預(yù)測(cè)藥物的致病作用機(jī)制，評(píng)估藥物的有效性等[7]，為藥物的研發(fā)和應(yīng)用提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1桃紅四物湯相關(guān)靶點(diǎn)篩選及藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過(guò)中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫(kù)和分析平臺(tái)[8](TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)分別以“桃仁”、“紅花”、“當(dāng)歸”、“川芎”、“熟地黃”、“白芍”為關(guān)鍵詞檢索桃紅四物湯的成分，根據(jù)口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30和類藥性(Drug likeness，DL)≥0.18為ADME屬性值對(duì)活性成分進(jìn)行篩選，得到6個(gè)藥物中所含有的成分，并利用化學(xué)成分進(jìn)行檢索，得到相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，運(yùn)用Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)[9](https://www.uniprot.org/)查詢并規(guī)范相對(duì)應(yīng)的官方基因名稱(official gene symbol)，合并并刪除重復(fù)值。運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件[10]構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，利用Cytoscape 3.7.2軟件中的“Network Analyzer”進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觥?/p>

1.2OA相關(guān)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及韋恩圖制作 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)[11](https://www.genecards.org/Guide/Publications)、TTD數(shù)據(jù)庫(kù)[12](http://db.idrblab.net/ttd/)以“Osteoarthritis”為關(guān)鍵詞檢索與OA相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，合并靶點(diǎn)并刪除重復(fù)值，建立OA相關(guān)疾病基因靶點(diǎn)數(shù)據(jù)集。通過(guò)Venny在線制作平臺(tái)(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將藥物基因靶點(diǎn)和疾病基因靶點(diǎn)相映射，繪制韋恩圖并獲得藥物-疾病交集基因靶點(diǎn)。

1.3PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析 將得到的藥物-疾病交集基因靶點(diǎn)導(dǎo)入到STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù)[13](https://string-db.org/)中構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，設(shè)置物種種類為“Home sapiens”(人類)，最低互相作用閾值設(shè)置為“high confidence”(>0.700),隱藏網(wǎng)絡(luò)中未連接的節(jié)點(diǎn)，其余均為默認(rèn)值，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖和TSV文件，將TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中，構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，篩選核心靶點(diǎn)信息。

1.4靶點(diǎn)功能與通路的富集分析 為了進(jìn)一步了解藥物-疾病的潛在治療基因靶點(diǎn)的功能和在信號(hào)通路中發(fā)揮的作用，將交集基因靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)[14](https://david.ncifcrf.gov/)，物種種類設(shè)置為“Home sapiens”(人類)，設(shè)置P<0.05，進(jìn)行GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析。GO分析選擇細(xì)胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)和生物過(guò)程(biological process，BP)。利用Omicshare在線云平臺(tái)繪制GO富集分析分類柱狀圖、氣泡圖和KEGG信號(hào)通路富集分析氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1桃紅四物湯活性成分的獲取 通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到桃紅四物湯中成分共730個(gè)，其中白芍85個(gè)、川芎189個(gè)、當(dāng)歸125個(gè)、紅花189個(gè)、熟地黃76個(gè)、桃仁66個(gè)。以O(shè)B≥30，DL≥0.18為ADME屬性值對(duì)藥物成分進(jìn)行篩選，共篩選出69個(gè)活性成分，其中13個(gè)來(lái)自白芍、7個(gè)來(lái)自川芎、2個(gè)來(lái)自當(dāng)歸、22個(gè)來(lái)自紅花、2個(gè)來(lái)自熟地黃、23個(gè)來(lái)自桃仁，見(jiàn)表1。檢索藥物靶點(diǎn)基因得到440個(gè)，白芍86個(gè)、川芎24個(gè)、當(dāng)歸44個(gè)、紅花208個(gè)、熟地黃32個(gè)、桃仁46個(gè)，合并并刪除重復(fù)值得到桃紅四物湯藥物靶點(diǎn)基因220個(gè)。

表1 桃紅四物湯中部分活性化合物成分

2.2藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建桃紅四物湯藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，見(jiàn)圖1。該網(wǎng)絡(luò)包含266個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)，480條邊(edge)，倒三角形代表藥物，六邊形代表化合物成分，菱形代表靶點(diǎn)基因。利用“Network analyze”功能對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治觯鶕?jù)度值(Degree)大小設(shè)置節(jié)點(diǎn)的大小及顏色，顏色越深、面積越大表示該節(jié)點(diǎn)越重要。在藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中，度值排名前5位的化合物分別為：kaempferol(山柰酚)、beta-sitosterol(β-谷甾醇)、baicalein(黃芩素)、stigmasterol(豆甾醇)、beta-carotene(β-胡蘿卜素)。

圖1 桃紅四物湯“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.3桃紅四物湯治療OA的潛在治療靶點(diǎn) 通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)和TTD數(shù)據(jù)庫(kù)檢索OA疾病靶點(diǎn)，合并及刪除重復(fù)值后共得到疾病靶點(diǎn)1353個(gè)，通過(guò)Venny在線平臺(tái)將藥物靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)相映射，共得到交集靶點(diǎn)112個(gè)，見(jiàn)圖2。

圖2 桃紅四物湯治療OA潛在靶點(diǎn)Venny圖

2.4PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 將獲得的112個(gè)交集靶點(diǎn)上傳至STRING 11.0平臺(tái)，最低互相作用閾值設(shè)置為“high confidence”(>0.700),隱藏5個(gè)未參與的節(jié)點(diǎn)，將保存的TSV文件導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件中進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，共獲得107個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)、1061條邊(edge),平均度值19.3，按照度值進(jìn)行排布，度值>20的節(jié)點(diǎn)有43個(gè)。度值越大證明該節(jié)點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)中的位置越關(guān)鍵，作用可能越重要。得到桃紅四物湯治療OA的潛在靶點(diǎn)蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)，見(jiàn)圖3，度值越大，在網(wǎng)絡(luò)圖中越明亮，圖形面積也越大。根據(jù)度值篩選排名前11的靶點(diǎn)(Degree>40)用柱狀圖表示，見(jiàn)圖4(X軸表示靶點(diǎn)名稱，Y軸表示度值)。

圖3 桃紅四物湯治療OA潛在靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 PPI網(wǎng)絡(luò)中排名前11的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.5GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析 將112個(gè)潛在治療靶點(diǎn)導(dǎo)入到DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，共得到GO富集條目592條(P<0.05)，包括50種細(xì)胞組分(cellular component，CC)、82類分子功能(molecular function，MF)、460個(gè)生物過(guò)程(biological process，BP)。GO富集分析柱狀圖見(jiàn)圖5(藍(lán)色表示BP、黃色表示MF、綠色表示CC)。BP方面主要富集在細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、代謝過(guò)程、信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、信號(hào)調(diào)節(jié)等；MF主要富集在蛋白結(jié)合、離子結(jié)合、催化活性、酶活性調(diào)節(jié)、分子功能調(diào)節(jié)等；CC主要富集在細(xì)胞膜、細(xì)胞器、核、質(zhì)膜、細(xì)胞外區(qū)域等。將富集排名前20條目用氣泡圖表現(xiàn)，見(jiàn)圖6(橫軸表示所占比例，縱軸表示GO分析條目，面積越大表示該條目基因越多)。

圖5 GO富集分析二級(jí)分類

圖6 GO富集分析結(jié)果

KEGG信號(hào)通路富集分析共得到106條通路(P<0.05)，涉及PI3K/Akt信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、p53信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路等。選取富集排名前20的信號(hào)通路用氣泡圖表示，見(jiàn)圖7(橫軸表示比例，縱軸為信號(hào)通路，面積越大表示該通路基因數(shù)目越多)。根據(jù)文獻(xiàn)檢索[15-18]發(fā)現(xiàn)與骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)的信號(hào)通路有：PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、JAK/STAT3信號(hào)通路、Wnt信號(hào)通路、TGF-β信號(hào)通路等。選取關(guān)鍵通路，利用Cytosape 3.7.2軟件構(gòu)建“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)，見(jiàn)圖8(綠色圓形表示通路，藍(lán)色菱形表示靶點(diǎn))。

圖7 KEGG信號(hào)通路富集分析結(jié)果

圖8 “靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)

3 討論

隨著人類壽命的延長(zhǎng)及人口老齡化加劇，OA成為影響老年人生活質(zhì)量的主要疾病之一，并且隨著現(xiàn)代人活動(dòng)頻率和強(qiáng)度的不斷增加，OA的發(fā)病率呈現(xiàn)出不斷年輕化的態(tài)勢(shì)[19]。當(dāng)前OA的治療目的是緩解癥狀、改善功能、延緩進(jìn)程及矯正畸形。桃紅四物湯具有調(diào)節(jié)免疫、抗感染、鎮(zhèn)痛、擴(kuò)張血管、抗炎等作用[20-21]。朱蘭妃[22]等運(yùn)用桃紅四物湯治療氣滯血瘀型膝骨性關(guān)節(jié)炎取得了較好的療效。宋敏[23]等報(bào)道桃紅四物湯可能通過(guò)與MMP-1，TIMP-1上的酶結(jié)合位點(diǎn)相結(jié)合而對(duì)軟骨起到保護(hù)修復(fù)作用。

通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索桃紅四物湯成分及藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治霭l(fā)現(xiàn)，按照度值(Degree)進(jìn)行排布，桃紅四物湯中排名前5的成分為：山柰酚、β-谷甾醇、黃芩素、豆甾醇、β-胡蘿卜素。山奈酚是一類廣泛存在于蔬菜、水果及中藥材中的黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗癌等多種功能[24]。山奈酚可以通過(guò)抑制炎癥因子的表達(dá)而起到抗炎效果[25]。曾意榮等[26]認(rèn)為山奈酚可以通過(guò)調(diào)控雌激素受體活性促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖、分化和礦化達(dá)到預(yù)防骨質(zhì)疏松的目的。β-谷甾醇和豆甾醇都屬于植物甾醇，具有抗癌、抗氧化、抗炎等作用，研究表明β-谷甾醇抗炎作用類似氫化可的松和羥基保泰松，且無(wú)可的松類藥物的副作用，還具有類似阿司匹林(乙酰水楊酸)的退熱作用,而不具有潰瘍性[27-28]。研究表明，黃芩素可以通過(guò)干擾花生四烯酸的代謝通路和抑制核因子的活性以及細(xì)胞因子的分泌而發(fā)揮解熱鎮(zhèn)痛抗炎的作用[29]。有學(xué)者通過(guò)大鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)黃芩素可以通過(guò)抑制血管通透性的增加而減輕骨關(guān)節(jié)炎的繼發(fā)損害[30]。

在桃紅四物湯治療OA的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)結(jié)果分析中，共有107個(gè)靶點(diǎn)基因，通過(guò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)桃紅四物湯治療OA的潛在關(guān)鍵靶點(diǎn)有：IL6、TNF、JUN、VEGFA、IL1B，度值分別為：56、55、53、52、41。IL6和IL1B屬于白細(xì)胞介素類，可以通過(guò)激活相應(yīng)通路促進(jìn)炎性介質(zhì)的釋放，IL6在外周血中的水平與KOA的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性，不僅可以通過(guò)作用T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞的自分泌形式影響軟骨細(xì)胞的正常增殖，還可以通過(guò)增加滑膜組織的炎癥細(xì)胞刺激軟骨細(xì)胞的增殖，最終加重軟骨細(xì)胞的破壞，影響OA的發(fā)展[31-32]。IL1B(IL-1β)是IL-1中的一種亞型，可以通過(guò)NF-κB、MAPK信號(hào)通路調(diào)控,提高促炎性因子水平，從而增強(qiáng)炎癥反應(yīng)釋放炎癥介質(zhì)，引發(fā)關(guān)節(jié)軟骨退變、破壞及降解[33]。TNF(腫瘤壞死因子)作用與IL-1類似。VEGFA(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A)對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖、遷移和血管通透性具有較強(qiáng)的作用。研究表明，VEGFA可以上調(diào)MMP-1和MMP-3使軟骨基質(zhì)降解加速骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展[34]。

桃紅四物湯治療OA的GO富集分析和KEGG信號(hào)通路富集分析可以看出，GO分析中生物過(guò)程主要集中在細(xì)胞分化、炎癥反應(yīng)、代謝過(guò)程、信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡、信號(hào)調(diào)節(jié)等，在治療過(guò)程中起到了關(guān)鍵作用。KEGG信號(hào)通路富集分析中，PI3K/Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的增殖、凋亡分化等方面起著重要作用，通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞的凋亡參與到以骨破壞為主要特征的骨關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松等相關(guān)疾病中[35]。李曉燕等[36]在骨關(guān)節(jié)炎大鼠中發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號(hào)通路受抑制情況下會(huì)導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的凋亡和自噬，加速骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展。MAPK信號(hào)通路通過(guò)3級(jí)激酶級(jí)聯(lián)的方式進(jìn)行信號(hào)傳導(dǎo)，與軟骨細(xì)胞的增殖、分化、凋亡和炎性反應(yīng)密切相關(guān)，是OA發(fā)生發(fā)展中極為重要的通路，其中MAPKs家族通路中p38MAPK、JNK及ERK1/2與OA關(guān)系最為密切[37]。Ma[38]等發(fā)現(xiàn)，p38MAPK信號(hào)通路在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)向成骨、成軟骨分化過(guò)程中起到良性促進(jìn)作用。JAK/STAT3信號(hào)通路的激活可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的破壞、促進(jìn)軟骨下骨硬化、滑膜細(xì)胞增殖和滑膜炎等加重OA的發(fā)生發(fā)展[39]。Hayashi等[40]發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21(Cyclin dependent kinase inhibitor P21,P21)基因缺失的轉(zhuǎn)基因小鼠中軟骨蛋白多糖丟失加重，p-STAT3和基質(zhì)金屬蛋白酶-13陽(yáng)性細(xì)胞的百分比更高，說(shuō)明JAK/STAT3信號(hào)通路可能參與了生物因子缺乏(如P21缺乏)介導(dǎo)的軟骨損傷的過(guò)程。

綜上所述，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析桃紅四物湯治療OA的藥理學(xué)機(jī)制，桃紅四物湯中山柰酚、β-谷甾醇、黃芩素等成分通過(guò)PI3K/Akt信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、JAK/STAT3信號(hào)通路等調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和炎癥反應(yīng)等發(fā)揮治療作用，為桃紅四物湯治療OA提供了理論支持。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為研究中醫(yī)中藥的一種新方法，但是目前仍存在缺乏相關(guān)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和臨床驗(yàn)證，因此其具體治療機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。