劉明廣，張娜娜，郭鳳軍

(1.阜陽職業(yè)技術學院 生化工程系，安徽 阜陽 236031；2.阜南縣眾犇農業(yè)科技有限公司，安徽 阜陽 236300)

大肥蘑菇(Agaricusbitorquis)又名大肥菇，美味蘑菇，雙環(huán)菇，雙環(huán)蘑菇，大白蘑菇，屬于擔子菌綱(Basidiomycetes)傘菌目(Agaricales)蘑菇科(Agaricaceae)蘑菇屬(Agaricus)[1]。廣泛存在于世界各地不同的生態(tài)環(huán)境中[2]，其菌肉肥厚，營養(yǎng)豐富，味道細嫩鮮美[3-5]，子實體多糖具有良好的抗缺氧、抗疲勞和抗氧化功能，是一種具有很好開發(fā)前景的食用菌[6-8]。國外對大肥蘑菇的研究比較少，國內對大肥蘑菇的研究主要集中在青海省柴達木盆地的大肥蘑菇、新疆博斯藤湖區(qū)域大肥蘑菇以及河北壩上地區(qū)大肥蘑菇。主要研究其資源分布、生物學特性、液體培養(yǎng)基和馴化等[9-12]，而對供試菌株固體培養(yǎng)條件的篩選卻少有報道。本研究對一株大肥蘑菇的固體培養(yǎng)條件進行篩選，探尋該菌株的最適生長條件(包括碳源、氮源、無機鹽、溫度、pH及其最佳組合)，以期為該菌株的后續(xù)開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

1.1.1 供試菌株

大肥蘑菇(ACCC50034)，由中國農業(yè)微生物菌種保藏管理中心提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

供試培養(yǎng)基：蛋白胨1g、葡萄糖10g、瓊脂9.5g、硫酸鎂0.3g、磷酸二氫鉀0.5g、蒸餾水定容至500mL，121℃滅菌30min，pH自然。將大肥蘑菇菌種按無菌操作接種到含有供試培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿，25℃恒溫培養(yǎng)，待菌絲基本長滿平板待用。

1.1.3 儀器與設備

17J-4766型立式壓力蒸汽滅菌鍋(江陰濱江醫(yī)療設備有限公司)；SPX-328型生化培養(yǎng)箱(寧波江南儀器廠)；HFsafe-1500LC型超凈工作臺(上海力申科學儀器有限公司)。

1.2 單因素分析

1.2.1 碳源試驗

制備6種不同碳源培養(yǎng)基：碳源20g，瓊脂20g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5g，蛋白胨2g，純凈水1000mL；試驗用碳源分別為果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉和葡萄糖，121℃滅菌30min。每組5個重復平板，在超凈工作臺上用直徑為5mm的無菌打孔器取大肥蘑菇菌落邊緣菌絲塊接入不同碳源的平板中央，25℃恒溫培養(yǎng)。培養(yǎng)第10天記錄菌絲生長狀況，測量菌落半徑，以菌落平均半徑除以培養(yǎng)天數(shù)即為菌絲的日平均生長速度。

1.2.2 氮源試驗

制備6種不同氮源培養(yǎng)基：氮源，葡萄糖20g，瓊脂20g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5g，純凈水1000mL；每組添加氮源分別為酵母浸粉6g、蛋白胨3g、尿素1g、玉米粉30g、麩皮30g和硫酸銨2.5g，121℃滅菌30min。每組5個重復平板，接種第10天分別記錄菌絲生長狀況和菌絲生長速度，接種方法、培養(yǎng)方法和菌絲平均生長速度計算方法同1.2.1。

1.2.3 無機鹽試驗

配制5種不同無機鹽培養(yǎng)基：葡萄糖20g，酵母浸粉2g，瓊脂20g，純凈水1000mL；每組添加無機鹽分別為硫酸鎂0.5g、磷酸二氫鉀1g、硫酸鈣0.5g、硫酸鋅0.5g、硫酸亞鐵0.5g，121℃滅菌30min。每組5個重復平板，接種第10天分別記錄菌絲生長狀況和菌絲生長速度；接種方法、培養(yǎng)方法和菌絲平均生長速度計算方法同1.2.1。

1.2.4 溫度試驗

設置5個溫度梯度：10℃、15℃、20℃、25℃和30℃，每一梯度設置5個重復平板，接種后分別放入上述溫度的生化培養(yǎng)箱進行恒溫培養(yǎng)，培養(yǎng)到第12天分別記錄菌絲生長狀況和菌絲生長速度，接種方法和菌絲平均生長速度計算方法同1.2.1。

1.2.5 pH試驗

供試培養(yǎng)基(同1.1.2)滅菌后，在超凈工作臺上趁熱用無菌移液管滴加1mol/L HCl或1mol/L NaOH溶液，調整培養(yǎng)基pH至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5和9.0共9個梯度，每個梯度設5個重復平板，接入供試菌種，接種后的平板于25℃恒溫培養(yǎng)。接種第10天分別記錄菌絲生長狀況和生長速度，接種方法和菌絲平均生長速度計算方法同1.2.1。

1.3 正交實驗

從上述5個單因素中選取碳源、氮源、溫度和pH 4個因素，每個因素各選出3個處理組建“4因素3水平”的正交實驗，其培養(yǎng)基為正交實驗表上對應的碳源、氮源、溫度以及對應的pH。每組3個重復平板，接種方法和菌絲平均生長速度計算方法同1.2.1。

1.4 統(tǒng)計與分析

對實驗數(shù)據(jù)采用SPSS21.0進行分析，對所得數(shù)據(jù)用Duncan進行統(tǒng)計分析(P<0.05)。

2 試驗結果及分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 碳源試驗

由表1可知，碳源影響大肥蘑菇菌絲的生長勢、生長速度和顏色，在碳源為麥芽糖的培養(yǎng)基上菌絲白色、稠密，生長速度最快，生長勢也最好；在葡萄糖和蔗糖的碳源上菌絲生長速度差異不明顯，蔗糖碳源上菌絲白色、稠密，葡萄糖碳源上菌絲灰白、稀疏；在可溶性淀粉上菌絲生長速度最慢，生長勢也最差。綜合比較，麥芽糖為該菌株的最適碳源，之后依次是蔗糖和葡萄糖。

表1 碳源對大肥蘑菇菌絲的影響

2.1.2 氮源試驗

由表2可知，菌絲對無機氮源的適應能力較差，對有機氮源的適應能力較好。在麩皮氮源條件下菌絲生長勢最好，菌絲白色、稠密，生長速度最快；在硫酸銨氮源條件下菌絲不生長；在蛋白胨和玉米粉氮源條件下菌絲生長速度差異不明顯，在蛋白胨培養(yǎng)條件下菌絲白色、邊緣處菌絲稀疏，而在玉米粉培養(yǎng)條件下菌絲灰白、稀疏。所以麩皮為該菌株的最適氮源，之后依次是蛋白胨和玉米粉。

表2 氮源對大肥蘑菇菌絲的影響

2.1.3 無機鹽試驗

由表3可知，硫酸鈣培養(yǎng)條件下該菌株的菌絲白色、稠密，菌絲生長勢最好，菌絲生長速度最快；硫酸鎂、硫酸鋅無機鹽條件下菌絲生長速度差異不明顯，但在硫酸鋅的培養(yǎng)條件下，菌絲灰白，兩者與硫酸鈣相比差異顯著；磷酸二氫鉀和硫酸亞鐵無機鹽條件下菌絲生長速度比較慢，菌絲生長勢最弱。所以硫酸鈣為該菌株的最適無機鹽，其次是硫酸鎂，再次是硫酸鋅。

表3 無機鹽對大肥蘑菇菌絲的影響

2.1.4 溫度試驗

由表4可以看出，在不同培養(yǎng)溫度下，菌絲生長勢、菌絲體顏色和菌絲生長速度不同，在20℃條件下菌絲生長勢最好，生長速度最快，菌絲白色、稠密而健壯；25℃條件下菌絲雖然生長勢也最好，但菌落不圓整，菌落邊緣顏色較淺，與20℃的差異顯著；該菌株在10℃條件下菌絲長勢弱，生長速度比較慢；在35℃菌絲停止生長，菌種塊退化變成黃褐色。綜上所述，20℃為該菌株的最適生長溫度，之后依次是25℃和15℃。

表4 溫度對大肥蘑菇菌絲的影響

2.1.5 pH試驗

由表5可知，培養(yǎng)基的酸堿度影響該菌株的菌絲生長勢、顏色和生長速度，只有在合適的pH條件下菌絲才能生長。當pH為6.5和7.0時，菌絲生長勢最好，菌絲白色、稠密，但pH為6.5時，菌絲生長速度最快，兩者的菌絲生長速度差異顯著；菌絲在pH 5.0和pH 5.5條件下均停止生長，因此該菌株的最適pH為6.5，其次是pH 7，再次是pH 7.5。

表5 pH對大肥蘑菇菌絲的影響

2.2 正交試驗結果

通過“4因素3水平”的正交結果的直觀分析表(表6)可知，溫度的極差(R)最大，極差為0.7，在4個單因素中溫度處于最重要的地位，接著是pH，然后是氮源，最后是碳源，后3個因素的極差分別對應為0.28、0.17、0.12。均值(X)中，碳源的X1、氮源的X3、溫度的X2和pH的X2強于其他條件，即該株大肥蘑菇菌絲的最適生長條件是麥芽糖、麩皮、20℃和pH6.5。正交試驗結果與單因素試驗結果一致。

表6 大肥蘑菇菌絲生長的正交試驗結果的直觀分析

3 討論

大肥蘑菇是一種食用價值很高的大型真菌，子實體碩大、菌肉肥厚，開發(fā)前景好，分析大肥蘑菇的固體培養(yǎng)條件，是開發(fā)利用大肥蘑菇資源的基礎。本研究通過單因素試驗和正交試驗，分析出該株大肥蘑菇菌絲的最適碳源是麥芽糖、最適無機鹽為硫酸鈣，而王燕雲(yún)[13]研究發(fā)現(xiàn)青海高原野生大肥蘑菇的最適碳源為麥芽糖、最適氮源為硝酸鉀、最適無機鹽為硫酸鎂+磷酸二氫鉀，最適碳源與本研究一致，但最適無機鹽不同。馬宇生等[14]研究大肥蘑菇低溫型菌株的生物學特性，發(fā)現(xiàn)菌絲生長溫度為5～24℃，最適溫度18～22℃，本研究的大肥蘑菇菌絲的最適生長溫度是20℃，因此該菌株也屬于低溫型菌株。

不同大肥蘑菇菌株的生活習性往往有些差異，可能與不同菌株的特殊生態(tài)環(huán)境有關，該研究分析了大肥蘑菇菌絲生長的最適碳源是麥芽糖、最適氮源為麩皮、最佳無機鹽為硫酸鈣、最適生長溫度是20℃、最適酸堿度為pH 6.5，將為該菌株的開發(fā)利用提供參考和依據(jù)，但該菌株的高產栽培料配方和最佳出菇環(huán)境參數(shù)還不清楚，這些還有待進一步研究。