王茁宇，楊春橋，王秋舉，周井祥，梁 杰，張瑞雪，袁海延

( 1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春 130118； 2.長春市水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測中心，吉林 長春 130033； 3.吉林省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，吉林 長春 130021 )

凡納濱對(duì)蝦(Litopenaeusvannamei)，又稱南美白對(duì)蝦，屬節(jié)肢動(dòng)物門、濱對(duì)蝦屬，是全世界養(yǎng)殖范圍最廣且產(chǎn)量最高的一種經(jīng)濟(jì)對(duì)蝦。我國凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年遞增，據(jù)2018中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒，中國凡納濱對(duì)蝦總產(chǎn)量達(dá)1.672×106t，因此，凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖是我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的重要組成部分，在我國對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)中占據(jù)著舉足輕重的地位[1]。凡納濱對(duì)蝦具有抗逆性強(qiáng)、生長速度快、出肉率高和適宜高密度工廠化養(yǎng)殖等優(yōu)點(diǎn)，它的肉質(zhì)鮮美，富含蛋白、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，是最受消費(fèi)者歡迎的水產(chǎn)品之一[2]。

高密度養(yǎng)殖是目前凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的突出特點(diǎn)之一，這種養(yǎng)殖模式雖然能夠提高產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益，但是養(yǎng)殖過程中容易出現(xiàn)缺氧、對(duì)蝦抗應(yīng)激能力差和體質(zhì)差的現(xiàn)象。對(duì)于消費(fèi)者來說，活蝦更受消費(fèi)者喜愛，價(jià)格也比死蝦高出很多[3]，因此凡納濱對(duì)蝦的活體運(yùn)輸尤為重要。目前，凡納濱對(duì)蝦的運(yùn)輸還是采用活體帶水運(yùn)輸方式，未實(shí)現(xiàn)無水運(yùn)輸，這不僅增加了凡納濱對(duì)蝦的運(yùn)輸成本，同時(shí)也提高了運(yùn)輸時(shí)操作的復(fù)雜性[4]。因此，干法運(yùn)輸是未來發(fā)展的必然趨勢。但是對(duì)于凡納濱對(duì)蝦來說無水環(huán)境是一種強(qiáng)烈的缺氧應(yīng)激，并且打亂了機(jī)體的穩(wěn)態(tài)，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而導(dǎo)致機(jī)體損傷，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致對(duì)蝦死亡[5-6]。氧化應(yīng)激是水產(chǎn)動(dòng)物所受應(yīng)激類型中極為常見的一種類型，任何一種較為強(qiáng)烈的應(yīng)激均伴隨著氧化應(yīng)激的發(fā)生[7-8]，動(dòng)物機(jī)體的抗氧化能力對(duì)于抵抗氧化應(yīng)激具有重要的作用。因此，筆者以空氣暴露為刺激因子，在缺氧的條件下，全面檢測凡納濱對(duì)蝦抗氧化代謝指標(biāo)，探索缺氧不同時(shí)間段凡納濱對(duì)蝦抗氧化酶活性的變化規(guī)律，總結(jié)對(duì)蝦機(jī)體抗氧化劑和抗氧化能力的時(shí)空?qǐng)D譜，為養(yǎng)殖過程中缺氧現(xiàn)象提供基礎(chǔ)資料，為凡納濱對(duì)蝦無水運(yùn)輸技術(shù)的開發(fā)提供輔助參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源與養(yǎng)殖管理

試驗(yàn)所用300尾凡納濱對(duì)蝦為采自吉林省一養(yǎng)殖場淡化養(yǎng)殖的成蝦。挑選體長(8.32±1.43) cm健康有活力的個(gè)體作為研究對(duì)象，送至吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖室于100 L經(jīng)避光處理水族桶中暫養(yǎng)2周以適應(yīng)環(huán)境。暫養(yǎng)期間，水溫(25±1) ℃，鹽度5，溶解氧水平>5.00 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度<0.20 mg/L，亞硝態(tài)氮質(zhì)量濃度<0.10 mg/L，pH 7.6～8.0，每日7:00和19:00進(jìn)行飽食投喂，停止攝食后0.5～1.0 h吸取殘餌，每2 d換水1/3，不間斷充氧，記錄投喂量和蝦死亡情況。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)開始前禁食24 h，從每桶中隨機(jī)選取個(gè)體分為4組，進(jìn)行空氣暴露試驗(yàn)，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，推測出凡納濱對(duì)蝦最適暴露時(shí)間，分別設(shè)置0、5、15、30 min組，每組3個(gè)平行，每平行25尾蝦，放置封閉空間實(shí)驗(yàn)臺(tái)上，25 ℃室溫中進(jìn)行暴露，暴露過程中保證樣品存活，以鰓絲運(yùn)動(dòng)，鑷子接觸頭胸部觸角有反應(yīng)視為存活。

1.3 樣品收集和粗酶液制備

在空氣暴露0、5、15、30 min時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行樣品收集，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取60尾存活樣品，3個(gè)平行中每個(gè)平行取20尾進(jìn)行相關(guān)抗氧化指標(biāo)測定，分別采取肌肉、心臟、胃、腸道、肝胰腺、血淋巴6個(gè)組織，每個(gè)平行制成混合樣本。此過程均在冰上操作。血淋巴經(jīng)4 ℃過夜后，3500 r/min，4 ℃離心10 min后取上清液，血清于-20 ℃保存，其余組織放入無酶管中于-80 ℃保存。將組織解凍剪成小塊準(zhǔn)確稱量質(zhì)量放入10 mL離心管中，加入9倍體積0.86%生理鹽水進(jìn)行4 ℃組織勻漿，勻漿后4 ℃、3500 r/min離心制成粗酶液，在24 h內(nèi)測定完畢。

1.4 樣品的測定

采用考馬斯亮藍(lán)法測蛋白含量(試劑盒型號(hào)A045-2)，抽提法測總超氧化物歧化酶活性(總超氧化物歧化酶，試劑盒型號(hào)A001-2)，微量定磷法測γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶，試劑盒型號(hào)A091-1)，TBA法測丙二醛含量(丙二醛，試劑盒型號(hào)A003-1)，F(xiàn)RAP法測總抗氧化能力(總抗氧化能力，試劑盒型號(hào)A015-3)，以上測定均采用南京建成生物工程研究所試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)應(yīng)用單因素方差分析及Duncan′s多重比較，以P<0.05作為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 干露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦丙二醛含量的影響

不同的暴露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦各組織丙二醛含量的影響見圖1。在整個(gè)試驗(yàn)過程中，隨著暴露時(shí)間的增加，肌肉組織的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度無顯著變化；心臟組織的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)先降后升的趨勢，在暴露5 min時(shí)空氣暴露組與其他組相比顯著降低(P<0.05)；胃組織的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)先升后降的趨勢，與對(duì)照組相比均顯著>升高(P<0.05)；凡納濱對(duì)蝦血清中丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)升高的趨勢，暴露15 min以后的各空氣暴露組與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)；肝胰腺組織的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)升高的趨勢，暴露5 min后的空氣暴露組與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)；腸道組織的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈現(xiàn)先降后升的趨勢，暴露30 min后的空氣暴露組與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)。

圖1 不同的暴露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦各組織丙二醛質(zhì)量摩爾濃度的影響Fig.1 Effects of different exposure times on MDA molality in various tissue of Pacific white shrimp L. vannameia.肌肉； b.心臟； c.胃； d.血清； e.肝胰腺； f.腸道；圖柱上不同小寫字母分別表示不同暴露時(shí)間組之間有顯著差異(P<0.05)，下同.a.muscle; b.heart; c.stomach; d.serum; e.hepatopancreas; f.intestine; different letters on the bar indicate significant differences between different exposure time groups (P<0.05), et sequentia.

2.2 干露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦總抗氧化能力的影響

不同的暴露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦各組織總抗氧化能力的影響見圖2。隨著暴露時(shí)間的增加，凡納濱對(duì)蝦肌肉組織總抗氧化能力無顯著變化；心臟組織的總抗氧化能力呈先升后降的趨勢，暴露5 min組和15 min組與對(duì)照組相比顯著上升(P<0.05)；胃組織總抗氧化能力呈先升后降的趨勢，與對(duì)照組相比各組別呈顯著性變化(P<0.05)；空氣暴露組對(duì)蝦血清中總抗氧化能力顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；肝胰腺組織總抗氧化能力呈下降的趨勢，各空氣暴露組與對(duì)照組相比顯著降低(P<0.05)；腸道組織總抗氧化能力呈先升后降的趨勢，與對(duì)照組相比各組呈顯著性變化(P<0.05)。

圖2 不同的暴露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦各組織總抗氧化能力的影響Fig.2 Effects of different exposure time on T-AOC levels in various tissues of Pacific white shrimp L. vannamei

2.3 干露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦總超氧化物歧化酶活性的影響

不同暴露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦各組織總超氧化物歧化酶活性有明顯的影響(圖3)。隨著暴露時(shí)間的增加，凡納濱對(duì)蝦肌肉組織總超氧化物歧化酶活性呈顯著降低(P<0.05)；心臟組織的總超氧化物歧化酶活性在暴露15 min后呈顯著升高的趨勢(P<0.05)；胃組織的總超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在暴露5 min時(shí)與其他組相比顯著升高(P<0.05)；血清的活性呈先升后降的趨勢，與對(duì)照組相比各組顯著升高(P<0.05)；肝胰腺組織的總超氧化物歧化酶活性呈顯著下降的趨勢(P<0.05)；腸道組織的總超氧化物歧化酶活性呈先升后降的趨勢，在暴露5 min時(shí)與其他組相比顯著升高(P<0.05)。

圖3 不同的暴露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦各組織總超氧化物歧化酶活性的影響Fig.3 Effects of different exposure time on T-SOD activities in various tissues of Pacific white shrimp L. vannamei

2.4 干露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影響

不同的暴露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦各組織γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影響見圖4。隨著暴露時(shí)間的延長，凡納濱對(duì)蝦肌肉組織γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性無顯著變化；心臟組織的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性呈先降后升再降的趨勢，暴露5 min組和30 min組與對(duì)照組和15 min組相比顯著下降(P<0.05)；胃組織的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性呈先升后降的趨勢，暴露5 min組與其他組相比顯著升高(P<0.05)；血清組織的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性呈先升后降的趨勢，暴露15 min組和對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)；肝胰腺組織的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性呈下降趨勢，與對(duì)照組相比，各組顯著降低(P<0.05)；腸道組織的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性無顯著性變化。

圖4 不同的暴露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦各組織γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影響Fig.4 Effects of different exposure time on γ-GCS activities in various tissues of Pacific white shrimp L. vannamei

3 討 論

空氣暴露是無水運(yùn)輸活蝦期間的一種缺氧應(yīng)激脅迫，這種缺氧應(yīng)激脅迫易導(dǎo)致對(duì)蝦組織中產(chǎn)生過多的活性氧自由基，而機(jī)體活性氧自由基的快速積累，超出其活性氧自由基的清除能力，此時(shí)對(duì)蝦便處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[9-10]，這也是甲殼類動(dòng)物環(huán)境脅迫的毒性機(jī)制之一，嚴(yán)重時(shí)會(huì)威脅其存活[11-13]。由于不同甲殼動(dòng)物的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理代謝調(diào)節(jié)功能不同，在無水條件下存活時(shí)間差異很大，通常對(duì)蝦類暴露在空氣中時(shí)存活時(shí)間較短，而鰲蝦和蟹類存活時(shí)間較長，這與其相對(duì)封閉的鰓室和鰓結(jié)構(gòu)的進(jìn)化密不可分[14]。在開始暴露于空氣中到臨近死亡的過程中，即甲殼動(dòng)物在氧氣充足到缺氧窒息的過程中，機(jī)體是否真正發(fā)生了氧化應(yīng)激，此時(shí)，各組織中抗氧化防御系統(tǒng)如何變化？甲殼動(dòng)物這方面的研究極度缺乏。

3.1 干露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦丙二醛含量變化的分析

丙二醛是脂質(zhì)過氧化的主要分解產(chǎn)物，其含量的高低不僅可以間接反映活性氧自由基含量的多少，還可以反映組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的強(qiáng)度的大小或速率的快慢，被認(rèn)為是衡量動(dòng)物氧化應(yīng)激程度的最常用和最經(jīng)典的標(biāo)志物[15-16]。據(jù)報(bào)道，當(dāng)智利雪蟹(Paralomisgranulosa)暴露于空氣6 h后，肝胰腺和肌肉中的脂質(zhì)過氧化水平增加[17]。將體質(zhì)量為10～11 g 的日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeusjaponicus)放置干燥環(huán)境中進(jìn)行暴露試驗(yàn)，結(jié)果顯示其肝胰腺中丙二醛含量在脅迫3 h時(shí)顯著增加，將其再次放入水中時(shí)，丙二醛水平降至正常值[5]。有研究表明，11 g凡納濱對(duì)蝦低溫后空氣暴露前期肝胰腺中丙二醛和活性氧自由基水平顯著升高，暴露后期逐漸恢復(fù)至正常水平[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，在空氣中暴露不同時(shí)間顯著地提高了凡納濱對(duì)蝦血液、肝胰腺及胃中的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度，腸道、心臟中的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度呈上升趨勢，而肌肉中的丙二醛質(zhì)量摩爾濃度無顯著影響，與已有的研究結(jié)果一致。這表明，在空氣暴露30 min過程中，凡納濱對(duì)蝦多種組織中脂質(zhì)均發(fā)生了過氧化現(xiàn)象，表明各組織細(xì)胞均有不同程度的損傷。造成細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷可能是因?yàn)閷?duì)蝦暴露空氣后引起氧化應(yīng)激，細(xì)胞中活性氧自由基的過多積累而最終導(dǎo)致脂質(zhì)的過氧化。

3.2 干露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦總抗氧化能力變化的分析

在正常狀態(tài)下，細(xì)胞中會(huì)存在一定的活性氧自由基，因?yàn)榛钚匝踝杂苫梢宰鳛榈诙攀沟劝l(fā)揮其生理功能，因此活性氧自由基存在對(duì)于組織細(xì)胞來說是必要的，但是過量的活性氧自由基會(huì)使生物大分子發(fā)生氧化反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞功能喪失，甚至引起細(xì)胞凋亡或壞死。蝦類會(huì)調(diào)節(jié)活性氧自由基的產(chǎn)生并使用抗氧化劑防御措施將活性氧自由基保持在適當(dāng)?shù)乃揭钥刂蒲趸瘬p傷程度[19]?？偪寡趸芰Φ淖兓@示了機(jī)體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)及非酶系統(tǒng)對(duì)有害刺激的代償能力及體內(nèi)活性氧自由基的代謝情況，因此總抗氧化能力的大小常被用作評(píng)估機(jī)體抗氧化能力的重要性指標(biāo)[20]?？偪寡趸芰Π寡趸?超氧化物歧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶等)以及非酶抗氧化劑(谷胱甘肽、牛磺酸、抗壞血酸、維生素E、海藻糖、α-生育酚等)所具備的機(jī)體總體抗氧化酶活性[21]。在脅迫早期，總抗氧化能力的上升能反映出甲殼類動(dòng)物在環(huán)境脅迫下總體對(duì)抗氧化的能力的提高。因環(huán)境因子而導(dǎo)致甲殼類動(dòng)物總抗氧化能力改變的相關(guān)研究已有報(bào)道。如隨著缺氧暴露時(shí)間增加，中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)血淋巴中總抗氧化能力逐漸降低[22]；13～14 g的凡納濱對(duì)蝦暴露在空氣中其肌肉及肝胰腺組織總抗氧化能力顯著降低[21]；而有學(xué)者研究表明，低溫后空氣暴露前期11 g的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中總抗氧化能力顯著升高，暴露后期逐漸恢復(fù)至正常水平[18]。在本試驗(yàn)中，肝胰腺組織總抗氧化能力顯著降低，而其他組織(心臟、肌肉、血淋巴、胃和腸道)均呈上升趨勢。這些結(jié)果說明，環(huán)境因子的變化能夠引起對(duì)蝦組織的抗氧化反應(yīng)，但具有一定的組織差異性。其中肝胰腺組織總抗氧化能力出現(xiàn)顯著降低可能是因?yàn)楦我认倬邆涓叽x率并具有解毒和吸收功能，在無水低溫脅迫過程中更容易受到氧化應(yīng)激引起抗氧化反應(yīng)，從而具備更強(qiáng)的抵抗氧化損傷的能力[23],但嚴(yán)重缺氧對(duì)于對(duì)蝦抗氧化功能來說是極為不利的。

3.3 干露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦總超氧化物歧化酶活性變化的分析

抗氧化酶系統(tǒng)是動(dòng)物體普遍存在用于清除過多活性氧自由基的酶類，其中超氧化物歧化酶是細(xì)胞抗氧化酶系統(tǒng)中最常見、最有效的一種，它可催化超氧陰離子生成過氧化氫，而過氧化氫在過氧化氫酶的作用下進(jìn)一步生成無毒的水分子[24]。低氧暴露、低氧運(yùn)動(dòng)可引發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧自由基[25]。為了清除過多的活性氧自由基，抗氧化酶持續(xù)消耗，因此，表現(xiàn)出了酶活性的普遍降低。在通過填充氮?dú)馐寡鯕赓|(zhì)量濃度達(dá)到0.5 mg/L的低氧環(huán)境脅迫4 h后，張口蟹(Neohelicegranulata)肌肉中的超氧化物歧化酶活性呈下降趨勢[26]。據(jù)報(bào)道，13～14 g凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中的超氧化物歧化酶活性在暴露于空氣的40 min內(nèi)逐漸增加[21]。而凡納濱對(duì)蝦血淋巴、肝胰腺和鰓中的超氧化物歧化酶活性在無水條件下時(shí)呈先升后降趨勢并逐漸趨于穩(wěn)定。已有研究結(jié)果顯示，11 g的凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺和血淋巴超氧化物歧化酶活性均隨著暴露時(shí)間先升高后趨于穩(wěn)定[18]。10 cm凡納濱對(duì)蝦在3.0×10-6低氧條件下肝胰腺中超氧化物歧化酶活性先增后降[27]。據(jù)報(bào)道，持續(xù)6 h的缺氧應(yīng)激脅迫導(dǎo)致凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中錳超氧化物歧化酶活性和轉(zhuǎn)錄本水平顯著下降[28]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，長時(shí)間暴露于空氣中，肌肉和肝胰腺總超氧化物歧化酶活性顯著降低，與上述脅迫應(yīng)激研究結(jié)果一致。而血淋巴、心臟總超氧化物歧化酶活性變化趨勢相反，長時(shí)間暴露于空氣中，血淋巴、心臟總超氧化物歧化酶活性顯著升高，說明血淋巴、心臟與肌肉、肝胰腺相比，總超氧化物歧化酶活性變化有一定的延遲。對(duì)中華絨螯蟹[29]的研究表明，在缺氧期間超氧化物歧化酶活性增加，這使其能夠耐受缺氧環(huán)境并降低氧化應(yīng)激的影響。這個(gè)過程被稱為“氧化應(yīng)激的準(zhǔn)備”[30]。在本試驗(yàn)中血淋巴和心臟的結(jié)果相似。對(duì)腸道來說，在刺激最短的時(shí)間內(nèi)，總超氧化物歧化酶活性顯著升高，而后恢復(fù)正常水平，說明腸道總超氧化物歧化酶活性對(duì)于空氣暴露刺激最為敏感，可以作為以后研究的首選對(duì)象。對(duì)比上述研究結(jié)果，本試驗(yàn)總超氧化物歧化酶活性變化與其并不完全相同，其原因可能與刺激條件、對(duì)蝦規(guī)格和狀態(tài)等有一定關(guān)系。

3.4 干露時(shí)間對(duì)凡納濱對(duì)蝦γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性變化的分析

谷胱甘肽的巰基供氫體,是存在于生命有機(jī)體中的一種特殊的三肽，它不參與蛋白質(zhì)的合成，是細(xì)胞中廣泛分布的天然活性氧自由基清除劑。在谷胱甘肽過氧化物酶等催化下，還原型的谷胱甘肽與活性氧自由基能發(fā)生反應(yīng)生成氧化型的谷胱甘肽，以此來清除細(xì)胞內(nèi)過多的活性氧自由基和過氧化物，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，維持組織結(jié)構(gòu)的完整和正常功能的行使[31-32]。據(jù)報(bào)道，中華絨螯蟹經(jīng)空氣暴露后，血淋巴中谷胱甘肽過氧化物酶活性先升高后逐漸降低[22]。而10 cm的凡納濱對(duì)蝦在3.0×10-6低氧條件下肝胰腺中谷胱甘肽過氧化物酶活性先升后降[27]。在空氣暴露試驗(yàn)中，谷胱甘肽過氧化物酶活性下調(diào)，這可能反映了持續(xù)缺氧抑制了蛋白質(zhì)合成和代謝，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄特征普遍下降。一般動(dòng)物能夠通過自身儲(chǔ)存的底物來合成谷胱甘肽，而谷胱甘肽連接酶(γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶)是合成谷胱甘肽的關(guān)鍵限速酶，能夠決定細(xì)胞中谷胱甘肽的水平，因此γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶也是一種典型且敏感的抗氧化酶，對(duì)細(xì)胞的抗氧化能力起到重要的指示作用。對(duì)蝦的研究上，對(duì)于γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的相關(guān)報(bào)道極為缺乏，因此，筆者對(duì)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的變化進(jìn)行了系統(tǒng)的檢測，結(jié)果顯示，肝胰腺、腸道和心臟中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性顯著降低，而血淋巴中的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性顯著升高后恢復(fù)正常。這一結(jié)果說明，空氣暴露對(duì)不同組織γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的影響具有組織特異性，并且空氣暴露能夠明顯地誘導(dǎo)γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶的變化，由此可以推測，細(xì)胞中谷胱甘肽的水平也會(huì)出現(xiàn)相應(yīng)的變化，而這種改變正是細(xì)胞應(yīng)對(duì)空氣暴露這種環(huán)境刺激的一種策略。

通過不同抗氧化相關(guān)指標(biāo)的檢測，筆者發(fā)現(xiàn)，隨著暴露時(shí)間延長，肝胰腺、血淋巴、心臟、腸道組織比胃、肌肉組織更容易受到氧化損傷，這與凡納濱對(duì)蝦肝胰腺抗氧化能力強(qiáng)于肌肉[21]的研究結(jié)果一致。相比之下，肝胰腺中丙二醛質(zhì)量摩爾濃度、總抗氧化能力、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性、總超氧化物歧化酶活性變化最為顯著且數(shù)值較高，而血淋巴總抗氧化能力和總超氧化物歧化酶活性最高，表明肝胰腺和血淋巴氧化應(yīng)激程度相對(duì)較高。原因可能是甲殼類動(dòng)物沒有適應(yīng)性免疫系統(tǒng)[33-34],它們僅通過先天免疫系統(tǒng)抵抗壓力[35-36]。血淋巴在甲殼動(dòng)物的先天免疫中起著重要作用，而肝胰腺參與消化、儲(chǔ)存物質(zhì)，脂質(zhì)代謝，碳水化合物代謝，排毒和吸收過程[37]，它具有相對(duì)較高的代謝率，并且在空氣暴露中更容易受到氧化應(yīng)激的影響。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，凡納濱對(duì)蝦不同抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)在不同時(shí)間段和不同組織之間的變化并不一致。其原因可能是：不同的抗氧化酶和抗氧化物質(zhì)之間各自扮演著不同的角色，其作用并不相同，在同一時(shí)間內(nèi)對(duì)刺激所做出的反應(yīng)會(huì)有不同；另外，因?qū)ξr抗氧化功能具有一定的組織特異性，同一指標(biāo)在不同組織間可能出現(xiàn)了作用延遲的現(xiàn)象，最后導(dǎo)致了各組織不同時(shí)間段抗氧化指標(biāo)的差異。但總的來說，凡納濱對(duì)蝦各組織中的總超氧化物歧化酶、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性隨著空氣暴露脅迫均呈現(xiàn)下降趨勢，與總抗氧化能力變化趨勢基本一致，并與丙二醛質(zhì)量摩爾濃度變化趨勢相反，證實(shí)了空氣暴露確實(shí)引起凡納濱對(duì)蝦產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

3.5 未來展望

目前，空氣暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦影響方面的研究是行業(yè)熱點(diǎn)問題，已有的研究結(jié)果顯示，空氣暴露能夠引起對(duì)蝦的免疫反應(yīng)[38]，缺氧刺激會(huì)導(dǎo)致對(duì)蝦細(xì)胞凋亡[6]。而這些結(jié)果均與對(duì)蝦活性氧自由基產(chǎn)生和抗氧化能力密切相關(guān)[39]，因此對(duì)蝦的抗氧化能力是潛在的抵抗力，增強(qiáng)對(duì)蝦的抗氧化能力對(duì)于提高生長性能、抵抗應(yīng)激具有重要意義。而空氣暴露或者缺氧對(duì)凡納濱對(duì)蝦抗氧化系統(tǒng)影響的研究較為缺乏，這對(duì)于解決凡納濱對(duì)蝦干法運(yùn)輸是不利的。另外，對(duì)蝦抗氧化功能的研究還主要集中在代謝水平方面，還應(yīng)該向調(diào)控抗氧化功能的經(jīng)典信號(hào)通路Keap1-Nrf2-ARE方向開展深入研究[40]。并且對(duì)蝦上是否存在Keap1-Nrf2-ARE信號(hào)通路？對(duì)抗氧化系統(tǒng)起控制作用的信號(hào)通路是什么？這些問題仍需進(jìn)一步的深入研究。針對(duì)于空氣暴露或者缺氧刺激來說，最敏感的蛋白是缺氧誘導(dǎo)因子[41-42]，并且該蛋白的cDNA全長等分子基礎(chǔ)信息相對(duì)全面[43]，因此，應(yīng)將抗氧化功能與缺氧誘導(dǎo)因子、細(xì)胞免疫、細(xì)胞凋亡等結(jié)合起來研究，才能夠清晰地詮釋空氣暴露或者缺氧對(duì)凡納濱對(duì)蝦的綜合影響。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，將凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行室溫空氣暴露能夠明顯地引起對(duì)蝦各組氧化應(yīng)激；不同組織對(duì)空氣暴露刺激的響應(yīng)具有組織特異性，其抗氧化能力變化趨勢不同，其中肝胰腺、血淋巴、心臟和腸道相對(duì)敏感；短時(shí)間(5 min)的空氣暴露對(duì)凡納濱對(duì)蝦組織抗氧化功能破壞較小，而長時(shí)間(30 min)的空氣暴露能明顯降低組織的抗氧化能力。