王歡 丁海濤 舒駿 王瑞茵 齊蕊涵 史榕荇 楊帆 唐學(xué)章

摘要 目的：測定舒筋活絡(luò)方（SHC）對骨關(guān)節(jié)炎（OA）患者滑膜成纖維細(xì)胞（FLS）增殖、遷移、侵襲的影響，明確其作用機(jī)制。方法：對膠原酶法分離培養(yǎng)的FLS進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，通過MTT比色法、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)、ELISA法等技術(shù)測定SHC對FLS增殖、遷移、侵襲等的影響。結(jié)果：體外分離的FLS生長狀態(tài)良好，具備成纖維細(xì)胞形態(tài)特性;所選藥物濃度范圍對FLS增殖影響較小，與空白組比較，較高濃度和低濃度的SHC對FLS增殖的影響差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），F(xiàn)LS的增殖與SHC呈濃度依賴性;鏡下觀察到OA-FLS的遷移現(xiàn)象，其中，模型組48 h、72 h的遷移率與0 h時(shí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），SHC組72 h的遷移率與0 h時(shí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），與模型組比較，48 h、72 h時(shí)，SHC組FLS遷移能力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;SHC組FLS侵襲穿過小室膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)較空白組明顯減少（P<0.05）;SHC各濃度組均對MMP3的釋放有不同程度的抑制作用（P<0.05）。結(jié)論：SHC調(diào)節(jié)FLS增殖、抑制FLS的遷移和侵襲，維護(hù)和修復(fù)OA患者關(guān)節(jié)內(nèi)組織完整性，為OA的關(guān)節(jié)保護(hù)提供新的預(yù)防和治療策略。

關(guān)鍵詞 舒筋活絡(luò)方;中藥復(fù)方制劑;增殖;遷移;侵襲;滑膜成纖維細(xì)胞;骨關(guān)節(jié)炎;滑膜

Effects of Shujin Huoluo Formula on the Proliferation，Migration and Invasion

of Fibroblast-like Synovicytes in Osteoarthritis

WANG Huan1，DING Haitao1，SHU Jun1，WANG Ruiyin2，QI Ruihan2，SHI Rongxing1，YANG Fan1，TANG Xuezhang1

（1 China-Japan Friendship Hospital，Beijing 100029，China; 2 Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）

Abstract Objective：To determine the effects of Shujin Huoluo Formula（SHC） on the proliferation，migration and invasion of fibroblast-like synovicytes（FLSs） in patients with osteoarthritis（OA），and to further clarify the mechanism of its action in the treatment of OA.Methods：the FLSs isolated and cultured by collagenase were observed morphologically，and the effects of SHC on FLSs proliferation，migration and invasion were determined by MTT colorimetry，scratch assay，Transwell assay and ELISA assay.Results：The FLS isolated in vitro has a good growth status and possesses the morphological characteristics of fibroblasts; the selected drug concentration range had little effect on the proliferation of FLS.Compared with the blank group，higher and lower concentrations of SHC have statistical effects on the proliferation of FLS of higher and lower concentration（P<0.05）.The proliferation of FLS was concentration-dependent with SHC; the migration of OA-FLS can be observed under the microscope，and its migration speed was slower.The migration rate of 48 h and 72 h in the control group was statistically significant compared with 0 h（P<0.05），the 72 h migration rate of the SHC group was statistically significant compared with 0 h（P<0.05）.Compared with the control group，the difference in FLS migration ability of the SHC group at 48 h and 72 h was statistically significant（P<0.05）; The number of cells that FLS invaded and penetrated the compartment membrane in the SHC group was significantly less than that in the blank group（P<0.05）; each concentration group of SHC inhibited the release of MMP3 to varying degrees（P<0.05）.Conclusion：SHC regulates FLS proliferation，inhibits the migration and invasion of FLS，maintains and repairs the integrity of the tissue in the OA joint，and provides new prevention and treatment strategies for the joint protection of OA.

Keywords Shujin Huoluo Formula; Chinese medicine compound preparation; Proliferation; Migration; Invasion; Fibroblast-like synovicytes; Osteoarthritis; Synovial

中圖分類號：R289.5;R684文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.017

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是一種與關(guān)節(jié)破壞相關(guān)的慢性退行性疾病[1]，滑膜組織病變是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨降解和關(guān)節(jié)破壞的中心環(huán)節(jié)[2]。滑膜成纖維細(xì)胞（Fibroblast-like Synovicyte，F(xiàn)LS）參與著關(guān)節(jié)內(nèi)免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)的生理和病理過程[3]。FLS的活化特征主要表現(xiàn)為異常增殖[4]，然而，炎性的FLS類似于癌癥細(xì)胞的遷移性和侵襲性，作為另一典型特征也可能導(dǎo)致滑膜組織的增生，加速OA進(jìn)程[4-5]。以往對FLS增殖的研究多集中在以滑膜炎癥為主要病理改變的類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid Arthritis，RA）中[6-8]，忽略了OA中FLS不平衡的增殖和凋亡，以及向附近軟骨遷移和侵襲導(dǎo)致的軟骨侵蝕和關(guān)節(jié)破壞。對FLS增殖、遷移和侵襲的評估無疑是有意義的。目前，大多數(shù)臨床治療未針對FLS的此種特性在OA發(fā)病機(jī)制中的作用展開，未來更多的保護(hù)療法將應(yīng)用于抑制FLS的增殖和向未受影響的組織遷移和侵襲。

舒筋活絡(luò)方（Shujin Huoluo Compound，SHC）是中華中醫(yī)藥學(xué)會疼痛分會主任委員唐學(xué)章教授臨床治療OA的經(jīng)驗(yàn)效方，前期研究證明，SHC可參與機(jī)體的固有免疫反應(yīng)，有效地抑制炎癥介質(zhì)釋放，并在誘導(dǎo)FLS凋亡和異常增殖中有確切作用[9]。我們將對SHC對OA的FLS增殖、遷移、侵襲的影響進(jìn)行測定，進(jìn)一步明確其治療OA的作用機(jī)制，為OA患者的關(guān)節(jié)保護(hù)提供新的預(yù)防和治療策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 供FLS細(xì)胞分離的滑膜組織采集于中日友好醫(yī)院骨關(guān)節(jié)中心確診為OA的志愿者，診斷符合2018年中華醫(yī)學(xué)會骨科分會修訂的OA診斷標(biāo)準(zhǔn)，在膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)過程中，將膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)增生的滑膜組織剔除，收集于裝有預(yù)冷儲存液的容器中低溫條件下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室。

在超凈臺內(nèi)將取回的新鮮滑膜組織反復(fù)沖洗，用眼科剪剔凈脂肪后剪成小塊，膠原酶消化后篩網(wǎng)過濾，所得滑膜細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)3～4代后備用[10]。

1.1.2 藥物 SHC中藥材由中日友好醫(yī)院中藥房提供，質(zhì)檢合格，水煎全方后經(jīng)過濾、旋蒸水提、超低溫凍干等技術(shù)制備成儲備顆粒供試。

1.1.3 試劑與儀器 Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT）（Sigma，美國，貨號：88417-250MG）、dimethyl sulfoxide（DMSO）（Sigma，美國，貨號：D8418-100ML）、結(jié)晶紫溶液（Sigma，美國，貨號：62105-50ML），基質(zhì)金屬蛋白酶3（Matrixmetalloproteinase3，MMP3）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay，ELISA）試劑盒（Abcam，美國，貨號：ab189572-1 x 96 tests）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，美國，貨號：3599），Transwell細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，美國，貨號：3470）。

1.2 方法

1.2.1 檢測指標(biāo)與方法

1.2.1.1 MTT比色法測定SHC對FLS增殖的影響? 在提前1 d接種好FLS的96孔板中以800 μg/mL為初始濃度，1：3配制成6個(gè)濃度的稀釋液，分別標(biāo)記為濃度1至濃度6，與作為對照的含完全培養(yǎng)基的空白組一起加入細(xì)胞培養(yǎng)板孔內(nèi)，37 ℃恒溫5%CO2培養(yǎng)箱中干預(yù)24 h，以磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗各孔中殘留藥液，加入5%MTT溶液繼續(xù)溫育4 h，將各孔中液體吸棄，倒扣培養(yǎng)板用濾紙小心吸去殘留液體，加入DMSO搖床震蕩，待甲瓚結(jié)晶充分溶解后，酶聯(lián)免疫檢測儀492 nm波長下測定各孔吸光值（OD值）。計(jì)算FLS的生長抑制率（Inhibition Rate，IR）和成活分?jǐn)?shù)（Survival Fraction，SF）以反映各供試濃度的SHC對FLS增殖情況的影響，具體公式為：IR（%）=（OD空白-ODSHC）/OD空白×100;SF（%）=ODSHC/OD空白×100。

1.2.1.2 劃痕實(shí)驗(yàn)測定SHC對FLS遷移的影響?? 將FLS接種于畫好平行線的6孔板內(nèi)，密度約為80%，饑餓（無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)）24 h后，用20 μL的滅菌槍頭沿之前畫好的平行線制造劃痕，用PBS溶液清洗3次，吸棄脫落細(xì)胞，加入無血清培養(yǎng)基配制的SHC稀釋液（濃度為800 μg/mL），另設(shè)空白組加入無血清培養(yǎng)基與之對照，每組分別設(shè)3個(gè)復(fù)孔。分別在倒置顯微鏡下觀察0、24、48、72 h劃痕區(qū)FLS遷移情況，采用Image J軟件對每個(gè)鏡下視野的FLS遷移后的劃痕寬度和劃痕面積，遷移率以遷移后劃痕面積占初始劃痕面積的百分比進(jìn)行計(jì)算。

1.2.1.3 Transwell實(shí)驗(yàn)測定SHC對FLS侵襲的影響 將饑餓培養(yǎng)后的FLS接種子包好Matrigel（5 mg/mL）的Transwell小室的上室，觀察組以無血清培養(yǎng)基配制的SHC稀釋液（濃度為800 μg/mL）培養(yǎng)，下室加入含同濃度SHC稀釋液的完全培養(yǎng)基，空白組為不含SHC藥液的Transwell小室，同時(shí)針對觀察組和空白組，分別設(shè)置上下室均不含血清的模型組。將上下室裝好，置于37 ℃恒溫5%CO2培養(yǎng)箱中共同培養(yǎng)24 h，吸棄小室中液體，以PBS溶液清洗小室中殘留藥液，棉簽擦掉上室中未穿過聚碳酯膜的細(xì)胞，甲醇固定30 min后，將小室倒扣風(fēng)干，0.1%結(jié)晶紫染色20 min，選于倒置顯微鏡下觀察和細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.1.4 ELISA法測定MMP3含量 根據(jù)實(shí)驗(yàn)1.2.1.1中MTT比色法檢測結(jié)果，設(shè)置觀察組為：SHC高濃度組（LPS 1 μg/mL+800 μg/mL）、SHC中濃度組（LPS 1 μg/mL+400 μg/mL）、SHC低濃度組（LPS 1 μg/mL+200 μg/mL），另外，設(shè)置模型組（LPS 1 μg/mL）和空白組（完全培養(yǎng)基），各組藥液均以完全培養(yǎng)基配制。溫育24 h后取各組的上清液，離心沉淀細(xì)胞碎片，收集各組EP管中的上清液，按ELISA試劑盒的操作說明書檢測各樣本中MMP3的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件對其進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，上述實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FLS形態(tài)學(xué)觀察 體外分離所得的滑膜細(xì)胞約在10 h后完成貼壁，3～4代后，A型細(xì)胞即滑膜巨噬細(xì)胞的數(shù)量逐漸減少，由此獲得了純度較高的滑膜細(xì)胞的主要效應(yīng)細(xì)胞B型細(xì)胞，即FLS。前期研究鑒定此方法分離培養(yǎng)的FLS純度>95%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。在×100倒置顯微鏡視野下，可見FLS遍布視野，增殖分裂旺盛，呈極向旋渦狀分布，有簇狀聚集的細(xì)胞集落。見圖1?！?00倒置顯微鏡視野下，可觀察到FLS貼壁良好，具備成纖維細(xì)胞形態(tài)特性，細(xì)胞體積均較大，具有生長突，呈長梭形、紡錘形，偶見星形、多角形，包質(zhì)豐富，折光性好，胞核呈卵圓形，位于細(xì)胞中央。見圖1。

2.2 SHC對FLS增殖的影響 在前期研究中，我們對2 mg至1 μg濃度范圍的SHC對FLS細(xì)胞活性的影響做了大區(qū)間的整體篩選。為了有利于后續(xù)試驗(yàn)，本研究選取了對FLS生長影響較小的濃度范圍進(jìn)行進(jìn)一步的測定。在所選的SHC濃度區(qū)間中，隨SHC濃度逐漸降低，IR逐漸升高，SF逐漸降低，F(xiàn)LS增殖由促進(jìn)逐漸轉(zhuǎn)向抑制，呈規(guī)律的濃度依賴性;與空白組比較，當(dāng)SHC濃度為800～50和0.781 μg/mL時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;但從各組均值來看，各濃度對FLS的增殖影響程度均較輕，IR在-27.034%～11.549%范圍內(nèi)，SF在127.034%～88.451%范圍內(nèi)，IR和SF均未大幅度偏離空白組，變化趨勢較平緩，結(jié)合之前對差異濃度SHC影響FLS炎癥介質(zhì)釋放等實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們在此濃度區(qū)間選取后續(xù)實(shí)驗(yàn)的藥物干預(yù)濃度。見圖2～3、表1。

2.3 SHC對FLS遷移的影響 在倒置顯微鏡下，模型組和SHC組0 h時(shí)與同組的其他時(shí)間點(diǎn)比較，劃痕寬度最大，劃痕帶較均勻，帶內(nèi)無細(xì)胞分布，邊緣細(xì)胞排列均較緊密，劃痕邊界較清晰;隨著時(shí)間的推移，有FLS遷移入原劃痕內(nèi)，劃痕逐漸變窄，粗細(xì)不均，邊界逐漸模糊，劃痕面積逐漸縮小。模型組48 h、72 h的遷移率與0 h時(shí)比較，差異有統(tǒng)計(jì)意義（P<0.05），SHC組72 h的遷移率與0 h比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;與模型組比較，SHC組遷移能力較弱，48、72 h時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），說明SHC在一定程度上抑制了FLS的遷移。結(jié)果見圖4～6、表2。

2.4 SHC對FLS侵襲的影響 與只含培養(yǎng)基的空白組（圖7Aa）比較，SHC干預(yù)下的觀察組（圖7Ba）FLS穿過小室膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)明顯減少，F(xiàn)LS的透膜侵襲能力被SHC明顯抑制（P<0.05）;而下室不含血清的培養(yǎng)基對FLS的侵襲基本無誘導(dǎo)力，空白組的模型組（圖7Ab）和觀察組的模型組（圖7Bb）均基本觀察不到完整的細(xì)胞穿過小室膜。見圖7。

2.5 SHC對MMP3釋放的影響 在用ELISA法對受試各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的MMP3測定結(jié)果可見，由LPS誘導(dǎo)的模型組的MMP3釋放量比較空白組顯著升高（P<0.05），F(xiàn)LS活化成功;與模型組比較，SHC各濃度組均對MMP3的釋放有不同程度的抑制作用（P<0.05），隨SHC濃度升高，抑制作用逐漸增強(qiáng)，其中，SHC高濃度組對MMP3釋放的抑制作用最強(qiáng)。見表3、圖8。

3 討論

OA是一種以慢性的炎癥反應(yīng)和進(jìn)展性的關(guān)節(jié)受損為主要病理特征的退行性骨關(guān)節(jié)病，主要累及以膝關(guān)節(jié)為主的負(fù)重關(guān)節(jié)，隨著病程進(jìn)展，可由單一關(guān)節(jié)發(fā)展至多關(guān)節(jié)[11-13]。在多種致病途徑中，滑膜組織中以B細(xì)胞、T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和FLS等不同細(xì)胞群誘導(dǎo)關(guān)節(jié)產(chǎn)生的異常免疫、慢性炎癥和滑膜增生現(xiàn)象是OA進(jìn)展和持續(xù)不愈的主要因素[14-15]，其中，以占滑膜細(xì)胞總數(shù)最多的FLS作為滑膜生理、病理變化的主要效應(yīng)細(xì)胞，附著、侵襲和降解關(guān)節(jié)軟骨和骨骼[16]。FLS活化的特征主要見于關(guān)節(jié)滑膜組織在本病中具有的多層性和增生性，不僅反映了不平衡細(xì)胞的增殖和凋亡，還包括向襯里層直接接觸的關(guān)節(jié)軟骨組織和較遠(yuǎn)處暴露的軟骨和骨骼的遷移和侵襲[17]。這種侵襲性的行為類似于淋巴細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)已被證實(shí)，這種特征性的細(xì)胞——FLS在RA患者的關(guān)節(jié)內(nèi)通過循環(huán)體液或細(xì)胞因子等招募更多的RA-FLS到新的軟骨侵蝕部位，導(dǎo)致疾病的不斷進(jìn)展[18-19]。OA滑膜的炎癥反應(yīng)和增殖程度較均低于RA[20]，在以往的研究中，滑膜組織對OA進(jìn)展的重要性易被忽視，也無關(guān)于FLS侵襲關(guān)節(jié)軟骨的系統(tǒng)性報(bào)道，但不可否認(rèn)，激活的OA-FLS同樣具有上述特性，在OA患者慢性、漸進(jìn)性的損傷關(guān)節(jié)中起著重要作用。

細(xì)胞遷移是包括傷口愈合在內(nèi)的生理和病理過程的核心，傷口治療、免疫防御，以及基質(zhì)重塑和器官穩(wěn)態(tài)均需要數(shù)種細(xì)胞的遷移以維持體內(nèi)平衡[21]。這些細(xì)胞具有遷移潛能，能從組織局部遷移到受損組織的固定部位，參與免疫反應(yīng)以及細(xì)胞所在區(qū)域的傷口愈合和組織修復(fù)。成纖維細(xì)胞是傷口愈合的主要細(xì)胞類型，其存在于身體大部分的器官與組織內(nèi)[22]，在OA中，F(xiàn)LS是構(gòu)成患者關(guān)節(jié)滑膜組織的主要細(xì)胞，影響著軟骨降解和關(guān)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)。對此類細(xì)胞進(jìn)行去除以達(dá)到關(guān)節(jié)保護(hù)的治療策略顯然是不可行的，基于這一問題，我們提出對FLS在OA中的增殖、遷移、侵襲等屬性進(jìn)行系統(tǒng)評估，并針對上述各個(gè)病理過程予以合理的干預(yù)治療。

SHC是一種專利保護(hù)下的中藥復(fù)方制劑（專利號：202010700833.4），由唐學(xué)章教授及其團(tuán)隊(duì)結(jié)合中藥方劑的現(xiàn)代配伍與制劑工藝研發(fā)而成，配伍精良、療效顯著，臨證時(shí)發(fā)現(xiàn)其有舒筋活血、活絡(luò)止痛的功效，在本研究中，以FLS侵襲為主要方向，對其治療OA的機(jī)制做了新的拓展。結(jié)果顯示，在MTT實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)LS增殖與SHC呈濃度依賴性，在本實(shí)驗(yàn)所選濃度區(qū)間中，SHC對FLS生長IR和SF影響趨勢平緩，在此濃度范圍選取的藥物干預(yù)濃度有利于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行;在劃痕實(shí)驗(yàn)中，OA-FLS需要比文獻(xiàn)記載中RA-FLS更長的遷移時(shí)間，在各觀察時(shí)間點(diǎn)中，SHC均不同程度抑制FLS遷移;在Transwell實(shí)驗(yàn)中，OA-FLS能穿透transwell膠質(zhì)室膜侵襲入下室，而SHC可顯著降低FLS的侵襲能力;在ELISA實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步證實(shí)了上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，F(xiàn)LS可在侵襲位點(diǎn)分泌大量與軟骨細(xì)胞外基質(zhì)降解相關(guān)的MMPs，MMP3為其中一類特異性MMP，與細(xì)胞的遷移和侵襲密切相關(guān)，本研究各濃度的SHC均能控制被LPS激活的OA滑膜炎癥反應(yīng)產(chǎn)生的MMP3釋放，從而減輕關(guān)節(jié)破壞。

綜上所述，SHC能通過調(diào)節(jié)FLS增殖，抑制FLS病理性遷移、侵襲等，起到維護(hù)和修復(fù)OA關(guān)節(jié)內(nèi)組織完整性的作用，為OA患者的關(guān)節(jié)保護(hù)提供新的途徑，也為深入研究中藥復(fù)方制劑的作用機(jī)制提供了數(shù)據(jù)支撐。但本實(shí)驗(yàn)著重研究了SHC對FLS在關(guān)節(jié)腔內(nèi)局部、短距離遷移的作用，未來的研究可對其在體內(nèi)長距離的遷移途徑、間質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變等潛力給予更深入的探究，并注意FLS可能存在的類腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸機(jī)制。

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（2020-03-26收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81804214）;北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)資助項(xiàng)目（2018000052580G469）

作者簡介：王歡（1986.04—），女，博士，住院醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)藥防治退行性骨關(guān)節(jié)病，E-mail：pulongqi@126.com

通信作者：唐學(xué)章（1963.02—），男，主任醫(yī)師，推拿科主任，研究方向：推拿手法治療脊柱相關(guān)疾病，E-mail：tangxuezhang@126.com