唐付杰，王星敏,,*，何孟陽，李 鑫，張家樂，李秋東，龔興鑫，陳泓岐

（1.重慶工商大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院, 重慶 400067；2.重慶市特色農(nóng)產(chǎn)品加工儲運(yùn)工程技術(shù)研究中心, 重慶 400067）

木犀草素（Luteolin）是一種天然黃酮類化合物，多以糖苷形式存在于紫蘇（梗）、花生、金銀花、菊花等植物中，具有較強(qiáng)的抗氧化、抗炎、抗菌等功效，被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)[1]。紫蘇梗（Perillastem）為紫蘇的干燥莖，富含木質(zhì)纖維素和高附加值的天然活性成分，如迷迭香酸、阿魏酸、咖啡酸、木犀草素等[2?4]，且紫蘇梗資源除少量入藥外，大多數(shù)被丟棄或焚燒[5]，造成高價(jià)值天然活性成分喪失。目前國內(nèi)外提取木犀草素多以花生殼、金銀花為原料，從紫蘇梗中提取報(bào)道尚少。

現(xiàn)有木犀草素提取技術(shù)主要有水提法、有機(jī)溶劑法、離子液體輔助微波法等。陳方園等[6]將1 g 花生殼粉末溶解在體積分?jǐn)?shù)81.6%甲醇溶液中經(jīng)80 ℃水浴鍋恒溫2.3 h，可提取木犀草素30.64 μg/g，提取率低、有機(jī)溶劑用量大；丁佳等[7]采用［C10mim］Br 離子液體溶液作提取溶劑， 微波輔助提取花生殼中木犀草素，提取量達(dá)80.11%，但提取成本高；現(xiàn)有提取技術(shù)或多或少存在著提取率低、有機(jī)溶劑用量大與生產(chǎn)成本高等不足。水熱酸控法運(yùn)用在植物提取技術(shù)領(lǐng)域，具有高效、環(huán)境友好、簡便等優(yōu)點(diǎn)[8]，一方面，營造的高溫（壓）浸提環(huán)境不僅加劇木質(zhì)纖維素分子間或分子內(nèi)部基團(tuán)振動[9]，降低纖維素結(jié)晶度[10]，還可促使溶劑水處于亞臨界狀態(tài)易電離產(chǎn)生氫和氫氧根離子[11]，從而增強(qiáng)植物纖維組織水解能效，打破組織致密三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，減少木犀草素等天然活性物質(zhì)溶出的傳質(zhì)阻力，如李杰等[12]利用水熱法提取黃芩中黃酮類物質(zhì)發(fā)現(xiàn)，在適宜條件下黃酮總得率為161 mg/g，比水煎煮法提高了18.63%；另一方面，酸性溶劑提取，既加大纖維素中糖苷鍵水解，又維持溶出的天然活性物質(zhì)穩(wěn)定[13]，如逯紅林等[14]采用酸水解提取工藝，水解黃酮糖苷成相應(yīng)的苷元，100 mg天山茶藨莖粉末經(jīng)5%鹽酸甲醇溶液在70 ℃酸水解100 min 可提取木犀草素達(dá)1.25 mg/g。如何應(yīng)用水熱酸控法提取優(yōu)勢，提高紫蘇梗中木犀草素等活性成分溶出效率，對實(shí)現(xiàn)紫蘇梗資源高值轉(zhuǎn)化尤顯重要。

基于此，本文提出水熱酸控法浸提紫蘇梗中天然活性物質(zhì)，選取木犀草素提取量為評價(jià)指標(biāo)，考察水熱時間、水熱溫度、料液比、檸檬酸質(zhì)量濃度等因素對木犀草素提取量的影響，通過響應(yīng)曲面法優(yōu)化獲得木犀草素適宜提取參數(shù)，分析提取影響因素間交互作用，采用FTIR 及SEM 表征分析水熱酸控前后的紫蘇梗粉末物相結(jié)構(gòu)，以期為提升紫蘇梗資源利用度提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紫蘇梗粉末 紫蘇梗采自重慶市忠縣德劼中藥材種植園，室溫陰干后，粉碎并過80 目篩，保存?zhèn)溆?；木犀草素（批?B20888） 純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇（分析純）、磷酸（分析純）、甲醇（色譜純）、溴化鉀（色譜純） 重慶川東化工集團(tuán)有限公司。

EL104 電子天平（0.0001 g） 塞多利斯科學(xué)儀器有限公司；TDZ5-WS 高速離心機(jī) 上海君竺儀器制造有限公司；CJF-0.05 小型高壓反應(yīng)釜 北京鞏義予華儀器有限公司；循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長城科工貿(mào)有限公司；1260 高效液相色譜儀 美國貝克曼庫爾特有限公司；臺式電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Nexus 670 傅里葉變換紅外光譜儀 美國 Nicolet 公司；SU1510 掃描電鏡日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 水熱酸控提取紫蘇梗中木犀草素 稱取紫蘇梗粉末2.0 g 于水熱反應(yīng)釜中，以體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇水溶液為提取溶劑。將原料按照一定料液比、檸檬酸質(zhì)量濃度加入反應(yīng)釜中，在一定溫度下的烘箱中水熱反應(yīng)一段時間，取出冷卻至室溫，得紫蘇梗提取液，將紫蘇梗提取液轉(zhuǎn)入錐形瓶中，在超聲波功率250 W、溫度60 ℃下超聲30 min 后真空抽濾，濾液于4000 r/min 離心15 min，取上清液，待測。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn) 按照 1.2.1 中木犀草素提取方法，固定料液比1:10 g/mL、水熱溫度210 ℃、檸檬酸濃度0.50%，考察水熱時間（60、80、100、120、140 min）對木犀草素提取量的影響；固定水熱時間100 min、料液比1:10 g/mL、檸檬酸濃度0.50%，考察水熱溫度（170、190、210、230、250 ℃）對木犀草素提取量的影響 ；固定水熱溫度為230 ℃、水熱時間100 min、檸檬酸濃度0.50%，考察料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30 g/mL）對木犀草素提取量的影響；固定水熱溫度為230 ℃、水熱時間100 min、料液比1:20 g/mL，考察檸檬酸質(zhì)量濃度（0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%）對木犀草素提取量的影響。在考察單因素變化時，固定乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、超聲波功率250 W、超聲溫度60 ℃、超聲時間30 min、離心轉(zhuǎn)速4000 r/min、離心時間15 min 等條件不變。

1.2.3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用CCD 模塊設(shè)計(jì)，選取水熱時間（A）、水熱溫度（B）、料液比（C）、檸檬酸質(zhì)量濃度（D）為自變量，以木犀草素提取量（Y）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)4 因素5 水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，響應(yīng)曲面因素水平見表1。

表1 響應(yīng)曲面因素水平Table 1 Response surface factor level

1.2.4 木犀草素含量測定 色譜條件[15]：色譜柱為Agilent 5 TC–C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） ；流動相為甲醇（A）、0.1%磷酸（B）；梯度洗脫：0～5 min，

35%～45% A；5～10 min，45%～50% A；10～15 min，50%～52% A；15～20 min，52%～60% A。流速1 mL/min；檢測波長330 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。以進(jìn)樣濃度對峰面積作圖，繪制木犀草素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=43.98X?7.80，R2=0.9999，在2.24～53.76 μg/mL 內(nèi)線性關(guān)系良好。木犀草素提取量計(jì)算公式如下：

式中：Y 為木犀草素提取量，μg/g；c 為木犀草素質(zhì)量濃度，μg/mL；v 為提取液體積，mL；m，紫蘇梗質(zhì)量，g。

1.2.5 物相表征

1.2.5.1 FTIR 分析 采用衰減全反射模式測定水熱酸控法浸提前后紫蘇梗粉末的傅里葉變換紅外光譜，采用KBr 壓片，測定波數(shù)為4000～500 cm?1。

1.2.5.2 SEM 分析 采用掃描電子顯微鏡分析水熱酸控法浸提前后紫蘇梗粉末的表面形貌結(jié)構(gòu)，其電鏡工作電壓為15 kV、放大700 倍。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值并計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)誤差，使用 Origin 9.0 軟件繪制趨勢曲線圖。響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)采用Design-Expert v8.0.6 軟件進(jìn)行二次回歸擬合及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 水熱時間對木犀草素浸提影響 由圖1 可知，在60～140 min 范圍內(nèi)，木犀草素提取量隨著水熱時間增加呈先上升后下降，在100 min 時達(dá)最大值為310.0 μg/g，是水浴鍋恒溫浸提2.3 h（提取量為30.64 μg/g）的10 倍[6]。原因在于，相對于水浴恒溫條件，水熱反應(yīng)釜的高溫（壓）促使溶劑水處于亞臨界狀態(tài)，產(chǎn)生的H+促進(jìn)木質(zhì)纖維組織裂解完全[11]，被包裹的木犀草素充分溶出；隨著水熱時間延長，水的介電常數(shù)、表面張力和極性都逐漸降低[16]，與紫蘇?；|(zhì)孔隙充分接觸，加大水分子與木犀草素間傳質(zhì)速率，木犀草素提取量增加；但水熱至100 min 后，木犀草素變得不穩(wěn)定，易被分解或氧化成其他物質(zhì)[17]，使木犀草素提取量降低，故選取100 min 為適宜水熱時間。

圖1 水熱時間對木犀草素提取量影響Fig.1 Effect of hydrothermal time on the extraction amount of luteolin

2.1.2 水熱溫度對木犀草素浸提影響 由圖2 可知，在170～250 ℃范圍內(nèi)，木犀草素提取量隨水熱溫度升高一直呈增加趨勢，這一趨勢與Min 等[18]報(bào)道相一致。原因在于，在升溫過程中，反應(yīng)體系熱能增加，水分子和木犀草素分子間運(yùn)動速率加快，氫鍵強(qiáng)度降低，加劇了相互碰撞結(jié)合；繼續(xù)升高溫度，水的粘度會不斷下降，滲透性增強(qiáng)[19]，從而導(dǎo)致木犀草素等黃酮醇類物質(zhì)的快速溶解、擴(kuò)散，增加木犀草素提取量，但溫度為250 ℃時由于溫度太高會影響木犀草素穩(wěn)定性和生物活性[18]，增加生產(chǎn)能耗，故選取230 ℃為適宜水熱溫度。

圖2 水熱溫度對木犀草素提取量影響Fig.2 Effect of hydrothermal temperature on the extraction amount of luteolin

2.1.3 料液比對紫蘇梗木犀草素浸提影響 由圖3可知，在1:10～1:30 g/mL 范圍內(nèi)，木犀草素提取量隨料液比增加呈先增加后減少，在料液比1:20 g/mL時達(dá)最大值為687.08 μg/g。原因在于，乙醇和水均含有–OH，可與含有四個酚羥基的木犀草素相互溶解；料液比過低時，體系溶液粘稠度高，存在飽和現(xiàn)象，木犀草素?zé)o法完全溶解；隨著溶劑用量增加，會適度擴(kuò)大紫蘇梗表面與溶劑間濃度差，有助于木犀草素的充分?jǐn)U散和溶出，但料液比超過1:20 g/mL 時，繼續(xù)升高料液比，體系固體物含量減少，木犀草素溶出速率達(dá)動態(tài)平衡，導(dǎo)致其他活性成分與木犀草素產(chǎn)生相互溶出的競爭關(guān)系，木犀草素提取量反而降低。另外，過多的提取溶劑，會造成浪費(fèi)和使生產(chǎn)費(fèi)用增加，故選取1:20 為適宜料液比。

圖3 料液比對木犀草素提取量影響Fig.3 Effect of the ratio of material on the extraction amount of luteolin

2.1.4 檸檬酸質(zhì)量濃度對紫蘇梗木犀草素浸提影響

由圖4 可知，不同檸檬酸質(zhì)量濃度對木犀草素提取量的影響有所不同，在0.5%～1.0%范圍內(nèi)，木犀草素提取量大幅度增加，由570.47 μg/g 增至756.87 μg/g，比單一乙醇超聲法提?。?8.76 μg/g）高11 倍[20]；在1.0%～1.5%范圍內(nèi)，在1.25%時達(dá)最大為802.98 μg/g，但木犀草素提取量僅比1.0%時增加46.11 μg/g。原因在于，酸性乙醇水溶液界面張力低于單一乙醇水溶液[21]，容易使得木犀草素上的酚羥基與檸檬酸上的羧基或羥基形成較強(qiáng)的分子間氫鍵，加大在水中分配系數(shù)，增加木犀草素提取量，而且酸性水熱體系可防止大多數(shù)植物組織中固有的過氧化酶、糖苷酶、多酚氧化酶等酶促氧化作用[22]，使木犀草素等活性物質(zhì)更穩(wěn)定，避免發(fā)生氧化分解；檸檬酸中COOH 基團(tuán)的H+易電離[23]，協(xié)同超聲渦流空化作用，加速木犀草素傳質(zhì)和溶出，但檸檬酸濃度超過1.0%時多余的H+繼續(xù)水解作用纖維組織，使其轉(zhuǎn)化成木糖、葡萄糖等小分子物質(zhì)，阻礙木犀草素溶出，導(dǎo)致在1.25%時木犀草素提取增加量較小，故選取1.0%為適宜檸檬酸質(zhì)量濃度。

圖4 檸檬酸質(zhì)量濃度對木犀草素提取量影響Fig.4 Effect of citric acid concentration on the extraction amount of luteolin

2.2 水熱酸控提取木犀草素的響應(yīng)曲面分析

2.2.1 回歸模型構(gòu)建及顯著性檢驗(yàn) 采用Design-Expert v8.0.6 軟件回歸擬合，由表2 可知，響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)和結(jié)果。由表3 方差分析可知二次模型極顯著P<0.0001，F(xiàn)=15.78，失擬項(xiàng)誤差不顯著（P=0.0597>0.05），決定系數(shù)R2= 0.9364>0.8，表明約93.64%的木犀草素提取量變異分布在所選取因素中，說明模型擬合情況較好，合理可靠。由F值檢驗(yàn)可獲得影響木犀草素溶浸的主次因素為：水熱溫度（B）>水熱時間（A）>檸檬酸質(zhì)量濃度（D）>料液比（C）。此外，A、B、D2對提取量的影響極顯著（P<0.001），D、A2、B2、C2均對提取率具有顯著性（P<0.05），其他因素不顯著，說明水熱溫度、水熱時間、檸檬酸質(zhì)量濃度平方效應(yīng)對紫蘇梗提取木犀草素影響最大，各因素間不是簡單的線性關(guān)系?；貧w擬合得出木犀草素提取量（Y）回歸方程為:

表2 RSM 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 The experimental design and results of RSM

表3 回歸模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance

Y=706.38+91.67A+176.89B+0.50C+44.37D+26.36 AB?1.99AC-10.32AD+12.76BC+4.11BD+22.13CD?33.59A2?57.82B2?44.12C2?74.81D2

2.2.2 提取因素響應(yīng)面及交互作用分析 響應(yīng)面可反映各因素的交互作用，響應(yīng)曲面越陡峭，表明該因素對響應(yīng)值影響越大；響應(yīng)曲面越平穩(wěn)，說明該因素對響應(yīng)值影響越小[24?25]。分析圖5 可知，響應(yīng)面坡面陡峭順序?yàn)锳B>CD>BC>AD>BD>AC，即水熱溫度和水熱時間交互作用響應(yīng)面最陡峭，與表3 中方差分析所反映的結(jié)果一致，因?yàn)樗疅釡囟葲Q定水熱反應(yīng)體系中熱能大小，高溫提供的熱能可有效裂解木質(zhì)纖維素；而當(dāng)水熱溫度不變時料液比-水熱時間，檸檬酸質(zhì)量濃度-水熱時間兩交互因素的響應(yīng)面變化趨勢都較平緩，對木犀草素提取量不顯著，因?yàn)檠娱L水熱時間雖能提高溶劑對植物細(xì)胞滲透作用，但溶劑量會蒸發(fā)降低，不利于木犀草素分子發(fā)生傳質(zhì)擴(kuò)散和溶浸[26]。

圖5 各因素兩兩交互作用對紫蘇梗粉末提取量的響應(yīng)面Fig.5 Response surface of pair-to-pair interaction of various factors on the extraction amount of Perilla stem powder

2.2.3 模型驗(yàn)證 根據(jù)模型預(yù)測紫蘇梗粉末木犀草素最佳提取工藝為: 水熱時間120 min、水熱溫度230 ℃、料液比1:21.01 g/mL、檸檬酸質(zhì)量濃度1.07%，此時理論木犀草素提取量為916.431 μg/g。結(jié)合實(shí)際情況，將木犀草素最佳提取工藝調(diào)整為水熱時間120 min、水熱溫度230 ℃、料液比1:20、檸檬酸質(zhì)量濃度1%，進(jìn)行3 次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，測得紫蘇梗粉末的平均木犀草素提取量為（901.049±0.60） μg/g，與理論預(yù)測值相近，說明該模型具有重現(xiàn)性、可行。

2.3 水熱酸控前后紫蘇梗粉末表征分析

2.3.1 紫蘇梗粉末水熱酸控前后表面官能團(tuán)分析對比圖6 發(fā)現(xiàn)，紫蘇梗粉末水熱酸控前后表現(xiàn)出相似的特征吸收峰，包括3340 cm?1處寬而強(qiáng)的羥基O?H 伸縮振動[27]、2946 cm?1處強(qiáng)而窄的?CH3、-CH2上C?H 不對稱伸縮振動、1045 cm?1附近弱而窄的C?O 伸縮振動的典型多糖物質(zhì)吸收峰[28]，說明水熱酸控法不會影響紫蘇梗粉末主體結(jié)構(gòu)，但會改變其內(nèi)部木質(zhì)纖維素化學(xué)結(jié)構(gòu)。紫蘇梗粉末水熱酸控后波數(shù)3340 cm?1附近的O?H 伸縮振動減弱，說明半纖維素與纖維素間部分氫鍵、結(jié)晶結(jié)構(gòu)被破壞；1750 cm?1處半纖維素上非共軛的酮、羰基和脂中的C=O 伸縮振動[29]，1120 cm?1羧基上C?O 伸縮振動、893 cm?1處纖維素中典型β-1,4 糖苷鍵上C?O?C 特征吸收峰均減弱，說明水熱體系破壞了木質(zhì)纖維素組織交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。檸檬酸酸水解木質(zhì)素、半纖維素，導(dǎo)致1360 cm?1纖維素中葡萄糖上O?H[30]和半纖維素中木聚糖結(jié)構(gòu)分子上的?CH2彎曲振動[31]的吸收峰增強(qiáng)，說明多聚糖間結(jié)構(gòu)發(fā)生了解聚。在1629 cm?1處與酯羰基（?COOR）和羧酸根離子（?COO?）基團(tuán)伸縮振動相關(guān)的兩個吸收峰增強(qiáng)，表明木質(zhì)纖維素部分水解轉(zhuǎn)化形成了糖醛酸[32]，1506 cm?1是木質(zhì)素的特征吸收峰，來源于苯環(huán)骨架振動[33]，波數(shù)1244 cm?1附近表征木質(zhì)素酚醚鍵C?O?C 伸縮振動的吸收峰增強(qiáng)，說明芳構(gòu)化成分和取代芳香結(jié)構(gòu)增加，木質(zhì)纖維素發(fā)生了解聚。圖譜反映出，水熱酸控法可破壞紫蘇梗木質(zhì)纖維素中C?O?C、C=O 結(jié)構(gòu)單元，促進(jìn)活性物質(zhì)溶出。

圖6 紫蘇梗粉末底物紅外光譜分析Fig.6 Infrared spectroscopy analysis of Perilla stem powder substrate

2.3.2 紫蘇梗粉末水熱酸控前后組織形貌分析 由圖7 可知，紫蘇梗粉末原料結(jié)構(gòu)完整致密，排列整齊；經(jīng)處理后的紫蘇梗（圖8）表面受到一定程度的破壞，組織結(jié)構(gòu)疏松，孔隙變大且出現(xiàn)較深的孔洞，說明水熱酸控法能破壞紫蘇梗致密組織結(jié)構(gòu)，減少木犀草素溶出傳質(zhì)阻力，進(jìn)而增加木犀草素提取量。

圖7 紫蘇梗粉末原料SEMFig.7 SEM figure of Perilla stem powder materials

圖8 水熱酸控后紫蘇梗粉末殘?jiān)黃EMFig.8 SEM figure after pretreatment of Perilla stem powder

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用水熱酸控法提取紫蘇梗粉末中木犀草素，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上結(jié)合響應(yīng)面優(yōu)化其提取工藝。結(jié)果表明：響應(yīng)面分析的二次模型極顯著，由F值檢驗(yàn)?zāi)艿玫接绊懩鞠菟厝芙囊蛩刂鞔螢椋核疅釡囟?水熱時間>檸檬酸質(zhì)量濃度>料液比，獲得的適宜工藝參數(shù)為：水熱時間120 min、水熱溫度230 ℃、料液比1:20、檸檬酸質(zhì)量濃度1%，此時2.0000 g 紫蘇梗粉末可提取出木犀草素（901.049±0.60） μg/g。FTIR 解析可得水熱酸控能破壞紫蘇梗木質(zhì)纖維素中C?O?C、C=O 結(jié)構(gòu)單元，減少木犀草素溶出阻力；SEM 表明水熱酸控能打破紫蘇梗致密的組織結(jié)構(gòu)，利于木犀草素溶出。