宋國(guó)勝，廖師夷，王友娟，宦雙燕

湖南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，長(zhǎng)沙 410082

半導(dǎo)體聚合物納米粒子(Semiconducting Polymer Nanoparticles，SPNs)是由疏水性半導(dǎo)體聚合物通過(guò)納米組裝的方法制備，并能直接分散在水溶液中的一種新型納米材料[1,2]。SPNs本身的特殊分子結(jié)構(gòu)使其具有優(yōu)異的光學(xué)性能，并具有高生物相容性和可降解性的特點(diǎn)，能夠很好地克服無(wú)機(jī)量子點(diǎn)中普遍存在的體內(nèi)長(zhǎng)期滯留和生物毒性等問(wèn)題[3,4]。因而，SPNs在生物標(biāo)志物的檢測(cè)上具有極大的優(yōu)勢(shì)和潛力。

活性氧物種(Reactive Oxygen Species，ROS)是指機(jī)體內(nèi)或者自然環(huán)境中含氧并且性質(zhì)活潑的物質(zhì)的總稱。常見(jiàn)的ROS包括H2O2、1O2、HClO、·OH、ONOO?等等[5–7]。生物體內(nèi)ROS的正常水平對(duì)維持體內(nèi)的氧化還原動(dòng)態(tài)平衡起著重要作用。在外源刺激(如紫外線或X射線)的刺激下，ROS會(huì)劇烈產(chǎn)生，導(dǎo)致機(jī)體的氧化還原平衡失調(diào)[8,9]，進(jìn)而發(fā)生一系列疾病，如癌癥、動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血栓等[10]。因此，高靈敏地檢測(cè)生物體內(nèi)ROS的含量變化對(duì)于進(jìn)一步了解其生理功能和準(zhǔn)確診斷ROS相關(guān)疾病具有重要意義。

傳統(tǒng)單信號(hào)輸出的檢測(cè)方法易受到檢測(cè)過(guò)程中環(huán)境因素的干擾。與之相比，通過(guò)多信號(hào)輸出的比率型檢測(cè)方法，可使用多種不同信號(hào)相互參照，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確度，進(jìn)而有望消除因探針濃度、光漂白、檢測(cè)設(shè)備等因素所造成的數(shù)據(jù)失真。因此，該方法在細(xì)胞和動(dòng)物活體水平進(jìn)行目標(biāo)物檢測(cè)方面有著廣泛應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)基于半導(dǎo)體聚合物(PFODBT)對(duì)ROS的高穩(wěn)定性，將PFODBT作為信號(hào)參考分子，利用染料分子(IR775s)對(duì)ROS響應(yīng)性變化的特性；將IR775s作為響應(yīng)分子，并通過(guò)納米共沉淀法制備了有機(jī)聚合物納米探針(SPNs)。該納米探針通過(guò)比率型吸光度和比率型熒光的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液中的ROS(ClO?和ONOO?)的高靈敏檢測(cè)。學(xué)生在應(yīng)用光譜分析方法進(jìn)行活性氧物種的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，不僅可以掌握紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀和熒光光譜儀的使用方法和原理，而且鍛煉了分析和處理數(shù)據(jù)的能力，能夠引導(dǎo)學(xué)生養(yǎng)成勤于思考的習(xí)慣，并激發(fā)學(xué)生的創(chuàng)新能力。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

1) 掌握納米共沉淀法制備有機(jī)納米粒子的原理、方法及表征手段。

2) 了解比率型吸光度和熒光檢測(cè)方法的基本原理、優(yōu)勢(shì)及在分析檢測(cè)中的應(yīng)用。

3) 了解紫外-可見(jiàn)吸收光譜儀和熒光光譜儀的結(jié)構(gòu)和測(cè)量原理，掌握儀器基本操作方法。

4) 學(xué)會(huì)使用分析軟件處理和分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)(比率型計(jì)算以及檢測(cè)限計(jì)算方法)。

2 實(shí)驗(yàn)原理

2.1 納米共沉淀法制備有機(jī)納米粒子的原理

如圖1所示，本實(shí)驗(yàn)中使用有機(jī)半導(dǎo)體聚合物分子(聚[2,7-(9,9-二辛基芴)-alt-4,7-雙(噻吩-2-基)苯并-2,1,3-噻二唑]，簡(jiǎn)稱PFODBT)、熒光染料分子(2-[2-[2-(β-羧乙硫基)-3-[2-(1,3-二氫-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亞烷基)-亞乙基-]-1-環(huán)己烯-1-基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓，簡(jiǎn)稱IR775s)和表面活性劑(Pluronic F127，簡(jiǎn)稱F127)通過(guò)疏水-疏水相互作用，自組裝形成納米粒子(PFODBT-IR775s)。

圖1 納米顆粒合成原理示意圖

2.2 比率型吸光度法的檢測(cè)原理

根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，低濃度的ROS(ClO?/ONOO?)可選擇性地破壞IR775s分子結(jié)構(gòu)，顯著降低IR775s的特征吸收峰和熒光強(qiáng)度[11,12]。然而，PFODBT對(duì)低濃度的ROS是相對(duì)穩(wěn)定的。通過(guò)納米共沉淀法將PFODBT和IR775s自組裝成納米粒子后，PFODBT-IR775s納米探針同時(shí)具有兩者的特征吸收峰。IR775s的特征吸收峰(775 nm)作為響應(yīng)信號(hào)，而PFODBT的特征吸收峰(550 nm)作為參考信號(hào)。隨著溶液中ROS的濃度加大，IR775s逐漸被破壞，775 nm處的吸收峰降低；同時(shí)PFODBT的特征吸收峰(550 nm)保持不變。根據(jù)兩處的吸光度的比值(A550/A775)的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)ROS的比率型吸光度檢測(cè)(圖2)。

圖2 有機(jī)納米探針比率型吸光度法檢測(cè)ROS示意圖

2.3 比率型熒光法的檢測(cè)原理

熒光能量共振轉(zhuǎn)移(FRET)是距離很近的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。當(dāng)兩個(gè)熒光分子的距離在10 nm以內(nèi)，并且供體分子的發(fā)射光譜與受體分子的吸收光譜重疊時(shí)，兩者可產(chǎn)生FRET，使得供體的熒光強(qiáng)度降低，而受體發(fā)射的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)[13]。在納米探針PFODBT-IR775s中，由于PFODBT的熒光發(fā)射波長(zhǎng)與IR775s的吸收波長(zhǎng)相匹配，PFODBT的熒光能量轉(zhuǎn)移給IR775s，PFODBT的熒光發(fā)射強(qiáng)度(695 nm)將會(huì)降低。當(dāng)ROS(ClO?/ONOO?)破壞IR775s后，PFODBT與IR775s之間的FRET效應(yīng)減弱，導(dǎo)致IR775s熒光(825 nm)的降低和PFODBT熒光(695 nm)的恢復(fù)。根據(jù)695 nm和825 nm處的熒光強(qiáng)度比值(F695/F825)變化，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)ROS的比率型熒光檢測(cè)(圖3)。

圖3 有機(jī)納米探針比率型熒光法檢測(cè)ROS示意圖

3 試劑與儀器

3.1 實(shí)驗(yàn)試劑

聚[2,7-(9,9-二辛基芴)-alt-4,7-雙(噻吩-2-基)苯并-2,1,3-噻二唑](PFODBT)，2-[2-[2-氯-3-[2-(1,3-二氫-1,3,3-三甲基-2H-吲哚-2-亞基)-亞乙基]-1-環(huán)己烯-1-基]-乙烯基]-1,3,3-三甲基-3H-吲哚鎓氯化物(IR775Cl)，Pluronic F127 (F127)購(gòu)于Sigma-Aldrich。3-巰基丙酸購(gòu)于梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。二甲亞砜(DMSO)、三乙胺、無(wú)水Na2SO4、2-丙醇、二氯甲烷(CH2Cl2)、四氫呋喃(THF)、NaClO溶液、NaCl、NaNO2、HCl、H2O2、NaOH購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。NaClO溶液和ONOO?溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，IR775s按文獻(xiàn)方法[12]合成。

3.2 實(shí)驗(yàn)儀器

50 mL圓底燒瓶、血清瓶(5 mL、50 mL)、100 KD MWCO超濾管。其他大型儀器見(jiàn)表1。

表1 實(shí)驗(yàn)儀器

4 實(shí)驗(yàn)步驟

4.1 IR775s的合成

將IR775Cl (519.55 mg，1.0 mmol)，3-巰基丙酸(265 μL，3.0 mmol)和三乙胺(425 μL，3.0 mmol)依次加入到10 mL的DMSO (二甲亞砜)溶液中，之后在室溫條件下將混合溶液攪拌20 h。然后，加入二氯甲烷，并用氯化鈉飽和溶液洗滌整個(gè)混合液系統(tǒng)，分液后得到有機(jī)相。再將有機(jī)相經(jīng)無(wú)水Na2SO4干燥，過(guò)濾并通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，獲得IR775s粗產(chǎn)物。最后，粗產(chǎn)物用硅膠柱色譜法純化(CH2Cl2/MeOH，體積比10 : 1)，得到綠色固體收集在離心管中，常溫避光儲(chǔ)存。圖4考慮到該部分時(shí)間較長(zhǎng)，IR775s可由實(shí)驗(yàn)教師提前制備。

圖4 合成染料分子IR775s的反應(yīng)原理圖

4.2 IR775s水溶液的配制

在分析天平上準(zhǔn)確稱取1 mg的IR775s固體于1.5 mL離心管中，加入1 mL DMSO，配成1 mg·mL?1的溶液。然后，取10 μL的IR775s/DMSO溶液，加至裝有90 μL超純水的1.5 mL離心管中，配成100 μg·mL?1的IR775s水溶液。用錫箔紙包封好離心管，放置于4 °C冰箱待用。

4.3 ROS溶液的配制

ONOO?溶液根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道配制[14]。為了配制ONOO?溶液，將5 mL的NaNO2溶液(0.6 mol·L?1)與350 μL的H2O2溶液(0.7 mol·L?1)混合，隨后在攪拌下加入250 μL的HCl溶液(0.6 mol·L?1)預(yù)酸化。再將上述溶液快速加入到10 mL的NaOH (1.5 mol·L?1)溶液中，混合均勻。進(jìn)一步添加80 mg的MnO2除去過(guò)量的H2O2。最后，使用0.2 μm過(guò)濾器過(guò)濾溶液。所制備的ONOO?溶液，保存在?20 °C下備用。使用前，通過(guò)紫外-可見(jiàn)光譜儀測(cè)定ONOO?溶液的吸光度，并計(jì)算濃度(A=εbc，ε302nm= 1670 L·mol?1?cm?1，b= 1 cm)。

為了配制ClO?溶液，取58 μL NaClO溶液母液加入到4942 μL超純水中，得到濃度為10 mmol·L?1的ClO?溶液。

4.4 制備有機(jī)納米粒子(SPNs)

有機(jī)納米粒子按文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的方法合成[2]。首先，將PFODBT、IR775s、5 mg F127溶于1 mL THF中，在超聲條件下將其混勻(1–3 min)，然后將混合溶液快速注入到9 mL的超純水中(保持超聲狀態(tài))，并繼續(xù)超聲8–10 min。之后，關(guān)閉超聲，停止反應(yīng)，將超聲混合后的溶液轉(zhuǎn)移到50 mL的圓底旋蒸瓶中，在45 °C下旋蒸10 min (轉(zhuǎn)速100 r·min?1)至燒瓶中不再產(chǎn)生明顯氣泡。最后，將溶液加入到100 KD超濾管中，超濾清洗三次，放置在4 °C冰箱中，待用。其中，為了制備PFODBT納米粒子，將100 μg的PFODBT納米顆粒和5 mg的F127溶于1 mL THF中；為了制備PFODBT-IR775s納米粒子，將128 μg的PFODBT、384 μg的IR775s和5 mg的F127溶解于1 mL THF中。

4.5 透射電鏡(TEM)和動(dòng)態(tài)光散射(DLS)表征

TEM樣品的制備：用移液槍吸取SPNs溶液，滴在一個(gè)干凈平滑的銅網(wǎng)片表面，使銅網(wǎng)片均勻的布滿一層潤(rùn)滑的樣品溶液，在紅外燈照射下干燥銅網(wǎng)，直至銅網(wǎng)片表面的溶液完全干燥，再使用TEM進(jìn)行觀察。

動(dòng)態(tài)光散射制樣：將4 μL的100 μg·mL?1SPNs分散在1 mL的超純水中，超聲8–10 min。

4.6 比率型檢測(cè)溶液中ROS

為了檢驗(yàn)納米探針的可行性，我們首先測(cè)試了IR775s水溶液和PFODBT納米顆粒分別對(duì)ROS的響應(yīng)。

檢測(cè)ClO?：將20 μL的SPNs (100 μg·mL?1)分別與0–24 μL 2 mmol·L?1ClO?溶液混合，之后通過(guò)PBS緩沖液(pH = 7.4)補(bǔ)齊至250 μL，室溫下反應(yīng)30 min后，分別測(cè)定這些溶液的紫外-可見(jiàn)光譜和熒光光譜。

檢測(cè)ONOO?：將20 μL的SPNs (100 μg·mL?1)分別與0–96 μL 500 μmol·L?1ONOO?溶液混合，之后通過(guò)PBS緩沖液(pH = 7.4)補(bǔ)齊至250 μL，室溫下反應(yīng)30 min后，分別測(cè)定這些溶液的紫外-可見(jiàn)光譜和熒光光譜。

4.7 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的注意事項(xiàng)

1) 納米探針在合成以及長(zhǎng)期儲(chǔ)存時(shí)，需要避光，避免探針?lè)肿臃纸猓?/p>

2) 由于使用某些有機(jī)溶劑，實(shí)驗(yàn)操作需要在通風(fēng)條件下進(jìn)行；

3) 除去四氫呋喃時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)時(shí)間應(yīng)在10 min以上，以盡量除凈四氫呋喃。

5 結(jié)果與討論

5.1 染料分子IR775s的表征

將制備得到的IR775s固體溶于二氯甲烷中，注入電噴霧電離質(zhì)譜儀。從質(zhì)譜圖中可看出(圖5)，主峰為m/z= 607.3，與IR775s分子量相同，證明所得產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物一致。所合成IR775s的最大吸收峰在775 nm處(圖6a)，熒光發(fā)射峰在850 nm處(圖6b)。

圖5 染料分子IR775s的質(zhì)譜圖

圖6 染料分子IR775s的紫外-可見(jiàn)光譜(a)以及熒光光譜(b)

5.2 有機(jī)納米粒子的表征

PFODBT-IR775s納米粒子具有良好的水溶性，其水溶液呈紫紅色，如圖7a所示。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)測(cè)量表明，PFODBT-IR775s納米粒子的平均水動(dòng)力直徑為68 nm (如圖7b所示)。如圖7c所示的透射電子顯微鏡(TEM)結(jié)果表明，該納米粒子具有球形形貌。

圖7 PFODBT-IR775s納米粒子表征

5.3 可行性探究

如圖8a及圖8b紫外-可見(jiàn)光譜所示，隨著ROS (ClO?或ONOO?)濃度的增加，IR775s水溶液的特征吸收峰(775 nm)逐漸下降，說(shuō)明IR775s易被ROS破壞。如圖8c及圖8d紫外-可見(jiàn)光譜所示，當(dāng)ClO?或ONOO?濃度升高時(shí)，PFODBT的特征吸收度峰(550 nm)幾乎保持不變，說(shuō)明PFODBT對(duì)于ClO?和ONOO?都是穩(wěn)定的。PFODBT和IR775s對(duì)ClO?或ONOO?的不同響應(yīng)特性，為開(kāi)發(fā)比率型檢測(cè)ClO?或ONOO?的納米探針奠定了基礎(chǔ)。

圖8 (a) IR775s染料分子對(duì)ClO?的吸收光譜圖；(b) IR775s染料分子對(duì)ONOO?的吸收光譜圖；(c) PFODBT納米粒子對(duì)ClO?的吸收光譜圖；(d) PFODBT納米粒子對(duì)ONOO?的吸收光譜圖

5.4 納米探針比率型檢測(cè)ClO?

如圖9a吸收光譜所示，在沒(méi)有加入ClO?時(shí)，PFODBT-IR775s納米探針具有PFODBT和IR775s的特征吸收峰，說(shuō)明成功合成了該納米粒子。隨著ClO?濃度的增強(qiáng)，IR775s的特征吸收峰(775 nm)的強(qiáng)度顯著降低，而PFODBT的特征吸收峰(550 nm)基本保持不變。根據(jù)圖9a，計(jì)算出吸光度在550 nm和775 nm的兩處信號(hào)的比值(A550/A775)，并繪制出A550/A775與ClO?溶液濃度的關(guān)系曲線。如圖9b所示，隨ClO?溶液濃度的增強(qiáng)，A550/A775逐漸增加。因此，基于這種比率型吸光度的變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)ClO?檢測(cè)。

圖9 (a) 納米探針PFODBT-IR775s對(duì)不同濃度ClO?的吸收光譜圖；(b) 吸光度比值(A550/A775)與ClO?溶液濃度的關(guān)系曲線；(c) 納米探針PFODBT-IR775s對(duì)不同濃度ClO?的熒光光譜圖；(d) 熒光強(qiáng)度比值(F695/F825)與ClO?溶液濃度的關(guān)系曲線

如圖9c熒光光譜所示，在沒(méi)有加入ClO?時(shí)，PFODBT-IR775s納米探針在695 nm處的熒光發(fā)射峰較弱，說(shuō)明PFODBT-IR775s之間存在較強(qiáng)的FRET效應(yīng)。隨著ClO?濃度的增大，PFODBT-IR775s納米探針在825 nm處的熒光發(fā)射峰下降，而在695 nm處的熒光發(fā)射峰顯著上升。該現(xiàn)象說(shuō)明ClO?可以逐漸破壞IR775s，導(dǎo)致PFODBT-IR775s之間的FRET效應(yīng)降低，從而PFODBT在695 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸恢復(fù)。根據(jù)圖9c，計(jì)算出熒光在695 nm和825 nm的兩處信號(hào)強(qiáng)度的比值(F695/F825)，并繪制出F695/F825與ClO?溶液濃度的關(guān)系曲線。如圖9d所示，隨ClO?溶液濃度的增強(qiáng)，F(xiàn)695/F825逐漸增加。通過(guò)擬合獲得線性方程(y= 0.29x+ 0.874)。相關(guān)性(R2= 0.946)說(shuō)明在該濃度范圍內(nèi)，納米探針的熒光強(qiáng)度的比率(F695/F825)與ClO?濃度呈良好的線性關(guān)系。并且根據(jù)公式可計(jì)算出該檢測(cè)方法的檢測(cè)限LOD = 3σ/k= 0.79 μmol·L?1。因此，基于這種比率型熒光變化可實(shí)現(xiàn)對(duì)ClO?檢測(cè)。

5.5 比率型檢測(cè)ONOO?

根據(jù)圖10a，計(jì)算出吸光度在550 nm和775 nm的兩處信號(hào)的比值(A550/A775)，并繪制出A550/A775與ONOO?溶液濃度的關(guān)系曲線。如圖10b所示，通過(guò)擬合獲得線性方程(y= 0.24x+ 2.071)。相關(guān)性(R2= 0.991)，并且根據(jù)公式可以計(jì)算出該檢測(cè)方法的檢測(cè)限LOD = 3σ/k =1.59μmol·L?1。

圖10 (a) 納米探針PFODBT-IR775s對(duì)不同濃度ONOO?的吸收光譜圖；(b) 吸光度比值(A550/A775)與ONOO?溶液濃度的線性關(guān)系曲線；(c) 納米探針PFODBT-IR775s對(duì)不同濃度ONOO?的熒光光譜圖；(d) 熒光強(qiáng)度比值(F695/F825)與ONOO?溶液濃度的線性關(guān)系曲線

根據(jù)圖10c，計(jì)算出熒光在695 nm和825 nm的兩處信號(hào)強(qiáng)度的比值(F695/F825)，并繪制出F695/F825與ONOO?溶液濃度的關(guān)系曲線。如圖10d所示，通過(guò)擬合獲得線性方程(y= 0.038x+ 1.169)。相關(guān)性(R2= 0.995)，并且根據(jù)公式可計(jì)算出該檢測(cè)方法的檢測(cè)限LOD = 3σ/k= 13.2 μmol·L?1。

6 實(shí)驗(yàn)教學(xué)特點(diǎn)

本實(shí)驗(yàn)內(nèi)容緊密結(jié)合學(xué)科前沿，綜合運(yùn)用多種方法原理、實(shí)驗(yàn)技術(shù)和儀器設(shè)備，能夠使學(xué)生所學(xué)的知識(shí)融會(huì)貫通，同時(shí)培養(yǎng)學(xué)生的科研興趣。具有如下特點(diǎn)：

(1) 有機(jī)半導(dǎo)體聚合物納米粒子的制備屬于常溫反應(yīng)，產(chǎn)率高，條件易于控制。反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)對(duì)納米粒子形貌和性質(zhì)影響不大，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性好。如果IR775s提前合成好，納米粒子的制備部分可在30分鐘內(nèi)完成，符合本科生實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)的設(shè)計(jì)要求。

(2) 有機(jī)納米粒子檢測(cè)ROS的能力受到多種因素的影響，如投料比例、反應(yīng)物濃度、表面活性劑等。因此，可讓學(xué)生探索不同實(shí)驗(yàn)條件，研究其對(duì)檢測(cè)ROS靈敏度的影響，并分析影響規(guī)律。

(3) 通過(guò)引用熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理，促進(jìn)本科生對(duì)光譜分析知識(shí)的深入學(xué)習(xí)。比率型檢測(cè)是光譜分析中消除環(huán)境因素干擾的一種常用方法。在本實(shí)驗(yàn)中，可將比率型檢測(cè)結(jié)果與單信號(hào)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，凸顯使用比率檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。

(4) 本實(shí)驗(yàn)中涉及多種實(shí)驗(yàn)技術(shù)的綜合運(yùn)用：IR775s的合成和表征既可放在實(shí)驗(yàn)內(nèi)，也可以提前準(zhǔn)備好；納米粒子的形貌尺寸表征運(yùn)用到動(dòng)態(tài)光散射、透射電子顯微鏡的使用；光譜性能測(cè)試運(yùn)用到紫外-可見(jiàn)光吸收譜儀和熒光光譜儀。

(5) 本實(shí)驗(yàn)成功率高，可實(shí)施性強(qiáng)；既有敏感條件又有不敏感條件，通過(guò)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)條件的探索，培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)能力；通過(guò)完整的數(shù)據(jù)分析，提高學(xué)生實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理能力。實(shí)驗(yàn)涉及大型儀器綜合使用，有利于擴(kuò)展本科生視野，促進(jìn)學(xué)生探究潛質(zhì)的開(kāi)發(fā)。本實(shí)驗(yàn)所合成的納米粒子探針還可以進(jìn)一步擴(kuò)展到光譜分析的前沿領(lǐng)域，如在活體水平監(jiān)測(cè)活性氧的含量。

7 思考題

(1) 比率型檢測(cè)有哪些優(yōu)勢(shì)？

(2) 什么是熒光共振能量轉(zhuǎn)移？

(3) PFODBT/IR775s的投料比對(duì)探針特性如靈敏度有什么影響？

(4) 聚合物納米粒子探針用于光譜檢測(cè)，有哪些優(yōu)點(diǎn)？

8 教學(xué)組織運(yùn)行方式和教學(xué)方法

(1) 實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)安排和運(yùn)行方式。

建議實(shí)驗(yàn)分兩個(gè)階段進(jìn)行：第一階段納米粒子的合成和表征；第二階段納米粒子檢測(cè)活性氧物質(zhì)的測(cè)試。兩個(gè)階段共需約8 h (4 h + 4 h)。一堂實(shí)驗(yàn)課中參與實(shí)驗(yàn)的學(xué)生人數(shù)為10–15人，每人制取一個(gè)樣品。

(2) 線上線下混合式教學(xué)方法。

實(shí)驗(yàn)課提前錄制好課程指導(dǎo)性短視頻，放到MOOC平臺(tái)或課程中心網(wǎng)站上，學(xué)生實(shí)驗(yàn)前線上預(yù)習(xí)，了解實(shí)驗(yàn)中應(yīng)注意的問(wèn)題，熟悉使用到的儀器設(shè)備原理、構(gòu)造和操作技巧，完成預(yù)習(xí)的小練習(xí)。教師對(duì)學(xué)生的預(yù)習(xí)報(bào)告和提出的綜合設(shè)計(jì)方案進(jìn)行指導(dǎo)，引導(dǎo)學(xué)生思考可能引起探針性質(zhì)變化的幾種因素，并列出可能具體的實(shí)驗(yàn)方案。如：

① 通過(guò)改變IR775s與PFODBT的摻雜比例(1 : 2/1 : 3/1 : 5)，研究摻雜比例對(duì)納米探針靈敏度的影響；

② 通過(guò)改變表面活性劑的量(2.5 mg/5 mg/7.5 mg)，研究表面活性劑的量對(duì)納米探針靈敏度的影響。

③ 通過(guò)改變表面活性劑的種類(PSMA/F127/DSPE-PEG)，研究表面活性劑的種類對(duì)納米探針靈敏度的影響。

現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)教學(xué)時(shí)，注意分組安排實(shí)驗(yàn)條件設(shè)計(jì)，不同實(shí)驗(yàn)條件既有平行對(duì)比，又有組內(nèi)和組間對(duì)比，通過(guò)全體學(xué)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得總的實(shí)驗(yàn)規(guī)律和結(jié)論。實(shí)驗(yàn)中注意采用啟發(fā)式引導(dǎo)，讓學(xué)生自主思考，培養(yǎng)創(chuàng)新意識(shí)。

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，組織學(xué)生進(jìn)行實(shí)驗(yàn)匯報(bào)，比較各種投料比例所制備材料的檢測(cè)靈敏度；有興趣的學(xué)生可參加教師的相關(guān)課題研究，并可在開(kāi)放實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)進(jìn)行探索。根據(jù)平時(shí)的開(kāi)放實(shí)驗(yàn)結(jié)果，又可應(yīng)用于本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，可使該實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)內(nèi)容與時(shí)俱進(jìn)，有較大的開(kāi)放性。該實(shí)驗(yàn)內(nèi)容已經(jīng)在本校的本科生SIT (大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練)項(xiàng)目中進(jìn)行了多次嘗試，實(shí)驗(yàn)效果良好。

9 結(jié)語(yǔ)

本實(shí)驗(yàn)采用納米共沉淀法制備了有機(jī)半導(dǎo)體聚合物納米粒子。基于PFODBT對(duì)ROS的高穩(wěn)定性，將PFODBT作為信號(hào)參考分子；利用IR775s對(duì)ROS響應(yīng)性變化的特性，將IR775s作為響應(yīng)分子。該納米探針通過(guò)比率型吸光度和比率型熒光的方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)溶液中的ROS (ClO?和ONOO?)的準(zhǔn)確檢測(cè)。作為實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)，本實(shí)驗(yàn)在方法上引入了光譜分析中熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理和比率型檢測(cè)方法，使本科生了解比率型檢測(cè)方法對(duì)于單信號(hào)檢測(cè)方法的優(yōu)勢(shì)，拓展了學(xué)生的能力；完整的紫外-可見(jiàn)吸收光譜和熒光光譜測(cè)試訓(xùn)練提升了學(xué)生使用基本光譜分析儀器的能力。比率型檢測(cè)以及檢測(cè)限的計(jì)算過(guò)程有利于訓(xùn)練本科生的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理能力，培養(yǎng)學(xué)生分析化學(xué)思維能力。靈活的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案也能進(jìn)一步激發(fā)學(xué)生的研究興趣，培養(yǎng)了學(xué)生的探索精神。該方法操作方便、可行性高，有利于培養(yǎng)學(xué)生的實(shí)驗(yàn)技能和科研能力。