賴(lài)琦 謝丹 劉樂(lè)玲 鄧韞潔 葉甜婧

摘要 目的：基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析“附子-白術(shù)”治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制。方法：利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)并結(jié)合文獻(xiàn)篩選附子和白術(shù)的活性成分，使用TCMSP及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)作用靶點(diǎn)，通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)收集乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療靶點(diǎn)，繪制韋恩圖獲取藥物疾病共同靶點(diǎn)，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，同時(shí)利用R軟件進(jìn)行基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）富集分析。結(jié)果：“附子-白術(shù)”通過(guò)25個(gè)活性成分作用于205個(gè)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移治療靶點(diǎn)。主要通過(guò)9種核心活性成分，作用于AKT1、IL6、MAPK3等30個(gè)核心靶點(diǎn)，調(diào)控雌激素、破骨細(xì)胞分化、PI3K-AKT、HIF-1、MAPK等信號(hào)通路，發(fā)揮治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用。結(jié)論：“附子-白術(shù)”通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路來(lái)調(diào)控乳腺腫瘤增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移并減輕骨破壞、骨痛。

關(guān)鍵詞 附子;白術(shù);乳腺癌骨轉(zhuǎn)移;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);中藥;靶點(diǎn);通路;機(jī)制

Analysis of the Mechanism of “Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” Medicine

on Bone Metastasis of Breast Cancer Based on Network Pharmacology

LAI Qi1，XIE Dan2，LIU Leling1，DENG Yunjie1，YE Tianjing1

（1 The First Clinical Medical College，Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510000，China;

2 The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine，Guangzhou 510000，China）

Abstract Objective：To analyze the mechanism of “Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” treatment of breast cancer bone metastasis based on network pharmacology.Methods：TCMSP database and literature were used to screen the active ingredients of Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae.TCMSP and Swiss Target Prediction database were used to predict the action target，and the therapeutic target of breast cancer bone metastasis was collected through GeneCards database.Venn diagram was draw to obtain the common target of drug disease，and Cytoscape 3.7.1 software was constructed to construct “drug-component-disease-Target” network.The STRING database was used to construct the protein interaction network，and the R software was used for GO and KEGG enrichment analysis.Results：“Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” acted on 205 breast cancer bone metastasis treatment targets through 25 active ingredients.It was mainly through 9 core active ingredients to act on 30 core targets such as AKT1，IL6，MAPK3，regulating signal pathways such as estrogen，osteoclast differentiation，PI3K-AKT，HIF-1，MAPK function etc.Conclusion：“Radix Aconiti Lateralis Preparata-Rhizoma Atractylodis Macrocephalae” regulates breast tumor proliferation，apoptosis，metastasis and relieves bone destruction and bone pain through multiple components，multiple targets，and multiple pathways.

Keywords Radix Aconiti Lateralis Preparata; Rhizoma Atractylodis Macrocephalae; Bone metastasis of breast cancer; Network pharmacology; Traditional Chinese medicine; Target; Pathway; Mechanism

中圖分類(lèi)號(hào)：R285;R273文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.15.015

乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤的首位[1]，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移在晚期乳腺癌中的發(fā)生率為65%～75%，而首發(fā)癥狀為骨轉(zhuǎn)移者占27%～50%，多為多發(fā)性溶骨性病變，常引起骨痛、骨損傷、骨相關(guān)事件影響患者生命質(zhì)量[2]，乳腺癌患者確診骨轉(zhuǎn)移后的5年生存率僅20%～30%[3]。目前，針對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的治療方法主要包括放療、化療、內(nèi)分泌治療、分子靶向治療、手術(shù)治療、雙膦酸鹽治療及鎮(zhèn)痛等支持療法[2]，但臨床療效較低，并發(fā)癥發(fā)生率較高，近年來(lái)，中醫(yī)藥治療乳腺癌的效果讓越來(lái)越多的患者對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥有了極大的信任，并且大多數(shù)患者都積極接受中醫(yī)藥治療[4-5]。

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移在中醫(yī)學(xué)屬“骨痹”“骨瘤”“骨蝕”范疇。《醫(yī)經(jīng)精義》曰“腎藏精，精生髓，髓生骨，故骨者腎之所合也”;《素問(wèn)·五臟生成篇》曰“腎之合骨也，其榮在發(fā)，其主脾也”;《景岳全書(shū)》曰“脾腎不足及虛弱失調(diào)之人，多有積聚之病”。中醫(yī)認(rèn)為腎為先天之本，主骨生髓，脾為后天之本，充養(yǎng)骨髓。相關(guān)文獻(xiàn)對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的中醫(yī)證型分布進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，毛丹等[6]對(duì)110例患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)虛寒凝證型最多;許秋琳等[7]對(duì)236例患者進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)肝腎陰虛證組合多（38.13%），其次為脾腎陽(yáng)虛證組合（35.17%）。因此脾腎陽(yáng)虛為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的重要病機(jī)，中醫(yī)治法以溫補(bǔ)脾腎為主。

附子辛、甘、大熱，入心、腎、脾經(jīng)，具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛等功效;白術(shù)苦、甘、溫，入脾、胃經(jīng)，具有健脾益氣、燥濕利水等功效。“附子-白術(shù)”是補(bǔ)火溫中的常用藥對(duì)，源于白術(shù)附子湯、附子理中丸、實(shí)脾飲、真武湯等，其中白術(shù)附子湯出自《金匱要略》是治療“骨痹”的代表方劑。臨床研究證實(shí)白術(shù)附子湯用于治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，在減輕疼痛、提高生命質(zhì)量方面具有一定優(yōu)勢(shì)，還可以緩解因口服阿片類(lèi)止痛藥物導(dǎo)致的便秘，且安全性高[8-10]?，F(xiàn)代藥理學(xué)通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明“附子-白術(shù)”是白術(shù)附子湯的核心藥物，并且其通過(guò)減少破骨細(xì)胞的數(shù)量并抑制其活性、下調(diào)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移組織中骨破壞因子、減少炎癥介質(zhì)并上調(diào)抑炎因子等發(fā)揮作用[11-15]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)能對(duì)藥物-組成-靶點(diǎn)-信號(hào)通路的復(fù)雜關(guān)系進(jìn)行分析，在現(xiàn)代藥理學(xué)研究的基礎(chǔ)上指導(dǎo)新藥研發(fā)和藥理作用研究的新興學(xué)科[16]。“附子-白術(shù)”對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的分子生物研究較多地停留在動(dòng)物指標(biāo)，因此我們采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)“附子-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的藥理機(jī)制進(jìn)行了系統(tǒng)探討，以期為該藥對(duì)在臨床使用及實(shí)驗(yàn)研究提供參考。

1 資料與方法

1.1 “附子-白術(shù)”藥對(duì)活性成分及作用靶點(diǎn)的獲取

在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//tcmspw.com/tcmsp.php），分別檢索附子、白術(shù)的成分，根據(jù)藥物吸收、分布、代謝及排泄特性，將口服生物利用度（OB）≥30%和類(lèi)藥性（DL）≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)[17]，滿足條件的作為活性成分，并結(jié)合文獻(xiàn)[18-19]補(bǔ)充藥對(duì)的活性成分。利用PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲取活性成分的SMILES表達(dá)式。通過(guò)TCMSP可檢索部分活性成分對(duì)應(yīng)的靶蛋白，利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.swisstargetprediction.ch/）檢索活性成分的SMILES式以補(bǔ)充藥物的靶蛋白，將兩數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)信息進(jìn)行整合去重。再將靶蛋白信息輸入U(xiǎn)niprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uni-prot.org/），限定物種為“Human”，使靶蛋白統(tǒng)一轉(zhuǎn)換為藥物作用的靶基因，即得到“附子-白術(shù)”藥對(duì)的作用靶點(diǎn)。

1.2 乳腺癌骨轉(zhuǎn)移治療靶點(diǎn)的獲取

使用GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）以“breast cancer with bone metastasis”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，獲得疾病治療靶點(diǎn)。

1.3 藥物與疾病共同靶點(diǎn)的篩選

在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺(tái)上分別錄入白術(shù)、附子與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，得到“藥物-疾病”的共同靶點(diǎn)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)模型的構(gòu)建及分析

將藥物活性成分、藥物與疾病的共同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape3.7.1軟件，構(gòu)建“藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，使用Network Analyzer對(duì)“附子-白術(shù)”的主要活性成分進(jìn)行分析。

1.5 構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖

將上述藥物-疾病共同靶點(diǎn)輸入到STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），限定物種為人類(lèi)，并選取minimum required interaction score>0.4，獲取PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)系數(shù)據(jù)，將其導(dǎo)入Cytoscape軟件，繪制PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.6 通路富集分析

在R軟件安裝Bioconductor軟件包“org.Hs.eg.db”并運(yùn)行，將藥物與疾病共同靶點(diǎn)轉(zhuǎn)換成entrezID。然后在R軟件安裝“clusterProfiler”包，根據(jù)已轉(zhuǎn)換的entrezID，以P<0.05，Q<0.05分析關(guān)鍵靶基因的功能與信號(hào)通路即基因本體（GO）富集分析和京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）功能富集分析，并將結(jié)果以條形圖形式輸出。

2 結(jié)果

2.1 “附子-白術(shù)”活性成分及作用靶點(diǎn)

從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得附子活性成分21個(gè)、白術(shù)活性成分7個(gè)，結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充納入白術(shù)中的白術(shù)內(nèi)酯（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）、蒼術(shù)酮、β-桉油醇、α-桉葉醇，附子中的烏頭堿、苯甲酰次烏頭原堿、烏頭原堿、宋果靈、易混翠雀花堿、尼奧靈、苯甲酰新烏頭原堿、9-去羥基森布星，最終獲得附子活性成分29個(gè)、白術(shù)活性成分13個(gè)，共42個(gè)。從TCMSP及Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(kù)獲得附子靶點(diǎn)152個(gè)、白術(shù)靶點(diǎn)176個(gè)，去除重復(fù)靶點(diǎn)，得到“附子-白術(shù)”作用靶點(diǎn)294個(gè)。見(jiàn)圖1。

2.2 “附子-白術(shù)”與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的共同靶點(diǎn)

在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，共獲得疾病靶點(diǎn)6 786個(gè)。輸入176個(gè)白術(shù)靶點(diǎn)、152個(gè)附子靶點(diǎn)、6 786個(gè)疾病靶點(diǎn)，繪制韋恩圖，取交集后獲得藥物-疾病共同靶點(diǎn)205個(gè)。見(jiàn)圖2。即“附子-白術(shù)”治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移靶點(diǎn)。

2.3 “藥物-成分-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析

將“附子-白術(shù)”中42個(gè)潛在活性成分與205個(gè)藥物與疾病相同靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape中，獲取“藥物-

成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖。見(jiàn)圖3。圖中紫色代表藥物，藍(lán)色代表中藥復(fù)方中的25種活性成分（17個(gè)活性成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)無(wú)交集，給予刪除），綠色代表205個(gè)共同靶點(diǎn)，紅色代表疾病，連線代表其相互關(guān)聯(lián)。并通過(guò)Network Analyzer工具分析網(wǎng)絡(luò)中活性成分的度值（Degree），度值越大說(shuō)明該活性成分與作用靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)個(gè)數(shù)越多，該成分越重要。結(jié)果顯示，每個(gè)活性成分平均與17.84個(gè)靶點(diǎn)互相作用，度值大于20的活性成分有9個(gè)，其中α-香樹(shù)精（Alpha-Amyrin）與53個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，α-桉葉醇（Alpha-Eudesmol）與50個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，準(zhǔn)噶爾烏頭堿（Songorine）與42個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，β-谷甾醇（3S，8S，9S，10R，13R，14S，17R）-10，13-dimethyl-17-[（2R，5S）-5-propan-2-yloctan-2-yl]-2，3，4，7，8，9，11，12，14，15，16，17-dodecahydro-1H-cyclopenta[a]phenanthren-3-ol）與39個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ（AtractylenolideⅡ）與35個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，苯甲酰新烏頭原堿（Benzoylhypaconine）與33個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，8β-乙氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（8beta-ethoxy atractylenolide Ⅲ）與29個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ（Atractylenolide Ⅲ）與26個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ（Atractylenolide Ⅰ）與21個(gè)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)，因此這9種活性成分可能是該藥對(duì)起到治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移作用的核心成分。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)與分析

將上述205個(gè)共同靶點(diǎn)輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，再導(dǎo)入Cytoscape軟件分析得到PPI網(wǎng)絡(luò)。見(jiàn)圖4。圖中圓形節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，連線代表靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的聯(lián)系，節(jié)點(diǎn)的大小、顏色及其深淺變化代表Degree值的大小，靶點(diǎn)Degree值越大表示該靶點(diǎn)與其他靶點(diǎn)的關(guān)聯(lián)性越強(qiáng)，并根據(jù)Degree值篩選出核心靶點(diǎn)。將Degree值前30作為核心靶點(diǎn)。見(jiàn)圖5。圖中縱坐標(biāo)代表靶點(diǎn)，橫坐標(biāo)表示Degree值。

2.5 通路富集分析

205個(gè)共同靶點(diǎn)經(jīng)R語(yǔ)言進(jìn)行GO和KEGG富集分析，將排前20的結(jié)果以條形圖輸出，圖中P值代表富集的顯著性，顏色越紅則顯著性越高。GO富集分析以生物學(xué)過(guò)程、細(xì)胞組分及分子功能為主。見(jiàn)圖6～8。其中，交集基因集合共富集至1 919條生物學(xué)過(guò)程通路中，主要包括調(diào)節(jié)循環(huán)系統(tǒng)血管管徑、激活蛋白激酶等;交集基因集合共富集至74條細(xì)胞組分表達(dá)過(guò)程中，主要涉及細(xì)胞膜的膜筏、突觸膜及神經(jīng)元細(xì)胞體等;交集基因集合共富集至183個(gè)與分子功能相關(guān)的過(guò)程中，主要涵蓋調(diào)控類(lèi)固醇激素受體、核受體、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)絲氨酸/蘇氨酸激酶活性并參與激素結(jié)合等。

KEGG功能富集共得到130條信號(hào)通路，前20的結(jié)果形成KEGG功能富集的條形圖。見(jiàn)圖9。結(jié)果顯示共同靶點(diǎn)主要富集于腫瘤、糖尿病等多種疾病，與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的通路主要有雌激素信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、PI3K-AKT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等。

3 討論

研究證實(shí)白術(shù)附子湯對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者療效確切且“附子-白術(shù)”是該方的核心藥物。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法對(duì)“附子-白術(shù)”治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的活性成分、作用靶點(diǎn)、相關(guān)生物信號(hào)通路進(jìn)行了探討。

3.1 “附子-白術(shù)”治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移核心活性成分分析

本研究獲得25個(gè)“附子-白術(shù)”治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的活性成分，并根據(jù)藥物、成分、疾病、靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖，計(jì)算活性成分度值，得到9種核心活性成分，依次為α-香樹(shù)精、α-桉葉醇、準(zhǔn)噶爾烏頭堿、β-谷甾醇、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、苯甲酰新烏頭原堿、8β-乙氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ。研究表明，苯甲酰新烏頭原堿不僅能誘導(dǎo)實(shí)體瘤凋亡如膠質(zhì)瘤、胃癌、肝癌等，還能促進(jìn)血液腫瘤凋亡[20-21]。準(zhǔn)噶爾烏頭堿屬于C-20二萜型附子生物堿，張亞平等[22]發(fā)現(xiàn)附子生物堿可減少小鼠乳腺癌發(fā)生率，延長(zhǎng)生存期，并改善體寒血瘀癥狀及缺血缺氧的指標(biāo)，降低血清中雌二醇和孕酮水平;丁薈霞[23]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)附子生物堿有抑制人胃癌細(xì)胞株增殖、降低侵襲力、誘導(dǎo)凋亡的作用并與多種化療藥物存在協(xié)同作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。白術(shù)發(fā)揮油是發(fā)揮抗癌作用的重要成分，α-香樹(shù)精、α-桉葉醇皆屬白術(shù)揮發(fā)油類(lèi)，研究表明其可加速癌細(xì)胞凋亡，減緩癌細(xì)胞增殖，增強(qiáng)對(duì)腫瘤的細(xì)胞毒性效應(yīng)，抑制向正常組織侵襲轉(zhuǎn)移能力等[24]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ、8-β-乙氧基白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ屬于內(nèi)酯類(lèi)物質(zhì)[25]，相關(guān)研究表明，白術(shù)內(nèi)酯類(lèi)可對(duì)多種癌細(xì)胞產(chǎn)生抗癌作用，包括乳腺癌MCF7細(xì)胞，白血病P-388、HL-60細(xì)胞，肝癌HepG2細(xì)胞，前列腺癌Dul45細(xì)胞，肺癌A549細(xì)胞，黑色素瘤A875、B16細(xì)胞，大腸癌Lovo細(xì)胞等[26-30]。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可通過(guò)抑制腫瘤壞死因子-α、一氧化氮、白細(xì)胞介素、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和胎盤(pán)生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生發(fā)揮抗炎作用，且白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ的作用強(qiáng)于白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ[31-32]。與此同時(shí)劉昳等[33]發(fā)現(xiàn)白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ可以顯著改善患者惡病質(zhì)。鑒于此，本研究認(rèn)為“附子-白術(shù)”是多種成分共同發(fā)揮作用。其中核心成分可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、降低腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移能力發(fā)揮抗乳腺癌骨轉(zhuǎn)移作用，通過(guò)抗炎作用減少骨痛，并且可改善患者生命質(zhì)量。

3.2 “附子-白術(shù)”治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移核心靶點(diǎn)分析

本研究依據(jù)PPI網(wǎng)絡(luò)，得到30個(gè)核心靶點(diǎn)，其中前5位依次為AKT1、IL6、MAPK3、VEGFA、MAPK1。AKT有3個(gè)家族成員AKT1、AKT2、AKT3，可通過(guò)PI3K被胞外激活，研究發(fā)現(xiàn)激活A(yù)KT1可促進(jìn)乳腺癌的增殖，但抑制AKT1功能會(huì)促進(jìn)腫瘤遷移能力[34-35]。炎癥介質(zhì)可影響惡性腫瘤骨轉(zhuǎn)移，其中白細(xì)胞介素-6（IL-6）在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖、抑制凋亡和刺激破骨細(xì)胞生成、抑制成骨細(xì)胞分化中具有重要作用[36]。研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移機(jī)制是癌細(xì)胞突破基膜侵入周?chē)|(zhì)，進(jìn)入脈管系統(tǒng)，在脈管系統(tǒng)中成活并逃避免疫監(jiān)視，并最終到達(dá)轉(zhuǎn)移部位[37]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGFA）有助于新生血管形成，因?yàn)槟[瘤新生血管的內(nèi)皮細(xì)胞之間沒(méi)有密切的連接且沒(méi)有被周細(xì)胞廣泛覆蓋，所以形成新生血管是癌細(xì)胞進(jìn)入脈管的主要方式[38]。MAPK1、MAPK3是一種絲裂素活化蛋白激酶，通過(guò)組成信號(hào)通路刺激相關(guān)因子調(diào)節(jié)參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移[39]。鑒于此，本研究認(rèn)為“附子-白術(shù)”是多靶點(diǎn)協(xié)同作用共同發(fā)揮抗乳腺癌骨轉(zhuǎn)移作用。

3.3 “附子-白術(shù)”治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移通路分析

本研究通過(guò)基因KEGG功能富集分析，獲得了雌激素信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化通路、PI3K-AKT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路等與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)的通路。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移溶骨性改變是腫瘤細(xì)胞激活破骨細(xì)胞分化通路所致，通過(guò)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL與破骨細(xì)胞前體細(xì)胞表面上的RANK受體結(jié)合促進(jìn)破骨細(xì)胞分化成熟;同時(shí)，成骨細(xì)胞可通過(guò)骨保護(hù)素OPG與RANKL競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，進(jìn)而抑制RANK-RANKL通路[40]。腫瘤細(xì)胞可分泌PTHrP促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL，并且破骨細(xì)胞破壞骨質(zhì)同時(shí)釋放骨基質(zhì)中的TGF-β，TGF-β反過(guò)來(lái)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生PTHrP，導(dǎo)致使骨質(zhì)破壞的“惡性循環(huán)”[41]。相關(guān)研究證實(shí)，附子白術(shù)湯和附子-白術(shù)藥對(duì)均可抑制TGFβ信號(hào)通路，減少PTHrP的表達(dá)，調(diào)節(jié)OPG/RANKL系統(tǒng)，減輕乳腺癌骨轉(zhuǎn)移裸鼠溶骨性損傷[12-14]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，雌激素信號(hào)通路可抑制MCF-7細(xì)中OPG表達(dá)，提高RANKL通路活性，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞的破骨作用[42]。PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白磷酸化增強(qiáng)是乳腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的重要分子機(jī)制之一[43]，并且袁翠堂等[44]研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號(hào)通路參與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移大鼠骨癌痛脊髓水平的調(diào)節(jié)。HIF-1信號(hào)通路是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的重要通路，其主要通過(guò)促使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧微環(huán)境;激活SNAIL1、SLUG和TWIST基因，下調(diào)上皮細(xì)胞鈣黏蛋白表達(dá)，使上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞能動(dòng)性;促進(jìn)膠原纖維的生物合成以及線性排列，為腫瘤細(xì)胞提供遷移途徑;激活L1CAM蛋白，增加對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附;誘導(dǎo)CXCR4表達(dá)，引導(dǎo)癌細(xì)胞附到骨組織;有利于骨原始細(xì)胞聚集并影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化及活性[45]。MAPK通路中的c-Jun氨基末端激酶參與細(xì)胞應(yīng)激與凋亡，p38激酶可調(diào)控炎癥反應(yīng)，細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶有利于細(xì)胞增殖，大絲裂原活化蛋白激酶可調(diào)節(jié)細(xì)胞周期[46]。目前研究發(fā)現(xiàn)阻斷ERK/P-38MAPK信號(hào)通路可抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移[47]。鑒于此，本研究認(rèn)為“附子-白術(shù)”通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞表達(dá)PTHrP和骨基質(zhì)細(xì)胞釋放TGF-β，以減少成骨細(xì)胞表達(dá)RANKL;并抑制雌激素信號(hào)通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞產(chǎn)生OPG，從而阻斷破骨細(xì)胞分化通路的惡性循環(huán)對(duì)骨組織的溶骨性破壞。“附子-白術(shù)”還通過(guò)抑制PI3K/AKT、HIF-1、MAPK信號(hào)通路阻止腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，抑制MAPK通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡，抑制PI3K/AKT信號(hào)通路減輕骨轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的骨痛。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，對(duì)“附子-白術(shù)”藥對(duì)的多成分、多靶點(diǎn)、多途徑與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移之間復(fù)雜網(wǎng)狀關(guān)系進(jìn)行研究，初步驗(yàn)證了“附子-白術(shù)”藥對(duì)治療乳腺癌的基本藥理學(xué)作用和相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步深入臨床與實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

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（2020-04-28收稿 責(zé)任編輯：楊覺(jué)雄）

基金項(xiàng)目：楊文輝廣東省名中醫(yī)傳承工作室建設(shè)項(xiàng)目（粵中醫(yī)辦函[2019]5號(hào)）

作者簡(jiǎn)介：賴(lài)琦（1995.01—），女，碩士研究生在讀，醫(yī)師，研究方向：中醫(yī)防治乳腺疾病，E-mail：353569894@qq.com

通信作者：謝丹（1976.07—），女，博士，主任醫(yī)師，研究生導(dǎo)師，研究方向：中醫(yī)防治乳腺疾病，E-mail：xie-dan@21cn.com