信 波,龐海林,申煒煒,宋曉鵬,彭文琦,張開亮

(1解放軍第960醫(yī)院泰安醫(yī)療區(qū)腫瘤科,泰安 271000;2空軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院腫瘤科;3解放軍第960醫(yī)院泰安醫(yī)療區(qū)心內(nèi)科;4解放軍第960醫(yī)院泰安醫(yī)療區(qū)骨科;*通訊作者,E-mail:ZZ-KK-LL@126.com)

肺癌是目前世界上最常見的腫瘤,其發(fā)病率占全部癌癥患者的11.6%,死亡率占全部癌癥患者的18.4%,均居所有腫瘤的首位[1]。80%-90%肺癌的組織學類型為非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[2]。雌激素是具有多種功能的類固醇激素,在從生殖到脂質(zhì)代謝等眾多生理過程中起著調(diào)節(jié)作用[3]。雄激素通過芳香化酶CYP19A1合成為雌激素,雌激素多通過與雌激素受體α(ERα)或雌激素受體β(ERβ)中的一個受體相互作用,發(fā)揮其基因組和非基因組生物學效應。這兩種ER亞型雖然由不同的基因編碼,但其具有相似的功能和結(jié)構域[4]。這兩種受體在DNA和配體結(jié)合區(qū)顯示出高度的序列同源性,它們與以雌二醇為主的內(nèi)源性雌激素結(jié)合后的作用相似。除了介導生物學機制的動態(tài)平衡外,E2還在多種癌癥的發(fā)生和惡性進展中發(fā)揮作用。雌激素在多種經(jīng)典和非經(jīng)典的激素敏感型腫瘤中都有具有明顯的致癌作用,包括乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、結(jié)腸癌和肺癌[5]。ERs位于腫瘤細胞的胞核和胞漿中,不僅能夠促進細胞存活和增殖相關基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,還可與生長因子途徑中的諸如表皮生長因子(EGF)、胰島素生長因子(IGF)和成纖維細胞生長因子(FGF)等發(fā)揮非基因組途徑的相互作用[6]。由于上述的致癌機制,干擾E2信號通路的治療方法,如選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑或降解劑(SERM或SERDs)和芳香化酶抑制劑(AIS),已被開發(fā)出來并在臨床上用于治療ER陽性的乳腺癌[3-5]。

近年來,雌激素在肺癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用受到關注[5]。前期本課題組研究已證實了雌二醇通過雌激素β受體促進非小細胞肺癌A549細胞增殖[7]。那么,雌二醇對NSCLC細胞的遷移和侵襲能力會有怎樣的影響呢?本實驗通過探討雌二醇對人非小細胞肺癌細胞遷移和侵襲的影響,為其臨床應用提供理論及實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細胞株及主要試劑

人類非小細胞肺癌細胞系A549、H1299(購自中科院上海細胞生物研究所);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco,美國);E2(17β-雌二醇,Sigma,美國);PPT(雌激素受體α激動劑,Tocris,英國);DPN(雌激素受體β激動劑,Tocris,英國);Tranwell小室(Millipore,美國);Matrigel基質(zhì)膠(BD Corning,美國)。

1.2 細胞培養(yǎng)及實驗分組

常規(guī)使用RPMI-1640培養(yǎng)液(含10% FBS、100 U/ml青霉素和0.1 mg/ml鏈霉素)培養(yǎng)人非小細胞肺癌細胞系A549細胞和H1299細胞。每次取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。

根據(jù)本課題組前期研究中雌激素及其α和β受體激動劑對肺癌細胞增殖能力影響的相關實驗結(jié)果[7],選擇E2的作用濃度為10-8mol/L,PPT的作用濃度為10-8mol/L,DPN的作用濃度為10-8mol/L,以此作為給藥劑量;且以未添加相應試劑的無血清培養(yǎng)基為對照組。將A549細胞和H1299細胞分別用4種試劑(Control、E2、PPT、DPN)各作用24 h和48 h后進行遷移和侵襲實驗。為了排除完全培養(yǎng)基內(nèi)血清中可能含有的激素對細胞生長的影響,在加入E2、PPT和DPN前24 h即用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,加入E2、PPT和DPN后繼續(xù)用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。由于細胞在無血清培養(yǎng)基中無法正常分裂生長,所以本實驗只觀察加入E2、PPT和DPN后48 h(即無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞72 h)三者對細胞的影響。

1.3 侵襲實驗

取對數(shù)生長期的A549細胞和H1299細胞進行侵襲實驗。其中48 h組,在細胞置于Transwell小室上層前48 h時起,應用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞;于細胞置于Transwell小室上層前24 h時加入實驗分組相應試劑。而24 h組則在在細胞置于Transwell小室上層前24 h時起,應用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞;細胞置于Transwell小室上層時加入實驗分組相應試劑。消化細胞,PBS漂洗一遍后,用無血清培養(yǎng)液重懸細胞。用PBS稀釋適量單細胞懸液后進行計數(shù)。用無血清培養(yǎng)液按1 ∶8比例將Matrigel基質(zhì)膠稀釋(提前將Matrigel基質(zhì)膠置于4 ℃冰箱過夜融化)。將已預冷過的小室放入24孔板中,每個小室內(nèi)加入100 μl稀釋過的Matrigel基質(zhì)膠,盡可能避免氣泡產(chǎn)生。小室放入37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi),靜置30 min,以凝固基質(zhì)膠。膠凝固后吸棄小室上層殘余的少量液體,上室加入200 μl無血清培養(yǎng)液,下室加入500 μl無血清培養(yǎng)液后再次放入培養(yǎng)箱,水化30 min;吸棄Transwell小室上、下層內(nèi)的無血清培養(yǎng)液。制備細胞懸液(5×105/ml),并吸取200 μl的細胞懸液加入小室上層,加入實驗分組相應試劑。吸取600 μl完全培養(yǎng)基加入小室下層,放入培養(yǎng)箱,孵育24 h;吸棄上室和下室內(nèi)的液體,用95%的酒精固定細胞10 min;棄去酒精,用棉簽輕輕擦除上室的細胞和基質(zhì)膠,用600 μl潔凈、無雜質(zhì)1%結(jié)晶紫對小室底面的細胞進行染色10 min,然后在流水中漂洗小室,將染料洗去后顯微鏡觀察照相,每個小室隨機選取5個視野進行計數(shù)和結(jié)果分析。

1.4 遷移實驗

分組及操作同侵襲實驗流程,但不鋪Matrigel基質(zhì)膠。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。所有實驗結(jié)果采用均數(shù)±標準差表示,多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 雌激素及其α和β受體激動劑對肺癌細胞侵襲能力的影響

應用Transwell小室侵襲實驗來檢測加藥后肺癌細胞在體外的侵襲能力。結(jié)果提示,E2和DPN分別對A549細胞作用24 h后,對其侵襲能力無明顯影響(P>0.05,見圖1);E2和DPN對A549細胞作用48 h后,可以顯著提高A549細胞的侵襲能力(P<0.05,見圖1)。而雌激素及其α和β激動劑對H1299細胞的侵襲能力均無明顯的影響(P>0.05,見圖2)。

與control組相比,*P<0.05圖1 E2、PPT、DPN對A549細胞侵襲能力的影響 (×200)Figure 1 Effects of E2, PPT and DPN on the invasion ability of A549 cells (×200)

圖2 E2、PPT和DPN對H1299細胞侵襲能力的影響 (×200)Figure 2 Effects of E2, PPT and DPN on the invasion ability of H1299 cells (×200)

2.2 雌激素及其α和β受體激動劑對肺癌細胞遷移能力的影響

應用Transwell小室遷移實驗來檢測不同處理后肺癌細胞在體外的遷移能力。結(jié)果提示,E2和DPN分別對A549細胞作用24 h后,對其遷移能力無明顯影響(P>0.05,見圖3);E2和DPN對A549細胞作用48 h,可以顯著提高A549細胞的遷移能力(P<0.05,見圖3)。而PPT對H1299細胞作用24 h及48 h,均可明顯抑制其遷移能力(P<0.05,見圖4)。

與對照組相比,*P<0.05圖3 E2、PPT和DPN對A549細胞遷移能力的影響 (×200)Figure 3 Effects of E2, PPT and DPN on the migration ability of A549 cells (×200)

與對照組相比,*P<0.05圖4 E2、PPT和DPN對H1299細胞遷移能力的影響 (×200)Figure 4 Effects of E2, PPT and DPN on the migration ability of H1299 cells (×200)

3 討論

雌激素是一類非常重要的甾體類性激素,通過與其不同的受體結(jié)合形成E2/ER復合物,從而促進機體的生長發(fā)育和維持多系統(tǒng)器官的功能,其受體主要包括ERα、ERβ兩種亞型[8]。研究發(fā)現(xiàn),在胎鼠發(fā)育和成年大鼠[9]肺組織細胞內(nèi),ERβ較ERα的mRNA表達量高。雌性ERβ knockout(-/-)小鼠出現(xiàn)肺畸形,在出生后3個月,小鼠的肺泡細胞減少和肺表面活性劑調(diào)節(jié)因子的表達下調(diào)。在出生后5個月時,雌性小鼠和雄性小鼠均表現(xiàn)出肺泡塌陷和細胞外基質(zhì)改變等情況,這表明不論在雌性還是雄性小鼠體內(nèi),雌激素均對肺穩(wěn)態(tài)具有一定的作用[10]。ERβ knockout(-/-)孕鼠暴露于多環(huán)芳烴后,雌性胎鼠而非雄性胎鼠未出現(xiàn)肺部腫瘤。ERE-luciferase reporter轉(zhuǎn)基因小鼠在雌激素誘導后,雄性和雌性小鼠的肺內(nèi)均出現(xiàn)了ERE-luciferase reporter的表達[11]。上述研究均表明肺是雌激素作用的靶器官,ERβ是肺內(nèi)ER的主要功能受體。

據(jù)報道,腫瘤相關的ER在近30種不同類型的癌癥中表達,主要在諸如乳腺、卵巢、子宮內(nèi)膜和前列腺等激素敏感型腫瘤中表達[12]。通過比較腫瘤的臨床病理特征及組織中ER蛋白表達情況(通常采用免疫組織化學評估)發(fā)現(xiàn),因ER的細胞定位和腫瘤類型的不同,ER蛋白的表達與疾病預后有著極其復雜的關系。非小細胞肺癌中,ERα蛋白多在細胞質(zhì)和細胞膜上表達,與肺癌預后不良有關;而細胞質(zhì)內(nèi)ERβ蛋白的高表達與較差的腫瘤生存期相關,提示ERβ在非小細胞肺癌相關的非基因組機制中具有優(yōu)勢。另外,在一些研究中,非小細胞肺癌細胞核內(nèi)ERβ的表達與總生存期(overall survival,OS)呈正相關,而在另一些研究中呈負相關[13]。

那么,雌激素在非小細胞肺癌細胞遷移和侵襲中又是通過與雌激素受體哪個亞型結(jié)合后發(fā)揮作用呢?

針對這一問題,本研究通過Transwell遷移和侵襲實驗證實,E2及DPN促進A549細胞的遷移和侵襲能力,而對H1299細胞不具有類似的作用;而PPT對肺癌細胞的遷移和侵襲能力無明顯的促進作用。綜上,E2是通過ER起作用,當ERβ被激活時,可以促進A549細胞遷移和侵襲,而激活ERα對A549細胞則沒有任何相應的作用,所以本研究的結(jié)果提示E2激活ERβ后可促進A549細胞在體外的遷移和侵襲。這為探索肺癌的發(fā)病機制以及尋找新的治療靶點提供了實驗依據(jù)。