何宇巍，黃穎華，李曉君，譚俊青，黃小玲，王康椿，李藹文

1 廣東省第二中醫(yī)院 廣東廣州 510095

2 中山大學(xué)南方學(xué)院 廣東廣州 510970

鮑曼不動(dòng)桿菌廣泛分布于自然界和醫(yī)院環(huán)境中，是我國(guó)目前院內(nèi)感染常見(jiàn)的病原菌。有報(bào)道顯示[1]，臨床分離的鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜具有非常強(qiáng)的形成率；生物膜一旦形成通過(guò)膜內(nèi)細(xì)菌免受或者減少抗生素的侵?jǐn)_等機(jī)制，細(xì)菌就具有了極強(qiáng)的耐藥性和致病性[2-3]。

我們前期實(shí)驗(yàn)表明黃連、黃芩、連翹、烏梅、五味子等五種中藥顆粒劑對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌及其生物膜有不同程度的抑制作用。另一方面左氧氟沙星是臨床上抗鮑曼不動(dòng)桿菌感染常用的抗生素[4]。而現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜方面的研究主要集中在抗生素方面，中藥及中藥聯(lián)合抗生素對(duì)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜作用的研究及相關(guān)機(jī)制的研究鮮見(jiàn)報(bào)導(dǎo)[5-7]。為進(jìn)一步探討這些單體中藥聯(lián)合抗生素的抑菌機(jī)理，本研究通過(guò)篩選有效菌株、建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?、進(jìn)行體外聯(lián)合用藥實(shí)驗(yàn)，觀察黃連等5種中藥顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌（MDRAB）生物膜的抑膜效果，以期為治療MDRAB聯(lián)合用藥提供新的思路，為中藥制劑聯(lián)合抗生素抗菌相關(guān)研究提供數(shù)據(jù)參考。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 菌株 2019年11月到2020年1月期間在廣東省第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科收集臨床標(biāo)本分離的MDRAB，均為非重復(fù)菌株，共11株。

1.2 藥物及試劑 黃芩（9089261）、黃連（9035861）、連翹（9069171）、烏梅（8071961）、五味子（8031621），這5種中藥顆粒劑均購(gòu)于廣東一方制藥有限公司；左氧氟沙星氯化鈉注射液（BW05731 第一三共制藥有限公司）；95%乙醇（20181201 廣東省廣寧縣順寧葡萄糖藥業(yè)有限公司）；龍膽紫染色液（419054 珠海貝索生物技術(shù)有限公司）；無(wú)菌鹽水（190921501 廣東怡翔制藥有限公司）；0.45%鹽溶液（3013691）；肉湯培養(yǎng)基（NUB-200302D 廣州市迪景微生物科技有限公司）。

1.3 儀器與材料 VITEK-2型全自動(dòng)細(xì)菌鑒定及藥敏儀（法國(guó)梅里埃）； BSC-1100二級(jí)生物安全柜（山東鑫貝）； CX-21生物顯微鏡（OLYMUPS）；海爾冷藏冷凍箱（海爾）；YA28X6T高壓蒸汽滅菌器（寧波甬安）；96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司）；電子天平（日本AD）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法與步驟

2.1 用龍膽紫染色法篩選產(chǎn)膜的MDRAB

2.2 用微量倍比稀釋法測(cè)定6種單藥最小抑膜濃度

2.3 用棋盤(pán)稀釋法測(cè)定各聯(lián)合用藥最小抑膜濃度

3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

3.1 先統(tǒng)計(jì)藥物的最小抑膜濃度；再根據(jù)部分抑菌濃度指數(shù)計(jì)算FIC指數(shù)，當(dāng)FIC指數(shù)小于等于0.5時(shí)，兩種藥為協(xié)同作用；當(dāng)FIC指數(shù)大于0.5且小于等于1時(shí)，兩種藥為相加作用；當(dāng)FIC指數(shù)大于l且小于等于2時(shí)，兩種藥為無(wú)關(guān)作用；當(dāng)FIC指數(shù)大于2時(shí)，兩種藥為拮抗作用。

3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS23.0軟件處理，應(yīng)用Fisher確切概率法檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 篩選產(chǎn)生物膜的鮑曼不動(dòng)桿菌結(jié)果

收集了11株MDRAB，其中10株能產(chǎn)生生物膜，1株不能，產(chǎn)膜率為91%。其中10株產(chǎn)膜MDRAB將用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 6種單藥最小抑膜濃度結(jié)果

五種中藥顆粒劑（黃連、黃芩、連翹、烏梅、五味子）在單獨(dú)作用于MDRAB生物膜時(shí)，對(duì)MDRAB生物膜均有一定抑膜作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示不同藥物的抑膜濃度不同，分別在2～16mg/mL不等，見(jiàn)（表1）；左氧氟沙星作用于MDRAB最小抑膜濃度為16μg/mL，見(jiàn)（表2）；經(jīng)Fisher確切概率法檢驗(yàn)可知，6種藥相對(duì)比，不同藥液濃度之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.00，P＜0.05）。

表1 各中藥顆粒劑作用于MDRAB最小抑膜濃度分布表

表2 左氧氟沙星作用于MDRAB最小抑膜濃度分布表

3 聯(lián)合用藥FIC作用結(jié)果

五種中藥顆粒劑分別與左氧氟沙星兩兩聯(lián)合用藥的最小抑膜濃度FIC作用結(jié)果顯示：黃連、黃芩、烏梅、五味子四種中藥顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的FIC表現(xiàn)有協(xié)同、相加作用和無(wú)關(guān)作用，未見(jiàn)拮抗作用，其中這四種聯(lián)合作用均以無(wú)關(guān)作用為主，占比分別為70%、40%、50%、60%；而連翹聯(lián)合左氧氟沙星的FIC結(jié)果存在協(xié)同、相加和無(wú)關(guān)作用，主要表現(xiàn)為拮抗作用，占40%；從以上數(shù)據(jù)可以看出除連翹以外的四種中藥顆粒劑在本次研究中聯(lián)合左氧氟沙星對(duì)MDRAB的抑膜作用以無(wú)關(guān)作用為主，均可見(jiàn)協(xié)同、相加作用，而連翹聯(lián)合左氧氟沙星對(duì)MDRAB的抑膜作用則出現(xiàn)了拮抗的情況，且拮抗占比最高，詳見(jiàn)（表3）。在聯(lián)合用藥效應(yīng)方面，根據(jù)Fisher確切概率法檢驗(yàn)可知5組聯(lián)合用藥之間FIC結(jié)果分布差異沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P= 0.121，P＞0.05），即5組聯(lián)合用藥之間的FIC結(jié)果分布沒(méi)有關(guān)聯(lián)性。

表3 聯(lián)合用藥FIC指數(shù)分布表

討 論

由于抗菌藥物的廣泛和不合理應(yīng)用，使細(xì)菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，醫(yī)院由鮑曼不動(dòng)桿菌引起的感染呈逐年升高的趨勢(shì)。而隨著耐藥性的提高，臨床上聯(lián)合用藥的使用也越來(lái)越頻繁，許多臨床研究結(jié)果都表明了聯(lián)合用藥的優(yōu)越性，中藥與抗生素的聯(lián)用也為聯(lián)合用藥提供新的思路以及參考依據(jù)[8-9]。

在本研究中，首先利用龍膽紫染色法篩選產(chǎn)生物膜的MDRAB，在臨床分離的11株MDRAB中，其中10株為產(chǎn)生物膜的菌株，產(chǎn)膜率為91%，收集的菌株的生物膜形成率國(guó)內(nèi)報(bào)道的結(jié)果相近[1，10-11]；以此10株作為實(shí)驗(yàn)菌株，然后用倍比稀釋法分別測(cè)定5種單體中藥對(duì)實(shí)驗(yàn)菌株的最小抑膜濃度，結(jié)果顯示五種中藥顆粒劑在單獨(dú)使用時(shí)均對(duì)MDRAB生物膜有一定抑膜作用，抑膜濃度從2mg/ml-16mg/ml不等。我們前期研究也表明，該5種中藥顆粒劑對(duì)多重耐藥菌有不同程度抑菌作用，通過(guò)增加細(xì)菌細(xì)菌膜的通過(guò)性等機(jī)制達(dá)到抑菌的效果[12-14]；有研究表明[15]，中藥五倍子水煎劑通過(guò)下調(diào)生物膜形成相關(guān)基因bfmS、bfmR、abaI、abaR、BAP的表達(dá)發(fā)揮抑制作用，從而達(dá)到抑制鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜形成的效果。本實(shí)驗(yàn)中實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)菌株抑膜作用的具體機(jī)制我們也在進(jìn)一步研究中。

在中藥顆粒劑和左氧氟沙星的聯(lián)合藥敏實(shí)驗(yàn)中，連翹聯(lián)合左氧氟沙星的FIC主要表現(xiàn)為拮抗作用；而根據(jù)岳冬芳[16]，晏奎[17]等人對(duì)MDRAB有關(guān)聯(lián)合用藥的研究，磷霉素、頭孢吡肟與左氧氟沙星聯(lián)合使用后的FIC結(jié)果顯示有拮抗作用，據(jù)研究分析，在部分菌株中存在拮抗作用，可能是由于部分菌株存在adeS基因，若使用某些藥物可能會(huì)激活adeS基因，使外排泵表達(dá)或者過(guò)量表達(dá)，進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的藥物就會(huì)被泵出，從而表現(xiàn)為拮抗作用[3，18]；在連翹顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的抑膜研究中出現(xiàn)拮抗作用可能出現(xiàn)了上述相似機(jī)制，從而使其表現(xiàn)拮抗作用。其余四種中藥顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的FIC主要表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用，而協(xié)同、相加也有少量散在分布，其中黃連顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的無(wú)關(guān)作用占比最高，達(dá)70%；表現(xiàn)為無(wú)關(guān)作用，可能與聯(lián)合用藥后兩種藥物的活性與單獨(dú)一種抗菌藥物作用相同有關(guān)[19-20]。

由本次聯(lián)合用藥研究結(jié)果可知，連翹在單獨(dú)對(duì)MDRAB生物膜作用的實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了較差的抑膜效果，且在后續(xù)與左氧氟沙星聯(lián)合用藥的抑膜實(shí)驗(yàn)中，也存在著較高的拮抗作用，在MDRAB抑膜實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)考慮菌株的個(gè)體差異，或者避免使用此聯(lián)用組合；而黃連、黃芩、烏梅、五味子等四種中藥顆粒劑聯(lián)合左氧氟沙星的抑膜實(shí)驗(yàn)中，協(xié)同、相加作用均有出現(xiàn)，以無(wú)關(guān)作用為主，不存在拮抗作用；在同類實(shí)驗(yàn)中，可考慮選用這些組合作進(jìn)一步研究。本研究給聯(lián)合用藥提供了新的思路，在細(xì)菌耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重的今天，面臨著超級(jí)細(xì)菌將無(wú)藥可用的困境，中藥與抗生素的聯(lián)合使用可能是解決這個(gè)問(wèn)題新的途徑。