李 笑 王 菲 彭 婕 陳 放 徐 鶯

（四川大學生命科學學院 生物資源與生態(tài)環(huán)境教育部重點實驗室，四川 成都 610065）

1 引言

麻瘋樹是一種多用途能源植物，具有適應性強且種子含油量高的特點，同時含有多種活性成分，如佛波酯、麻瘋樹毒蛋白、凝集素等[1]。麻瘋樹毒蛋白及一些凝集素都屬于核糖體失活蛋白（ribosome-inactivating protein, RIP）。

RIP是一類能破壞真核細胞核糖體結構的毒蛋白，在植物應對生物和非生物脅迫時承擔調節(jié)作用[2]。根據(jù)基因的序列結構和性質，RIP家族可分為3類[3]：I型RIP數(shù)量最多，含有單個RIP結構域（PF00161）；II型RIP毒性較強，除RIP結構域外，其C端還含有凝集素結構域（PF00652），分別稱為A鏈和B鏈，由二硫鍵連接；III型RIP結構與I型相比具有一個額外的20kDa的C端區(qū)域，前體多肽需經(jīng)翻譯后加工步驟去除N端、C端的短片段及中間連接序列后才具有活性，目前僅發(fā)現(xiàn)來自大麥的JIP60和來自玉米的b-32。

大戟科的沙匣樹、商陸科美洲商陸衰老和受脅迫的葉片中都提取出了核糖體失活蛋白，表明這類蛋白可能在脅迫響應中發(fā)揮功能[4]。若能從麻瘋樹中分離出高毒性的凝集素，將進一步提高麻瘋樹的應用價值。因此，本研究對麻瘋樹中II型RIP基因編碼的序列同源性、重要氨基酸位點進行分析，并對其時空表達模式進行探究，以期為高抗性、高產(chǎn)量麻瘋樹的育種提供理論基礎。

2 材料與方法

2.1 植物材料及處理

麻瘋樹種子購買自四川攀枝花，在種子萌發(fā)后兩周左右，待第一片真葉長約0.5～1cm，進行組織取材，包括麻瘋樹的胚乳、子葉、第一片真葉、葉柄、莖、側根、主根等組織。在對麻瘋樹進行干旱處理，分別在處理的第1、2、4和7天四個時間階段收集根和葉組織，同時將未處理的組織作為對照組，迅速放入液氮中，置于-80℃冰箱中保存。

2.2 生物信息學分析

從NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）上下載麻瘋樹的基因組數(shù)據(jù)，從Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）中下載RIP結構域模型(PF00161)和Ricin_B_lectin結構域模型（PF00652），利用本地HMMER程序對麻瘋樹的基因組進行檢索，將 E值小于1e-5的作為潛在的候選RIP序列。用ExPASy（htp://au.expasy.org）的 ComputepI /Mw計算蛋白質的等電點、分子量。用BLAST進行同源性對比，用MEGAX構建系統(tǒng)進化樹。氨基酸序列比對在Clustal Omega中完成。蛋白三維結構的預測在SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）完成。

2.3 引物設計

利用NCBI中的primer-blast工具，根據(jù)序列設計擴增產(chǎn)物和定量引物（表1）。

表1 所用引物序列

2.4 RNA提取及cDNA合成

根據(jù)福際生物生產(chǎn)的植物基因組DNA提取試劑盒和植物總RNA提取試劑盒說明書的要求分別提取DNA和RNA，隨后立即用Takara生產(chǎn)的反轉錄試劑盒根據(jù)說明書對總RNA進行反轉錄，合成的cDNA保存于-20℃冰箱。

2.5 PCR擴增與表達分析

分別以DNA和cDNA為模板，利用JcRIPII-F和JcRIPII-R擴增基因序列。將與預期大小一致的擴增產(chǎn)物送至生工生物公司測序。

為保證熒光定量引物的特異性，以DNA為模板進行PCR擴增后驗證。以麻瘋樹Actin基因作為內參基因，以保存的不同組織及溫度處理后的cDNA為模板，在熒光定量PCR儀進行實時熒光分析。按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（Vazyme）說明書進行RT-qPCR，相對表達量利用2-ΔΔCT方法進行分析。對于每種處理均使用三個技術重復和至少三個獨立的生物學重復。

3 結果與分析

3.1 JcRIPII基因克隆及氨基酸序列分析

在麻瘋樹基因組中找到一個可能編碼的II型RIP蛋白的基因LOC105637075，經(jīng)可變剪切有兩種可能的蛋白編碼產(chǎn)物，分別為NP_001295735.1和XP_020536135.1（圖1A），后者比前者多出了10個氨基酸，可能是因為前者的第1位和第11位都為甲硫氨酸，是可能的起碼密碼子，因此拼接時無法判斷哪個是真正的翻譯起始位置，于是將較長的蛋白做為主要研究對象，將較短的作為其亞型。

以麻瘋樹DNA和cDNA為模板，均能擴增出長度為1800bp左右的片段，并且測序結果片段的長度和序列一致，表明該基因的CDS區(qū)不具有內含子。根據(jù)這一基因所在物種、編碼蛋白的名稱和類型將其命名為JcRIPII（圖1B），其對應的理論蛋白含561個氨基酸，分子量為6.21kDa，等電點為6.18，為弱酸性蛋白。

圖1 麻瘋樹JcRIPII基因結構及擴增產(chǎn)物

3.2 JcRIPII基因編碼產(chǎn)物結構域分析

結構域預測結果顯示，JcRIPII基因編碼蛋白序列的N端54～247位氨基酸為A鏈RIP結構域，C端有兩個Ricin_B_lectin結構域（以下簡稱RBL結構域），分別位于309～429位和441～557位。利用SWISS-MODEL構建蛋白結構模型時比對到一致度和覆蓋長度最完整的模板是樟科的cinnamomin III，故將其作為模板預測JcRIPII的結構（圖2A）。N端未預測出結構的區(qū)域前43個氨基酸可能是信號肽區(qū)域。Cinnamomin III的A、B兩條鏈由Cys250-Cys289這兩個半胱氨酸形成的二硫鍵連接[5]，序列比對顯示在JcRIPII的相似位置處存在Cys288和Cys300，可能是它的A、B鏈間二硫鍵相連的位置，因此連接肽的位置應位于這兩個半胱氨酸之間。

JcRIPIIA鏈的6個β-折疊和2個α-螺旋的位置與cinnamomin III相似。RIP結構域中通常含有5個對于N-糖苷酶活性發(fā)揮至關重要的殘基位點，在JcRIPII中對應于ricin極性親水的氨基酸Tyr80的Tyr117被替換成非極性氨基酸Gly117（圖2B），其他活性位點均保守。在ricin中Tyr80的羥基被認為可與Gly121的羰基氧原子形成氫鍵，從而旋轉形成容納腺嘌呤的空間，因此JcRIPII這一位點的改變可能會降低JcRIPII的N-糖苷酶活性[6,7]。

JcRIPII的B鏈中由兩個同源的球狀結構域組成，每個結構域包括α、β和γ三個亞基，與ricin B鏈的結構非常相似。首先，在JcRIPII的B鏈含有9個半胱氨酸，除Cys491外的8個半胱氨酸與ricin的分布十分相似。在ricin中，這些半胱氨酸被認為形成4個二硫鍵，起著穩(wěn)定結構的作用[8]。同ricin一樣，JcRIPII B鏈的疏水核心的氨基酸高度保守[9]（圖2C），每個亞基中都含有QxW重復基序，只在JcRIPII中1γ亞基中表現(xiàn)為QxF[10]。不過個別氨基酸的變異值得注意，如與ricin相比1α中的Ile371被Leu354替代，1γ的Trp407被Phe429替代，2γ的Leu547被Met532替代，其中后兩處是不同性質氨基酸的替代，這些變化可能對凝集素的活性造成影響。Ricin和cinnamomin屬于半乳糖型凝集素，這些II型RIP B鏈的六個亞基中僅有兩個亞基（1α和2γ）顯示出凝集素活性，都是依靠五個氨基酸發(fā)揮半乳糖結合作用[11]。在JcRIPII的B鏈1α和2γ的半乳糖結合位點與ricin相比存在兩處氨基酸的替換，其中2γ中Trp547取代了Tyr562，1α中His332取代了Gln349。在前一位置兩者都是芳香族氨基酸，變可能不會造成結合活性方面根本性的改變。但是，后一位置的變化引入了正電荷，其對凝集素活性的可能影響值得關注。

3.3 JcRIPII基因編碼產(chǎn)物同源性分析

利用BLAST在線工具查找與JcRIPII同源性較高的蛋白序列，結果顯示它與棕櫚科植物油棕、椰子以及山茶科的茶中的同源物具有50%以上的一致性（51.05%～54.8%）。其次是來自樟科的香樟和沉水樟的多條RIPs序列，其中有代表性的是已獲得晶體結構的cinnamomin III。與同為大戟科的蓖麻中的II型RIP一致度最高為47.19%。選取與麻瘋樹一致度最高的序列構建NJ樹（圖3A），系統(tǒng)發(fā)育樹的結果與序列一致度的結果相似，未表現(xiàn)出明顯的單雙子葉或同一科聚類偏好的現(xiàn)象。大戟科植物油桐、橡膠樹、蓖麻與禾本科植物疣粒稻中的II型RIP形成一個進化樹分枝，而與JcRIPII關系較遠。

為探究RIP中典型RIP結構域的進化歷程，我們利用JcRIPII和II型RIP及兩條來自麻瘋樹I型RIP的RIP結構域部分建構了系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3B）。結果顯示，僅從RIP結構域序列來看，JcRIPII與同科植物II型RIP的進化關系比與同種植物I型RIP的進化關系更近。具體來說，麻瘋樹的JcRIPII和同科植物油桐及橡膠樹中的II型RIP的RIP結構域序列聚類于相鄰的進化分枝上，但是麻瘋樹中的I型和II型RIP含有的RIP結構域序列在進化樹上距離相對較遠。值得注意的是，JcRIPII并不是與所有同科的II型RIP都緊密相鄰，它與來自蓖麻的II型RIP在進化樹上距離就較遠。同時，RIP結構域的NJ樹中依然體現(xiàn)了JcRIPII與來自油棕、椰子和茶的RIP結構域較近的進化關系，它們與JcRIPII的距離僅次于兩條同科植物的II型RIP。

同時為研究II型B鏈之間的進化關系，利用B鏈中保守的RBL結構域區(qū)序列構建了NJ樹（圖3C）。此時來自麻瘋樹的JcRIPII和同科植物蓖麻的II型RIP表現(xiàn)出較近的進化關系，與油桐和橡膠樹II型RIP形成的分枝關系較遠。

3.4 JcRIPII上游調控元件預測分析

順式作用元件預測結果顯示JcRIPII起始密碼子上游的啟動子區(qū)中含有多種脅迫響應和光調節(jié)有關的元件（表2）。脅迫響應元件包括在植物創(chuàng)傷誘導元件，此外還含有干旱、厭氧、創(chuàng)傷誘導元件，表明JcRIPII可能在逆境調控中發(fā)揮作用。但是沒有發(fā)現(xiàn)與溫度脅迫相關的響應元件，如HSE和LTRE等。

表2 JcRIPII上游順式作用元件預測分析

3.5 JcRIPII的表達模式初步研究

利用實時熒光定量PCR技術對JcRIPII在麻瘋樹各組織中的表達情況進行分析（圖4A）。發(fā)現(xiàn)除幼嫩的第一片真葉外，其他組織器官中JcRIPII基因均有表達，其中在成熟種子胚乳中表達量最高，然后依次是側根、子葉、主根、葉柄、莖，在幼嫩的真葉中未檢測到其轉錄產(chǎn)物。

圖4 JcRIPII基因表達

在干旱脅迫下，麻瘋樹葉和根中JcRIPII基因表達趨勢總體相似，即隨著脅迫的進行JcRIPII基因表達量逐漸下降，在第2天下降到最低，隨后逐漸上調。但是JcRIPII基因在兩個組織的表達也存在一定的差異。首先，在前2天JcRIPII基因表達量下調更顯著。同時，葉中的JcRIPII基因在第7天時表達量相對于第4天上調，恢復到處理前的水平，但是根在第7天時表達量相對于第4天下調，僅為對照組中的0.4倍。

4 結語

研究表明毒麻瘋樹中存在凝集素[12]。同源比對顯示，JcRIPII的B鏈為RBL結構域，也屬于凝集素家族，但是關于麻瘋樹中凝集素蛋白的核酸及序列信息尚未見報道。在本研究中，我們首次對麻瘋樹基因組中鑒定到的一個II型核糖體失活蛋白基因JcRIPII，基于現(xiàn)有的生物信息學工具對其可能編碼的蛋白序列和結構進行了分析，并對其表達模式進行了研究。

JcRIPII蛋白與ricin等II型RIP在三維結構結構和N-糖苷酶活性位點存在相似性，差異主要體現(xiàn)在數(shù)個重要氨基酸位點的改變。如A鏈中對于N-糖苷酶活性至關重要的Tyr117被非極性氨基酸Gly117替換，這一替換對蛋白活性的影響是不確定的。例如將SLT-IA中的Tyr77突變?yōu)镾er后活性降低1000倍，突變?yōu)镻he后活性降低15倍，但是ricin中Tyr80突變?yōu)镻he其活性不發(fā)生改變[13,14]。B鏈中1α和2γ這兩個發(fā)揮凝集素活性的亞基中也有氨基酸的替換，在cinnamomin的2γ亞基中也存在一個相同的變化（His575替代了ricin中的Gln570），并且相關研究表明這是其活性較低ricin低的重要原因[15,16]，因此這一變化可能也會降低JcRIPII的毒性。

為探究JcRIPII基因的進化方式，利用完整的II型RIP蛋白序列構建了系統(tǒng)發(fā)育樹，其中麻瘋樹JcRIPII并沒有與其他大戟科中的序列表現(xiàn)出較近的親緣關系，表明JcRIPII可能存在不同于大戟科其它II型RIP如ricin的進化起源。為探究這一現(xiàn)象是否可能是由于RIP和凝集素結構域進化之間的明顯差異所致，所以我們分別對這兩個結構域區(qū)的序列進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。已有研究表明，大戟科中的I型RIP由原始的I型RIP進化而來，與RBL結構域融合形成II型RIP，部分II型RIP凝集素結構域的缺失重新變成I型RIP[17]。在RBL結構域構建的進化樹，蓖麻中的II型RIP的B鏈序列位于麻瘋樹和茶等多種植物構成的分枝外側，與JcRIPII距離較近，表明這一分枝上的II型RIP可能是源于自身I型RIP和蓖麻中凝集素基因的融合。在RIP結構域構建的進化樹中，JcRIPII與海桐、橡膠樹II型RIP構成的分枝和麻瘋樹中的I型RIP相近而不相鄰，與蓖麻中II型RIP在進化樹上關系更遠，中間甚至混合了來自單子葉植物的RIP。這種鑲嵌分布反映了RIP結構域復雜的進化方式，RIP的起源應該較早，至少早于單雙子葉植物分化以前。綜上，JcRIPII與樟科、山茶科、棕櫚科較近的親緣關系是因為它們B鏈中的凝集素結構域可能都是源于蓖麻，A鏈中起源較早的RIP在進化的過程中經(jīng)歷了多種進化方式，造成了同科、同種植物中RIP結構域的差異。

組織表達的結果顯示JcRIPII基因在胚乳中具有相對較高的表達量，與ricin等在種子高表達特點具有統(tǒng)一性[18]。同時JcRIPII基因在側根中具有比主根更高的表達，增加側根是植物抵御干旱的生理機制的主要器官，結合JcRIPII基因上游啟動子區(qū)中存在的干旱脅迫相關順式調控元件，表明JcRIPII基因可能也在干旱脅迫中發(fā)揮作用[19]。I型RIP基因的表達在干旱或聚乙二醇處理下往往上調，許多Ricin_B蛋白在逆境脅迫下也是誘導表達，而JcRIPII基因隨干旱時間的延長先下調再上調，表現(xiàn)出一定的特異性，后續(xù)還需要進行更多的研究來闡明JcRIPII的作用方式[20,21]。