李凡妮，張 磊，于田雨，佘軍軍，孫 祺

肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)起源于肝內(nèi)膽管上皮，是常見的肝臟惡性腫瘤，占肝臟原發(fā)惡性腫瘤的5%～30%[1]。由于早期臨床癥狀不典型以及進(jìn)展快速的特性，大多數(shù)iCCA患者在初診時(shí)通常已失去根治性手術(shù)機(jī)會(huì)，放、化療等輔助治療的效果也并不理想[2-3]。iCCA患者預(yù)后較差，即使是接受根治性切除術(shù)的iCCA患者，其5年總生存率仍低于40%[4]。目前，針對iCCA的個(gè)性化治療尚缺乏有效的靶向治療[5]。因此，明確iCCA發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制，并尋找有效的分子靶點(diǎn)對iCCA的治療尤為重要。ANXA9是膜聯(lián)蛋白家族ANXA亞組中的一員，其在腫瘤的進(jìn)展過程中發(fā)揮重要作用。已有文獻(xiàn)報(bào)道ANXA9在胃癌組織中高表達(dá)，其與組織分化程度和預(yù)后有關(guān)[6]，并且能促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖[7]，但ANXA9與iCCA的相關(guān)性尚未見報(bào)道。本文著重探討ANXA9在iCCA中的表達(dá)，并通過干預(yù)ANXA9的表達(dá)及細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步明確其對iCCA侵襲的影響，以期為iCCA的治療靶點(diǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2020年6～9月西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受根治性切除術(shù)的12例iCCA患者的新鮮癌組織及相應(yīng)的癌旁正常組織。另收集67例行根治性切除術(shù)患者的iCCA蠟塊并制備成組織切片。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 細(xì)胞株人iCCA細(xì)胞株HuCCT1，購自武漢普諾賽公司。

1.3 方法

1.3.1免疫組化 石蠟切片脫蠟水化后，使用檸檬酸鹽緩沖液(pH 6.0)結(jié)合微波進(jìn)行表位抗原修復(fù)，用3%過氧化氫處理30 min，以淬滅內(nèi)源性過氧化物酶活性。用10%正常山羊血清處理30 min，與抗人ANXA9的小鼠單克隆抗體(sc-374288，Santa Cruz公司)在4 ℃孵育過夜，與抗小鼠二抗孵育30 min，通過DAB(上海碧云天公司)進(jìn)行免疫組化SP法染色，蘇木精復(fù)染，脫水封固。

1.3.2qRT-PCR檢測 通過RNeasy試劑盒(Qiagen公司)提取組織或細(xì)胞的總RNA，應(yīng)用SuperScript First Strand cDNA試劑盒(Invitrogen公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，使用SYBR Green和LightCycler 480 PCR系統(tǒng)(Roche公司)進(jìn)行相對定量分析。ANXA9的引物序列：正向5′-CAGCTCATCTCACGAAACTTCC-3′，反向5′-GGTTCGAGTGGCAAGAATTTCAA-3′；β-actin內(nèi)參基因引物序列：正向5′-CATGTACGTTGCTATCCAG GC-3′，反向5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)結(jié)果采用2-△△CT法進(jìn)行分析。

1.3.3細(xì)胞培養(yǎng)和siRNA轉(zhuǎn)染 將處于對數(shù)生長期的HuCCT1細(xì)胞在含有10%胎牛血清(Gibco公司)、1%青霉素-鏈霉素雙抗混合液(上海碧云天公司)的RPMI 1640(Thermo Fisher公司)中培養(yǎng)。通過Lipofectamine 3000(Invitrogen公司)將靶向ANXA9的siRNA轉(zhuǎn)染HuCCT1細(xì)胞。ANXA9 siRNA的序列：5′-GCAGUCUACAAACACAAUU-3′，由上海生工公司合成。

1.3.4Transwell實(shí)驗(yàn) 使用預(yù)先包被Matrigel(Thermo Fisher公司)、孔徑為8 μm的Transwell小室(Corning公司)進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。使用無血清培養(yǎng)基將1×105個(gè)HuCCT1細(xì)胞接種至上室，下室用完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。24 h后，用棉簽除去上層未侵襲的細(xì)胞，然后進(jìn)行固定和染色，在4個(gè)隨機(jī)視野(400×)對侵襲的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.3.5Western blot法 使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液裂解細(xì)胞，通過Bio-Rad BCA蛋白質(zhì)測定法確定蛋白濃度后，將等量的蛋白在SDS-PAGE中電泳分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉后與ANXA9抗體4 ℃孵育過夜，通過ECL化學(xué)發(fā)光液(Thermo Fisher公司)進(jìn)行顯影。以β-actin作為內(nèi)參。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。通過χ2檢驗(yàn)比較ANXA9的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本均數(shù)的比較，通過方差分析進(jìn)行多個(gè)樣本均數(shù)的比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 iCCA和癌旁組織中ANXA9的表達(dá)采用qRT-PCR對12例iCCA組織及癌旁正常組織中ANXA9的mRNA水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示iCCA組織中ANXA9 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1 肝內(nèi)膽管癌組織及癌旁正常組織中ANXA9 mRNA的相對表達(dá)量：與癌旁正常組織相比，**P<0.01

2.2 iCCA中ANXA9的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系采用免疫組化檢測67例iCCA組織中ANXA9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)ANXA9表達(dá)主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈淺～棕黃染色；iCCA組織中有39例(58.2%)ANXA9呈陽性(圖2A)，28例(41.8%)呈陰性(圖2B)。ANXA9的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)(表1)。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越高者，ANXA9的表達(dá)水平越高(P<0.05)。

圖2 A.肝內(nèi)膽管癌組織中ANXA9呈陽性；B.肝內(nèi)膽管癌組織中ANXA9呈陰性，SP法

表1 肝內(nèi)膽管癌中ANXA9表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 siRNA對HuCCT1細(xì)胞中ANXA9基因表達(dá)的影響為驗(yàn)證siRNA對ANXA9的沉默效應(yīng)，本組對HuCCT1細(xì)胞轉(zhuǎn)染靶向ANXA9的siRNA后，發(fā)現(xiàn)ANXA9基因的表達(dá)水平下調(diào)。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA實(shí)驗(yàn)組與對照組相比，其細(xì)胞ANXA9的轉(zhuǎn)錄水平降低(P<0.05)，提示干擾成功，本組siRNA能夠抑制ANXA9基因的表達(dá)(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染siRNA后，HuCCT1細(xì)胞中ANXA9 mRNA的表達(dá)：與對照組相比，*P<0.05

2.4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測沉默ANXA9對細(xì)胞侵襲的影響通過Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)比較ANXA9 siRNA實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞的侵襲能力，結(jié)果顯示：培養(yǎng)24 h后對照組可見多量癌細(xì)胞侵襲，每視野為(72±6)個(gè)細(xì)胞，而ANXA9 siRNA實(shí)驗(yàn)組癌細(xì)胞的侵襲數(shù)目明顯減少，每視野為(37±4)個(gè)細(xì)胞，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示與對照組相比，實(shí)驗(yàn)組siRNA沉默ANXA9的表達(dá)后，HuCCT1細(xì)胞的侵襲能力明顯降低(圖4)。

圖4 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測沉默ANXA9對HuCCT1細(xì)胞侵襲的影響：與對照組相比，*P<0.05

2.5 Western blot法檢測沉默ANXA9對MMP-9表達(dá)的影響本組Western blot結(jié)果顯示，在對照組和ANXA9 siRNA實(shí)驗(yàn)組均可見MMP-9蛋白的表達(dá)；與對照組相比，通過siRNA沉默HuCCT1細(xì)胞中ANXA9的表達(dá)后，不僅ANXA9的蛋白水平明顯下調(diào)，而且MMP-9的蛋白表達(dá)明顯降低，提示ANXA9能夠調(diào)控HuCCT1細(xì)胞中MMP-9的表達(dá)(圖5)。

圖5 Western blot法檢測沉默ANXA9對MMP-9表達(dá)的影響

3 討論

膜聯(lián)蛋白是真核生物細(xì)胞中最大類別的鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白家族，其家族成員包括A、B、C、D和E亞組，在細(xì)胞分化和增殖等各種生理過程中發(fā)揮重要作用[8]。ANXA亞組包含12個(gè)成員[9]，其中許多成員與腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)。袁虎方等[10]發(fā)現(xiàn)ANXA7的表達(dá)與胃癌患者預(yù)后及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且可作為判斷胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測因素。此外，胃癌患者外周血液中ANXA7的水平能夠較好反映其在癌組織中的表達(dá)水平，可作為診斷胃癌的輔助指標(biāo)[11]。ANXA6作為乳腺癌進(jìn)展的生物學(xué)標(biāo)志物，能夠預(yù)測乳腺癌的復(fù)發(fā)及其對表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑(EGFR-TKI)靶向治療的反應(yīng)和療效，ANXA6表達(dá)的上調(diào)與獲得性EGFR-TKI耐藥性有關(guān)[12]。ANXA2可能通過增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例并降低天然殺傷細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞的比例調(diào)節(jié)免疫微環(huán)境，最終促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[13]。然而，作為膜聯(lián)蛋白家族的新成員，目前鮮有ANXA9在腫瘤進(jìn)展中的作用報(bào)道，尤其是ANXA9在iCCA中的表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ANXA9在iCCA組織中高表達(dá)，并且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期密切相關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道ANXA9可作為結(jié)直腸癌和乳腺癌預(yù)后不佳的標(biāo)志物[14-15]。此外，ANXA9的表達(dá)與結(jié)腸癌的浸潤深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，并且能夠促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和侵襲[16]。癌細(xì)胞在轉(zhuǎn)移擴(kuò)散過程中，首先需要通過降解基膜，突破限制其侵襲的天然屏障。IV型膠原是基膜的主要成分，而作為一種常見的鋅依賴性蛋白水解酶，MMP-9能夠降解IV型膠原，并重塑細(xì)胞外基質(zhì)，從而促進(jìn)腫瘤的血管生成及轉(zhuǎn)移[17-18]。MMP-9的表達(dá)水平與膽管癌等多種惡性腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[19-22]。不同的膜聯(lián)蛋白與基質(zhì)金屬蛋白酶之間可能存在相關(guān)性，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道ANXA7下調(diào)通過降低MMP-9的表達(dá)抑制胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲[23]，而ANXA1在彌漫性星形細(xì)胞瘤中的表達(dá)與MMP-9表達(dá)呈正相關(guān)[24]。本組體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)通過siRNA沉默ANXA9的表達(dá)能夠抑制iCCA細(xì)胞的侵襲能力，且伴隨MMP-9表達(dá)水平的下調(diào)，提示ANXA9有可能通過MMP-9調(diào)控細(xì)胞的侵襲，促進(jìn)iCCA的進(jìn)展。

不同的ANXA成員在腫瘤進(jìn)展過程中發(fā)揮不同的作用。在部分類型的腫瘤中，某些ANXA成員的表達(dá)呈下調(diào)趨勢，如ANXA6在胃癌中通過啟動(dòng)子甲基化被下調(diào)，其通過抑制MAPK信號(hào)通路發(fā)揮抑癌作用[25]。ANXA10是肝細(xì)胞分化和生長停滯的標(biāo)志物，ANXA10在肝細(xì)胞癌組織中低表達(dá)，并隨著分期的增加表達(dá)下降，其與MMP-9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[26]。ANXA5過表達(dá)能夠通過調(diào)節(jié)E-cadherin和MMP-9的表達(dá)抑制子宮頸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[27]，而ANXA1在不同類型的腫瘤中具有不同的促癌或抑癌作用[28]。因此，ANXA在癌癥中的不同表達(dá)特點(diǎn)與功能具有組織特異性。

ANXA成員中除了本組發(fā)現(xiàn)ANXA9與iCCA的進(jìn)展密切相關(guān)以外，ANXA2的表達(dá)與肝內(nèi)膽管結(jié)石相關(guān)iCCA的惡性程度和預(yù)后密切相關(guān)[29]。ANXA5能夠抑制膽管癌細(xì)胞的凋亡，沉默ANXA5的表達(dá)可抑制膽管癌細(xì)胞的增殖和侵襲[30]。膽管癌中ANXA2表達(dá)上調(diào)，其可能通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞外基質(zhì)降解進(jìn)而影響疾病轉(zhuǎn)歸[31]。Wang等[32]發(fā)現(xiàn)ANXA1在肝門部膽管癌中表達(dá)降低，且ANXA1表達(dá)水平的降低與患者的不良預(yù)后相關(guān)，提示ANXA1可能在肝門部膽管癌中發(fā)揮抑癌作用，提示不同的ANXA成員在膽管癌進(jìn)展過程中發(fā)揮的作用及機(jī)制也不完全相同。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示ANXA9在iCCA中高表達(dá)，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期相關(guān)，其機(jī)制可能是ANXA9通過調(diào)控MMP-9的表達(dá)誘導(dǎo)iCCA細(xì)胞的侵襲。本實(shí)驗(yàn)揭示了ANXA9在iCCA中的表達(dá)及其對iCCA細(xì)胞侵襲的影響及可能機(jī)制，為iCCA的治療提供一個(gè)新的潛在分子靶點(diǎn)及理論依據(jù)。