錢 斌 尹小川 李小軍 陳 蔚 張 敏（昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，昆明650032）

多種因素（如肺炎、機(jī)械暴擊、吸入有毒有害氣 體等）引發(fā)的急性肺損傷（acute lung injury，ALI）導(dǎo)致肺泡上皮和肺部毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞異常凋亡是患者呼吸困難、低氧血癥等肺功能障礙的主要原因，如不能有效控制癥狀，將演變?yōu)榧毙院粑狡染C合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）甚至休克、多器官功能障礙（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）或 衰 竭（multiple organ failure，MODF）［1-2］。臨床常用藥物如地塞米松會(huì)加大ALI老年患者醫(yī)源性類固醇糖尿病風(fēng)險(xiǎn)，因此拓寬ALI用藥選擇具有重要意義。CHAMBERS等［3］指出，內(nèi)皮組織異常細(xì)胞凋亡導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)受損是ALI患者的主要病理學(xué)改變。高聰?shù)龋?］研究表明，抑制肺組織細(xì)胞凋亡可明顯改善ALI大鼠肺損傷。XU等［5］研究表明，大量無(wú)法及時(shí)清除的活性氧（reactive ox‐ygen species，ROS）是導(dǎo)致ALI大鼠肺組織內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子。信號(hào)通路核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant response element，ARE）是機(jī)體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化通路。研究證明，Nrf2/ARE通過(guò)調(diào)控抗氧化酶如血紅素加氧酶1（heme oxygenase-1，HO-1）及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白谷胱甘肽（glutathione，GSH）等表達(dá)清除細(xì)胞內(nèi)ROS，抑制氧化應(yīng)激，降低細(xì)胞凋亡率［6］。辛伐他汀作為一線調(diào)控血脂藥物，對(duì)心臟、動(dòng)脈等有良好的保護(hù)作用。臨床研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀對(duì)慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）合并肺動(dòng)脈高壓具有良好療效，但辛伐他汀對(duì)ALI的作用研究鮮有報(bào)道［7］。本研究通過(guò)建立大鼠ALI模型，探討Nrf2/ARE對(duì)ALI大鼠肺組織的保護(hù)作用，為辛伐他汀臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)8~10周齡SD雄性大鼠40只，體重200~220 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK（京）2016-0011，按照我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理辦法，室溫下標(biāo)準(zhǔn)飼料、自由飲水、分籠（4籠）適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本研究經(jīng)我院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2019-032）。

1.1.2 主要試劑與儀器辛伐他?。?0 mg，杭州默沙東制藥有限公司）；脂多糖（LPS，10 mg/只，Sigma公司，生產(chǎn)批號(hào)：L2880）；地塞米松（dexamethasone，DXMS，0.75 mg，廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司）；Nrf2、HO-1抗體、兔抗磷酸GAPDH抗體（美國(guó)Santa公司）；Western blot試劑盒（德國(guó)Rebstock公司）；TUNEL染色試劑盒、DCFH-DA染色試劑盒（南京建成生物有限公司）；HE染色試劑盒（上海碧云天公司）；蛋白濃度測(cè)定試劑盒、DAB化學(xué)發(fā)光試劑盒（北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司）；LIOOS600T生物顯微鏡（日本尼康公司）；Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；-80℃冰箱（德國(guó)維根斯公司）；Leica RM2135組織切片機(jī)（德國(guó)Leica公司）；高速低溫離心機(jī)（北京六一儀器廠）。

1.2 方法

1.2.1 模型構(gòu)建和分組處理適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，將大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、辛伐他汀干預(yù)組（實(shí)驗(yàn)組）、陽(yáng)性對(duì)照藥地塞米松干預(yù)組（DXMS組），每組10只。實(shí)驗(yàn)組、DXMS組大鼠分別腹腔注射1 ml辛伐他汀溶液（5 mg/kg）和1 ml DXMS溶液（5 mg/kg），正常組、模型組分別腹腔注射等量生理鹽水；腹腔注射30 min后，模型組、實(shí)驗(yàn)組、DXMS組大鼠分別尾靜脈注射0.5 ml LPS（5 mg/kg）復(fù)制ALI模型［8］，正常組大鼠尾靜脈注射等量生理鹽水。

1.2.2 肺組織濕重/干重（W/D）測(cè)定注射完畢后，所有大鼠正常飲食，自由飲水喂養(yǎng)4 h后斷頭處死大鼠，打開(kāi)胸腔無(wú)菌取出其肺組織，肉眼觀察各組大鼠肺組織解剖病理變化；無(wú)菌清洗，無(wú)菌吸水紗布吸干，取各組大鼠肺組織（左肺下葉除外）-80℃?zhèn)溆?。同時(shí)取各組大鼠左肺下葉，清洗血跡，稱重（濕重W），60℃連續(xù)烘干48 h，稱重（干重D），計(jì)算W/D。

1.2.3 HE染色觀察各組大鼠肺組織病理學(xué)改變準(zhǔn)確稱取50%各組大鼠左肺上葉組織，10%甲醛固定24 h，切片，HE染色，光鏡下觀察病理改變，根據(jù)肺泡內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡出血、肺泡間隔水腫及肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積4個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)，每只大鼠取4張切片，各切片選取6個(gè)不同視野進(jìn)行評(píng)分，取平均值。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：無(wú)病變或輕微病變記為0分；輕度病變記為1分；中度病變記為2分；重度病變記為3分；極重度病變記為4分［9］。由病理研究室2位經(jīng)驗(yàn)豐富的醫(yī)師分別對(duì)肺泡、肺泡腔、肺泡壁及肺部出血情況進(jìn)行評(píng)分，各項(xiàng)評(píng)分總值即為大鼠肺組織的ALI總評(píng)分。

1.2.4 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡取50%各組大鼠右中肺組織，常規(guī)方法固定，冰凍切片，二甲苯浸洗2次，梯度乙醇浸洗5 min，風(fēng)干，3%過(guò)氧化氫-甲醇浸泡10 min，PBS漂洗3次，3 min/次，4℃預(yù)冷乙醇下操作：0.1%TritonX-100、0.1%緩沖液處理2 min，PBS漂洗3次，3 min/次，加入TUNNEL反應(yīng)混合液，加入封口膜暗濕盒中37℃反應(yīng)1 h，PBS漂洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，熒光顯微鏡下觀察，每組切片選取6個(gè)不同視野，Image-Pro 6.2軟件處理圖像，統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 DCFH-DA染色檢測(cè)ROS含量評(píng)估各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)取50%各組大鼠右中肺組織，10%多聚甲醛固定2 h，石蠟包埋，切片，10 μmol/L DCFH-DA染色2 h，熒光顯微鏡下拍照，隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)區(qū)圖像，Image J1.41分析綠色熒光平均強(qiáng)度值，依次對(duì)每組樣本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。按照各試劑盒說(shuō)明書(shū)要求，采用MDA檢測(cè)試劑盒、SOD檢測(cè)試劑盒檢測(cè)肺組織中與氧化反應(yīng)相關(guān)底物變化。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、SOD和MDA基因表達(dá)準(zhǔn)確稱取50%各組大鼠左肺上葉組織，加入細(xì)胞裂解液，常規(guī)提取總RNA，測(cè)定濃度［10］，以逆轉(zhuǎn)錄試劑盒為模板合成單鏈cDNA，PCR儀測(cè)量。各樣品設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，獨(dú)立測(cè)量3次。引物序列見(jiàn)表1。

表1 目的基因序列Tab.1 Sequence of target genes

1.2.7 免疫組化檢測(cè)各組大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達(dá)取50%各組大鼠右下肺組織，10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片，二甲苯和梯度乙醇脫蠟，緩沖液中修復(fù)2 h充分暴露抗原決定簇。3%過(guò)氧化氫浸泡，室溫孵育10 min，封閉，PBS沖洗3次，分別加入稀釋好的一抗4℃孵育過(guò)夜，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標(biāo)記的二抗室溫孵育30 min，清洗，DAB顯色2~5 min至顯微鏡下觀察到棕黃色顆粒，去離子水終止反應(yīng)（DAB顯色劑現(xiàn)用現(xiàn)配，避光保存）［11］。蘇木素輕度復(fù)染1.5~2 min，清洗，梯度乙醇脫水，二甲苯浸泡，干燥，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察并記錄，分析圖像。

1.2.8 Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達(dá)取50%各組大鼠右下肺組織，加入組織裂解液裂解，冰浴5 min，離心，取上清，采用BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度［12］，凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)PVDF膜，5%TBST液中室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（1∶1 000）4℃反應(yīng)過(guò)夜，次日沖洗干凈，加入二抗（1∶10 000）室溫孵育，ECL顯色，以GAPDH為內(nèi)參，E-Gel Imager凝膠成像儀檢測(cè)，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用Graphpad5.01軟件作圖，組間比較采用t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織W/D比較與正常組大鼠相比，模型組大鼠肺組織W/D明顯升高（P<0.05），與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組、DXMS組大鼠肺組織W/D明顯降低（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組和DXMS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖1）。

圖1 各組大鼠肺組織W/DFig.1 W/D of lung tissue of rats in each group

2.2 各組大鼠肺組織解剖學(xué)及病理學(xué)比較正常組大鼠肺組織表面光滑、飽滿富有彈性，呈粉紅色，肺組織表面無(wú)出血點(diǎn)，無(wú)斑點(diǎn)，被膜無(wú)緊張，切面無(wú)滲出，模型組大鼠肺組織表面皺縮嚴(yán)重，呈紅褐色，取出肺組織時(shí)有泡沫樣黏液流出，肺組織明顯腫大，肺組織表面有片狀淤血，出血點(diǎn)較多，同時(shí)被膜明顯僵硬，切面有滲出，實(shí)驗(yàn)組、DXMS組大鼠肺組織較模型組有明顯好轉(zhuǎn)，雖見(jiàn)水腫，但出血點(diǎn)和淤血區(qū)域明顯減少（圖2A）。HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，無(wú)充血、擴(kuò)張及出血現(xiàn)象，肺泡腔結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁厚度均勻，無(wú)增寬、滲出等現(xiàn)象，肺泡間隔及各級(jí)支氣管管腔內(nèi)均未見(jiàn)水腫、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、分泌物滲出等。和正常組相比，模型組大鼠肺組織肺泡腔明顯變小，厚度不均一，間隔明顯增寬，腔內(nèi)大量炎癥細(xì)胞填充，肺泡壁充血嚴(yán)重，支氣管及周圍毛細(xì)血管存在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，管腔有滲出血細(xì)胞、炎癥細(xì)胞和其他分泌物填充，ALI病理評(píng)分明顯升高（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組、DXMS組大鼠肺組織病理癥狀有所緩解，肺泡大小均一，腔內(nèi)少量水腫液填充，炎癥細(xì)胞明顯減少，肺泡周圍毛細(xì)血管基本無(wú)擴(kuò)張、充血現(xiàn)象，ALI病理評(píng)分明顯降低（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組和DXMS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖2B）。

圖2 各組肺組織解剖學(xué)及病理學(xué)變化Fig.2 Anatomical changes and pathology changes of lung tissue in each group

2.3 TUNEL染色檢測(cè)各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡TUNEL染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率明顯升高（P<0.05），與模型組相比，藥物干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組、DXMS組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡率明顯降低（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組和DXMS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖3）。

圖3 各組大鼠肺組織細(xì)胞凋亡情況Fig.3 Cell apoptosis of lung tissue of rats in each group

2.4 DCFH-DA染色檢測(cè)ROS含量評(píng)估各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激反應(yīng)DCFH-DA染色結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織綠色熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，ROS含量明顯增多（P<0.05），與模型組相比，藥物干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組、DXMS組大鼠肺組織綠色熒光強(qiáng)度明顯減弱，ROS含量明顯降低（P<0.05）；采用試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)底物和酶活性，結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織細(xì)胞MDA含量明顯增加，而SOD酶活性明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，藥物干預(yù)后，實(shí)驗(yàn)組、DXMS組大鼠肺組織細(xì)胞MDA含量明顯降低，SOD酶活性明顯增強(qiáng)（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組和DXMS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖4）。

圖4 各組大鼠肺組織氧化應(yīng)激比較Fig.4 Comparison of oxidative stress in lung tissue of rats in each group

2.5 qRT-PCR檢測(cè)各組大鼠肺組織中Nrf2、HO-1、SOD和MDA基因表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、MDA mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05），SOD mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組和DXMS組大鼠肺組織Nrf2、HO-1、SOD mRNA表達(dá)明顯升高（P<0.05），MDA mRNA表達(dá)明顯降低（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組和DXMS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖5）。

圖5 各組大鼠肺組織中Nrf2、HO-1、SOD、MDA mRNA表達(dá)Fig.5 Nrf2，HO-1，SOD，MDA mRNA expressions in lung tissue of rats in each group

2.6 免疫組化及Western blot檢測(cè)各組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1表達(dá)免疫組化及Western blot結(jié)果顯示，與正常組相比，模型組大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達(dá)明顯升高（P<0.05），與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組和DXMS組大鼠肺組織Nrf2和HO-1表達(dá)明顯升高（P<0.05），實(shí)驗(yàn)組和DXMS組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，圖6）。

圖6 各組肺組織中Nrf2、HO-1表達(dá)Fig.6 Nrf2 and HO-1 expressions in lung tissue of rats in each group

3 討論

革蘭氏陰性菌LPS主要成分內(nèi)毒素引發(fā)的機(jī)體感染中，肺臟是主要靶器官，ALI是最常見(jiàn)的肺損傷癥狀，其病理癥狀為肺部毛細(xì)內(nèi)皮細(xì)胞大量凋亡導(dǎo)致血管通透性增強(qiáng)，ROS過(guò)度生成，氧化應(yīng)激異?；钴S，導(dǎo)致肺間質(zhì)和肺泡水腫，肺組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，呼吸窘迫等，如未及時(shí)緩解，可能危及患者生命［12］。因此需要尋找有效手段以控制ALI時(shí)的氧化應(yīng)激，及時(shí)清除聚集的ROS，抑制肺組織細(xì)胞凋亡，保障ALI患者生命安全。

常用藥物地塞米松對(duì)ALI伴有心力衰竭、高血壓等心臟疾病的老年患者療效有限，且可能增加患者醫(yī)源性類固醇性糖尿病風(fēng)險(xiǎn)。作為一線降血脂藥物，辛伐他汀在心血管疾病臨床治療中，患者耐受性好，不良反應(yīng)較輕微且呈一過(guò)性。研究表明，辛伐他汀可明顯抑制炎癥因子釋放，抑制血小板聚集，發(fā)揮抗凝血、改善血管內(nèi)皮功能、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)等作用［13］。SOHN等［14］研究證實(shí)，辛伐他汀可有效抑制氧化應(yīng)激，在缺血性脊髓損傷動(dòng)物模型中抑制細(xì)胞異常凋亡。MEDEIROS等［15］研究發(fā)現(xiàn)，辛伐他汀對(duì)膿毒癥引起細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的小鼠休克療效較好。宋海剛等［16］研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期服用辛伐他汀可明顯減輕由機(jī)械通氣引發(fā)的氧化-抗氧化失衡，減輕呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷（ventilator-induced lung injury，VILI）小鼠肺組織損傷。JIANG等［17］研究證明，改變辛伐他汀劑型可明顯增強(qiáng)辛伐他汀對(duì)ALI的治療效果。本研究通過(guò)構(gòu)建ALI大鼠模型，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠ALI肺組織病理特征明顯改善，肺組織細(xì)胞凋亡率明顯降低，證明了辛伐他汀對(duì)ALI的治療作用。

Nrf2/ARE是機(jī)體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路。Nrf2是心血管系統(tǒng)、腎、肝、肺等組織中廣泛存在的一種調(diào)控因子，正常生理狀態(tài)下，Nrf2通過(guò)氫鍵與伴侶分子耦合以復(fù)合物形式在細(xì)胞質(zhì)中穩(wěn)定存在，細(xì)胞氧化應(yīng)激時(shí)，氫鍵斷裂，大量Nrf2游離，與ARE結(jié)合，誘導(dǎo)靶基因增強(qiáng)HO-1等抗氧化酶表達(dá)，清除ROS，進(jìn)行抗氧化應(yīng)激，維持細(xì)胞正常結(jié)構(gòu)［18］。研究顯示，多種呼吸系統(tǒng)疾病如急慢性肺損傷、COPD、肺纖維化等中，Nrf2/ARE通路發(fā)揮重要保護(hù)作用［19］。LONDON JR等［20］研究表明，Nrf-2基因缺失可減少抗氧化酶，導(dǎo)致小鼠感染多種肺疾病。陸元蘭等［21］研究證實(shí)，Nrf2在百草枯致大鼠急性肺損傷中發(fā)揮保護(hù)作用。本研究檢測(cè)各組大鼠氧化應(yīng)激結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中ROS、MDA含量明顯降低，SOD活性明顯增強(qiáng)，氧化應(yīng)激明顯受阻，而免疫組化及Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠肺組織中Nrf2和HO-1表達(dá)較模型組顯著提高，推測(cè)辛伐他汀可能通過(guò)激活Nrf2/ARE通路發(fā)揮作用。

綜上所述，辛伐他汀可保護(hù)ALI大鼠肺組織，可能通過(guò)激活Nrf2/ARE通路，增強(qiáng)Nrf2和HO-1表達(dá)，抗氧化，抑制細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)，但其是否通過(guò)其他通路影響ALI進(jìn)程需進(jìn)一步研究。