白軍朋， 李 斌， 張淑娟， 陳怡每

1. 北京農(nóng)業(yè)信息技術(shù)研究中心， 北京 100097 2. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)工學(xué)院， 山西 太谷 030801

引 言

喹諾酮類抗生素是一種重要抗生素， 常用于治療或預(yù)防人和動物的細胞感染[1]， 隨著抗生素的過度使用， 抗生素會殘留在人或動物體內(nèi)， 導(dǎo)致細菌的耐藥性增加。 殘留在動物源性食品中的抗生素會通過食物鏈直接進入人的體內(nèi)， 對人類的健康造成危害[2]。 食用產(chǎn)品中的抗生素殘留也逐漸成為消費者關(guān)注的食品安全問題[3]。 因此大量的動物源食品需要做抗生素殘留分析， 檢驗任務(wù)既繁重又時間緊迫。 當(dāng)前傳統(tǒng)的檢測方法主要有微生物學(xué)檢測方法[4]、 免疫分析法[5]， 這些方法特異性強、 靈敏度高， 但存在過程復(fù)雜、 耗時長、 有破壞性等缺點。 因此， 發(fā)展高效、 靈敏的抗生素殘留檢測方法對于保障國家的食品安全和人體健康具有重大意義。

太赫茲指的是頻率0.1～10 THz(1 THz=1012Hz)范圍內(nèi)的電磁輻射的統(tǒng)稱[6]， 通常也被稱為太赫茲輻射、 T射線等， 對應(yīng)的波長為0.3～3 mm、 波數(shù)在3.3～330 cm-1之間[7]。 由于其具有透射性、 安全性、 指紋性等的獨特的性質(zhì)， 可識別大分子物質(zhì)。 朱思源[8]等以四種常用青霉素為研究對象， 獲得其太赫茲光譜吸收曲線。 發(fā)現(xiàn)它們在一定的頻率范圍內(nèi)都存在明顯的光譜特性。 吉特[9]等采用太赫茲時域光譜技術(shù)對青霉胺進行研究， 發(fā)現(xiàn)該技術(shù)可以對青霉胺進行定量檢測。 Long等[10]將諾氟沙星在0～100%分了12個梯度， 測量純凈的諾氟沙星樣本發(fā)現(xiàn)在0.825和1.187 THz處存在兩個吸收峰， 并且逐步回歸選擇的變量結(jié)合特征峰的多元線性回歸預(yù)測模型最優(yōu)， 預(yù)測相關(guān)系數(shù)Rp達到了0.867。 這表明太赫茲時域光譜技術(shù)可以識別抗生素這種大分子物質(zhì)， 在定量測量方面也表現(xiàn)出了一定的潛力， 但是模型精度有待提高。 中國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 31650—2019)規(guī)定的喹諾酮抗菌類藥物在動物源性食品中的殘留限為0.01～1.9 μg·mL-1。 現(xiàn)有有關(guān)諾氟沙星太赫茲光譜檢測的文獻中涉及到濃度檢測的研究不足以滿足實際檢測需求， 不同濃度梯度間隔下的太赫茲光譜檢測分辨能力有待系統(tǒng)性的開展研究。

為此， 本研究探討了較全濃度的諾氟沙星含量預(yù)測建模方法， 分別設(shè)計了較大梯度諾氟沙星(濃度系列和梯度間隔均大于104μg·mL-1， 即1%)和較小梯度諾氟沙星(濃度系列和梯度間隔都小于100 μg·mL-1， 即0.01%)并展開了探索性檢測研究。 主要的研究內(nèi)容如圖1所示： 首先對濃度呈較大梯度間隔的諾氟沙星固體壓片進行檢測研究， 采集太赫茲光譜數(shù)據(jù)， 采用多種建模方法預(yù)測諾氟沙星含量， 嘗試在檢測準(zhǔn)確率方面得到提升； 其次對呈較小梯度間隔的諾氟沙星溶液樣本含量檢測的可行性進行探索， 嘗試用不同建模方法對諾氟沙星含量進行定量預(yù)測， 尋找較優(yōu)的定量檢測方法。 需要說明的是： 在制備呈較小梯度濃度間隔樣本時， 由于諾氟沙星固體顆粒在濃度小于5%(即5×104μg·mL-1)很難檢測， 無法滿足較小梯度樣本的制備要求， 并且其在水中的溶解度也有限， 本研究采用乙醇溶劑的諾氟沙星溶液殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(100 μg·mL-1)為母液進行較小梯度諾氟沙星制備研究， 為后續(xù)檢測限的探索提供研究基礎(chǔ)。

圖1 實驗流程圖Fig.1 Flowchart of the experimental process

1 實驗部分

1.1 試劑和材料

實驗所用的諾氟沙星(CAS 70458-96-7)從生物工程(上海)股份有限公司購買。 聚乙烯粉末(CAS 9002-88-4， 粒度40～48μm)購買于西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司。 用于較小梯度諾氟沙星樣本制備的標(biāo)準(zhǔn)溶液購買于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研檢測所(中國天津)， 是乙醇中諾氟沙星溶液殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GSB05-3338-2016)， 濃度為100 μg·mL-1， 規(guī)格是1 mL·支-1。 比色皿樣品池光程規(guī)格為0.2 mm。

1.2 樣本制備

1.2.1 較大梯度樣本的制備

稱取部分諾氟沙星和聚乙烯粉末在研缽中充分研磨之后用壓片機及其模具(Specac GS15011， 英國)壓片， 壓力大小是3.5 t， 壓片時間為3 min·片-1， 壓片直徑約13 mm， 厚度在1～2 mm之間， 樣本總質(zhì)量200 mg。 分別制備濃度5%， 15%， 25%， 35%， 45%， 55%， 65%， 75%， 85%， 95%和100%的壓片樣本， 為減少操作誤差， 每個含量的混合物樣品制備9個壓片， 共99個較大梯度樣本。 按2∶1劃分成校正集和預(yù)測集。

1.2.2 較小梯度樣本的制備

采用乙醇中諾氟沙星溶液殘留標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(GSB05-3338-2016)為母液， 稀釋得到29個小梯度濃度(0.001， 0.002， 0.004， 0.006， 0.008， 0.01， 0.02,0.04， 0.06， 0.08， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1， 2， 4， 6， 8， 10， 20， 30， 40， 50， 60， 70， 80和90 μg·mL-1)。 用移液槍移取少量的諾氟沙星乙醇溶液滴加到比色皿樣品池中即完成樣本制備， 依次完成所有樣本制作。 每個濃度制作9個樣本， 共261個較小梯度樣本， 按2∶1劃分成校正集和預(yù)測集。

1.3 太赫茲光譜測量

使用日本ADVANTEST公司生產(chǎn)的太赫茲時域光譜系統(tǒng)TAS7500SU， 使用透射工作模式。 中心波長為1 550 nm， 重復(fù)頻率為50 MHz， 脈沖寬度為50 fs， 光纖飛秒激光器的輸出功率為20 mW的。 可測量頻譜范圍為0.1～7 THz， 頻譜分辨率為7.6 GHz， 系統(tǒng)動態(tài)信號范圍在60 dB以上。 實驗環(huán)境溫度為25 ℃(±1 ℃)， 相對濕度低于3%。

將制備好的較大梯度壓片樣本和不同濃度的待測試較小梯度溶液樣本放入透射模式的樣品腔中， 依次完成所有樣本的太赫茲光譜測量。 每次測量前測量一次參考信號， 每個樣本測量一次光譜數(shù)據(jù)， 較大梯度的參考信號為空掃信號， 較小梯度的參考信號是空掃的比色皿樣品池信號。

1.4 參數(shù)提取與數(shù)據(jù)建模

時域信號在30 ps被截斷置零， 用以去除從襯底背面反射的信號。 對時域數(shù)據(jù)進行快速傅里葉變換(FFT)得到樣本的頻域光譜。 根據(jù)Dorney[11]和Duvillaret[12]等提出的方法計算各樣本的吸收系數(shù)。

卷積平滑(S-G)作為一種數(shù)字濾波器， 可以平滑數(shù)據(jù)并增加數(shù)據(jù)信噪比(SNR)。 對光譜數(shù)據(jù)進行S-G平滑， 以減少噪聲干擾和粒子散射。

逐步回歸通過一步步引入變量， 篩選剔除多余信息， 得到有效變量； 連續(xù)投影算法(SPA)[13]作為一種可以使矢量空間共線性最小化的前向變量選擇算法， 具有消除原始光譜矩陣中的冗余信息的優(yōu)勢， 可以篩選出有效的信息， 提取全頻段的幾個特征頻率。 多元線性回歸進行定量建模預(yù)測分析。 實驗數(shù)據(jù)處理與繪圖全部在Matlab R2018a和Origin 2017中完成。

1.5 模型評價

利用相關(guān)系數(shù)r、 校準(zhǔn)均方根誤差(RMSEC)和預(yù)測均方根誤差(RMSEP)來評價模型的性能。 其中相關(guān)系數(shù)r包含Rc(校正相關(guān)系數(shù))和Rp(預(yù)測相關(guān)系數(shù))。 預(yù)測諾氟沙星濃度模型中最理想的模型應(yīng)具有高的校準(zhǔn)相關(guān)系數(shù)(Rc)和預(yù)測相關(guān)系數(shù)(Rp)， 低的校準(zhǔn)均方根誤差(RMSEC)和預(yù)測相關(guān)系數(shù)(RMSEP)。 為保證模型的穩(wěn)定性， 還應(yīng)該保證RMSEC和RMSEP有較小的差異。

2 結(jié)果與討論

2.1 各樣品的太赫茲光譜吸收曲線及分析

2.1.1 較大梯度諾氟沙星測量結(jié)果

如圖2(a)所示是較大梯度諾氟沙星中不同濃度的樣本的吸收系數(shù)平均光譜， 因為低于0.4 THz和高于1.5 THz的信號信噪比(SNR)很低， 所以只選0.4～1.5 THz的數(shù)據(jù)進行后續(xù)建模分析。 本文發(fā)現(xiàn)純凈的諾氟沙星樣本在0.816和1.205 THz處有兩個吸收峰， 與Long等[10]檢測的0.825和1.187 THz及Redo-Sanchez等[14]檢測的0.79和1.19 THz相近。 一方面， 峰位輕微的移動可能是由樣品的顆粒大小引起的； 另一方面， 也可能因為諾氟沙星的種類差異和測量儀器不同造成了這種峰位的微小移動。 通過觀察吸收系數(shù)圖， 可以發(fā)現(xiàn)隨著諾氟沙星濃度的增加， 吸收系數(shù)增加， 并且峰值也變的更加明顯。 這說明諾氟沙星的吸收系數(shù)變化和濃度有直接關(guān)系。 但是在諾氟沙星濃度低于5%的時候， 很難發(fā)現(xiàn)吸收峰的存在， 原因可能是聚乙烯中諾氟沙星濃度較低的時候， 樣本對太赫茲光譜的吸收變少， 從而接收到的太赫茲時域光譜攜帶的信息量變少所致。

圖2 太赫茲吸收系數(shù)平均光譜(a)： 較大梯度諾氟沙星； (b)： 較小梯度諾氟沙星Fig.2 Average spectrum of terahertz absorption coefficient(a)： Larger gradient Norfloxacin； (b)： Smaller gradient Norfloxacin

2.1.2 較小梯度諾氟沙星測量結(jié)果

較小濃度諾氟沙星溶液樣本的吸收系數(shù)如圖2(b)所示， 不同濃度的諾氟沙星乙醇溶液的吸收系數(shù)曲線基本重合， 未表現(xiàn)出明顯差異。 可能是因為當(dāng)諾氟沙星溶液的濃度比較低時， 對太赫茲光譜影響不大， 所以表現(xiàn)為小梯度諾氟沙星溶液的吸收系數(shù)沒有直觀上的差異。 嘗試用不同的化學(xué)計量學(xué)方法尋找與濃度有關(guān)的特征變量， 本文選取信噪比較高的0.4～3 THz范圍內(nèi)的光譜數(shù)據(jù)進行后續(xù)建模分析。

2.2 光譜預(yù)處理

為了提高吸收光譜的信噪比， 本文使用S-G濾波器對原始光譜進行預(yù)處理， 對相鄰11個數(shù)據(jù)點進行二項式擬合。 處理后的光譜對比如圖3所示， 可以看出預(yù)處理后的數(shù)據(jù)更加平滑和規(guī)范化。

2.3 較大梯度諾氟沙星含量差異樣本定量建模研究

本文對較大梯度的諾氟沙星樣本進行太赫茲光譜測量， 獲得其太赫茲吸收譜， 原始光譜如圖3(a)所示， S-G濾波后的圖3(b)所示。 預(yù)處理后的數(shù)據(jù)更加平滑和規(guī)范化。 利用諾氟沙星的兩個特征吸收峰(0.816和1.205 THz)進行多元線性回歸建模與預(yù)測， 得到預(yù)測相關(guān)系數(shù)Rp和預(yù)測均方根誤差RMSEP分別為0.941和10.84%。 這時發(fā)現(xiàn)預(yù)測相關(guān)系數(shù)較高， 達到了0.9以上， 但是RMSEP比較高。 為了進一步提高較大梯度諾氟沙星的預(yù)測效果， 本研究嘗試對整個波長范圍的數(shù)據(jù)采用逐步回歸方法選取特征變量， 這里選取11個特征變量(0.412， 0.443， 0.557， 0.633， 0.786， 1.106， 1.221， 1.251， 1.411， 1.450和1.500 THz)， 這里的特征變量消除了部分多重共線性， 使得到的光譜數(shù)據(jù)包含更多的信息。 然后進行多元線性回歸分析， 預(yù)測相關(guān)系數(shù)Rc和預(yù)測均方根誤差RMSEP分別為0.962和2.74%。 顯然， 用逐步回歸選取變量的多元線性回歸建立的模型比用特征峰多元線性回歸建立的模型精度更高，Rc得到了提高， RMSEP降低。 這說明逐步線性回歸方法可以從全波段中選取更多有效的信息。 逐步回歸是從整個波長中搜索變量， 其中容易出現(xiàn)光譜數(shù)據(jù)過擬合， 為了減輕數(shù)據(jù)過擬合， 選取變量時嚴格的對每個波長進行逐一添加或刪除。 為了提高較大梯度諾氟沙星模型的預(yù)測精度， 進一步用特征吸收峰結(jié)合逐步線性回歸選擇變量的多元線性回歸建模預(yù)測較大梯度諾氟沙星的濃度， 這時Rc=0.989， RMSEP=5.72%， 雖然預(yù)測相關(guān)系數(shù)提高了， 同時預(yù)測均方根誤差也增加了。

圖3 太赫茲吸收系數(shù)光譜(a)： 較大梯度諾氟沙星(原始數(shù)據(jù))； (b)： 較大梯度諾氟沙星(S-G濾波后)；(c)： 較小梯度諾氟沙星(原始數(shù)據(jù))； (d)： 較小梯度諾氟沙星(S-G濾波后)Fig.3 Terahertz absorption coefficient spectrum(a)： Larger gradient Norfloxacin (raw data)； (b)： Larger gradient Norfloxacin (after S-G filtering)；(c)： Smaller gradient Norfloxacin (raw data)； (d)： Smaller gradient Norfloxacin (after S-G filtering)

利用SPA選擇的變量對較大梯度諾氟沙星進行建模與預(yù)測分析。 選取變量過程中， 當(dāng)運行SPA程序時， SPA_MLR程序會計算一系列的誤差均方根誤差(RMSE)， 這個過程保證選取的變量個數(shù)伴隨著一個理想的RMSE， 并且這個RMSE不會比最小的RMSE明顯大。 圖4(a)顯示了通過SPA選擇變量的過程， 從圖中可以看出， 當(dāng)SPA選擇前5個變量時， RMSE值顯著的降低。 隨著選擇變量個數(shù)增加， RMSE值逐漸減小。 當(dāng)選擇14個變量時， RMSE達到了理想值(RMSE=1.66%)。 選擇變量過程中， 盡管RMSE曲線存在一些波動， 但是整體呈現(xiàn)隨著變量的增加RMSE曲線下降的趨勢。 在較大梯度諾氟沙星樣本中， SPA選擇的14個變量如圖4(b)所示， SPA選取的變量分別用小正方形標(biāo)記(0.764， 1.000， 1.053， 1.098， 1.144， 1.311， 1.326， 1.349， 1.379， 1.402， 1.425， 1.455， 1.478和1.493 THz)。 我們發(fā)現(xiàn)在1.205 THz以下有5個變量， 1.205 THz以上存在9個變量， 這說明有效信息的頻率大多分布在較大的頻率范圍。 SPA選擇的變量的多元線性回歸結(jié)果為Rp=0.992， RMSEP=5.52%， 雖然模型精度提高了， 但是預(yù)測均方根誤差也變大了。

圖4 SPA選擇變量(較大梯度諾氟沙星)(a)： 選取變量數(shù)的RMSE； (b)： 選擇的變量位置Fig.4 Variable selection SPA (Larger gradient Norfloxacin)(a)： RMSE graph of the number of variables selected； (b) Location of selected variables

較大梯度諾氟沙星的建模結(jié)果見表1， 逐步回歸選擇變量后的多元線性回歸達到模型效果最優(yōu)， 預(yù)測相關(guān)系數(shù)Rp=0.962， RMSEP=2.74%， 該模型在保證了預(yù)測相關(guān)系數(shù)的前提下， 同時保證RMSEC和RMSEP的差值最小， 使模型具有更高的穩(wěn)定性。 這說明太赫茲時域光譜技術(shù)可以檢測較大梯度諾氟沙星， 預(yù)測精度相比已有檢測的建模結(jié)果(Rp=0.867,RMSEP=16.6%)得到了很大改善。

表1 較大梯度諾氟沙星的MLR建模結(jié)果Table 1 MLR modeling results of largergradient Norfloxacin

2.4 較小梯度諾氟沙星含量差異樣本定量建模研究

為了進一步研究較小梯度間隔諾氟沙星含量的定量檢測問題， 本文制備了濃度系列和梯度均小于100 μg·mL-1的29個較小梯度濃度， 對較小梯度的諾氟沙星樣本進行了測量， 得到原始光譜如圖3(c)所示。 經(jīng)S-G濾波后如圖3(d)所示， 預(yù)處理后的數(shù)據(jù)更加平滑和規(guī)范化， 后續(xù)對其進行建模分析。 首先， 用純凈的諾氟沙星樣本的特征峰(0.816和1.205 THz)進行多元線性回歸建模預(yù)測小梯度諾氟沙星無水乙醇溶液的濃度， 發(fā)現(xiàn)得到Rc和Rp分別是0.590和0.307， 建模效果很不理想， 可能是由于較小梯度諾氟沙星溶液中含諾氟沙星少， 所以光譜所包含的特征峰信息也比較少， 從而導(dǎo)致特征峰建模效果不理想。 之后用SPA算法選取變量進行建模分析， SPA選擇了兩個有效變量(0.496和1.77 THz)， 利用這兩個變量進行多元線性回歸建模預(yù)測較小梯度諾氟沙星溶液的濃度， 我們得到Rc和Rp分別是0.485和0.472。 發(fā)現(xiàn)預(yù)測相關(guān)系數(shù)Rp只有0.472， 模型效果仍然不理想， 這可能是因為SPA算法不適合用于較小梯度諾氟沙星溶液來提取變量,也即SPA找到的變量含有有限的濃度信息。 最后利用逐步線性回歸選取變量進行多元線性回歸建模， 逐步回歸找到了10個特征變量(0.565， 0.610， 0.641， 1.335， 1.762， 1.793， 1.862， 1.892， 2.152和2.228 THz)， 建立模型的Rc和Rp分別是0.859和0.728。 較小梯度諾氟沙星的建模結(jié)果如表2所示。 可以看出相比特征峰多元線性回歸和SPA的多元線性回歸， 逐步線性回歸的多元線性回歸模型效果達到了最優(yōu)， 但是預(yù)測相關(guān)系數(shù)為0.728， 預(yù)測均方根誤差為18.79 μg·mL-1。 這說明太赫茲時域光譜技術(shù)在檢測較小梯度諾氟沙星溶液方面能力較弱， 需要繼續(xù)尋求提升的手段。

表2 較小梯度諾氟沙星的MLR建模結(jié)果Table 2 MLR modeling results of smallergradient Norfloxacin

總體來說， 太赫茲時域光譜技術(shù)作為一種新型的無損檢測技術(shù)， 因其具有獨特的指紋特性， 且樣品預(yù)處理簡單等優(yōu)勢， 近年來被廣泛應(yīng)用于抗生素的定性定量檢測研究探索。 存在的問題主要有：

(1) 對于較高濃度檢測， 一般具有較好的精度； (2) 對于較低濃度檢測， 檢測精度較差， 特別是當(dāng)檢測濃度低于中國國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 31650—2019)時， 檢測變得異常困難。 近些年來， 國內(nèi)外相關(guān)研究人員也在不斷探索新型探測方法， 如超材料[15]、 平行平板金屬波導(dǎo)[16]等用于痕量檢測研究。 這也成為本研究的未來方向之一。

3 結(jié) 論

分別以較大梯度(濃度系列和濃度間隔均大于104μg·mL-1， 即1%)諾氟沙星和等于或者低于國家規(guī)定檢測限的較小梯度(濃度系列和濃度間隔均小于100 μg·mL-1， 即0.01%)諾氟沙星為研究對象， 通過設(shè)計梯度實驗， 探索太赫茲時域光譜技術(shù)用于較全濃度諾氟沙星的檢測潛力。 較大梯度諾氟沙星樣本的檢測分析發(fā)現(xiàn)： 純凈的諾氟沙星樣本存在兩個吸收峰， 峰位與已有的研究結(jié)果基本一致。 逐步線性回歸選擇變量進行多元線性回歸分析， 預(yù)測集的相關(guān)系數(shù)Rc=0.962,預(yù)測均方根誤差RMSEP=2.74%。 檢測結(jié)果相比已有檢測的最優(yōu)模型(Rc=0.886， RMSEP=16.6%)得到了提升； 進一步的較小梯度諾氟沙星溶液樣本檢測分析發(fā)現(xiàn)： 逐步線性回歸選擇變量的多元線性回歸達到了模型效果最優(yōu)， 預(yù)測集相關(guān)系數(shù)Rc=0.728， RMSEP=18.79 μg·mL-1， 該模型相比大梯度諾氟沙星的預(yù)測能力明顯下降。 說明太赫茲時域光譜技術(shù)在預(yù)測小梯度諾氟沙星含量方面能力不足， 需要繼續(xù)尋找提升手段。 總體來說， 太赫茲時域光譜技術(shù)可以比較準(zhǔn)確的預(yù)測較大梯度的諾氟沙星， 并在較小梯度諾氟沙星的預(yù)測方面也表現(xiàn)出一定的潛力， 但檢測能力較弱。 本文為諾氟沙星濃度的進一步檢測研究提供了理論基礎(chǔ)。