郝帥, 李爽, 劉媛璞, 王靜, 趙磊, 王成濤

(1.北京工商大學 食品與健康學院，北京 100048;2.北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心,北京 100048;3.北京市食品添加劑工程技術研究中心,北京 100048)

肺癌是威脅人類健康最常見的惡性腫瘤之一,也是我國的第一大癌癥,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占比約為85%,有較高的死亡率[1-2].目前肺癌治療方法主要以外科手術或放化療等傳統(tǒng)的方法為主[3],但大多數肺癌患者發(fā)現時已經進入中晚期,這些傳統(tǒng)的治療手段并不能有效地提高腫瘤患者生存率[4].其次,肺癌早期臨床診斷方法敏感度低、特異性差,治療過程又缺乏有效的分子標志物進行動態(tài)監(jiān)測指導治療,因此,對于NSCLC的靶向治療研究顯得尤為重要[5].

miRNAs(microRNAs)是一類內源性的、約有19～23個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA,可以調控真核細胞諸多生理活動,包括細胞增殖、浸潤、遷移、凋亡等.它們能夠和靶基因的3’非翻譯區(qū)配對結合,使得靶基因的表達水平在轉錄后受到抑制[6-8].研究表明,miRNAs與包括NSCLC在內的多種癌癥的調控過程相關[9].

miRNA在不同腫瘤的發(fā)展過程中擔任不同作用[10]:既能擔當抑癌因子,又作為致癌因子調控腫瘤生長、遷移進程[11-12],因此,miRNA的特異性表達在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起到關鍵作用.MONTERDE-CRUZ等[13]對骨肉瘤患者與健康供者血清進行了miRNA差異分析,結果發(fā)現與健康對照組相比,miR-642a-5p在骨肉瘤中出現過表達,提示miR-642a-5p可以作為骨肉瘤的潛在標志物.LIN等[14]通過分析癌癥基因組圖譜和結腸癌患者的測序數據,發(fā)現了miR-642a-5p的ceRNA調控機制,確定了LINC01234-miR642a-5p-SHMT2在結腸癌增殖中起關鍵作用,為結腸癌的診斷和治療提供了一個潛在的新靶點.在前期研究中,發(fā)現天然功能性食用色素藻藍蛋白(phycocyanin,PC)能夠顯著抑制非小細胞肺癌的增殖和遷移[15-16],但深入的調控機制尚不清楚.藻藍色素是一種源于螺旋藻、藍藻細胞中的捕光蛋白,在螺旋藻中含量較高[17],由脫輔基蛋白亞基(α,β)和藻藍素輔基結合形成的水溶性蛋白復合體,是藻膽蛋白的重要組成部分.藻藍色素除了作為優(yōu)良的食品著色劑,還兼具抗氧化、抗病毒、抗炎癥等多種生理功能,是一種重要的藥食同源型食品添加劑[18-19].文中以非小細胞費肺癌LTEP-a2細胞為模型,尋找藻藍蛋白抑制細胞活性的關鍵miRNA,從小分子層面探究其調控規(guī)律為NSCLC的治療提供了理論依據.

1 實驗材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

人類非小細胞肺癌LTEP-a2細胞由本實驗室自主保存;miR-642a-5p mimics/Neg.mimics、Hairpin-it miRNAs定量試劑盒購自上海吉瑪制藥有限公司;NF-κB抗體試劑盒購自美國Cell Signaling Technology公司;MMP2和MMP9購自美國abcam抗體公司;藻藍色素蛋白標品購自賓美生物公司;藻藍色素標品購自賓美生物;胎牛血清購自天津康源生物技術有限公司;1%青霉素-鏈霉素雙抗、1×PBS緩沖溶液購自美國Corning公司;胰酶細胞消化液、姬姆薩染液、四甲基偶氮唑藍MTT購自碧云天生物技術有限公司;RIPA裂解液、PMSF蛋白酶抑制劑、磷酸化蛋白酶抑制劑購自北京鼎國昌盛生物技術有限公司;PVDF膜購自Millipore公司;Protein Maker購自天根生物技術有限公司;BD脫脂奶粉購自美國BD公司;ECL化學發(fā)光液購自Millipore公司.

DNA濃度測定儀購自美國Thermo公司;Tanon5200全自動化學發(fā)光圖像分析儀購自北京原平皓生物技術有限公司;聚丙烯酰胺凝膠電泳儀及膜轉印裝置購自美國Bio-Rad公司.

1.2 細胞培養(yǎng)

LTEP-a2細胞株培養(yǎng)于添加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)條件為37℃、5%二氧化碳恒溫細胞培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng).

1.3 miRNA轉錄組測定

將藻藍色素蛋白處理的細胞(處理濃度為4.8 μmol/L)和對照組細胞進行轉錄組測序,首先提前12 h將用于轉錄組測序的細胞傳代并鋪于細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng),對照組為A-1,A-2,A-3,藻藍蛋白處理組為實驗組編號為B-1,B-2,B-3,將實驗組細胞培養(yǎng)基替換為含有藻藍蛋白的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細胞,提取細胞總RNA;利用生物學手段對總RNA處理并構建cDNA文庫,通過RNA-seq測序以及生物信息學分析等手段構建出藻藍蛋白處理組、實驗組差異miRNA轉錄組文庫.

1.4 miR-642a-5p mimics的瞬時轉染

采用瞬時轉染法將化學合成的miR-642a-5p mimics、Neg.mimics轉染到細胞中,并進行下游細胞實驗.將合成的mimics用DEPC水溶解為20 μmol/L的儲存液,適量分裝并于-80℃保存?zhèn)溆?轉染終濃度為50 nmol/L,具體轉染步驟根據脂質體轉染試劑Lipofectamine3000說明書操作.

1.5 細胞生長曲線、集落的測定

將轉染12 h的細胞胰酶消化、離心收集計數,鋪于96孔板中,6 h細胞貼壁后加入MTT,6 h再加入SDS-HCl裂解液,12 h后測定細胞570 nm處吸光值.連續(xù)測定0～5 d吸光值并記錄數據.以橫坐標為時間,縱坐標為吸光值(OD值),繪制細胞的生長曲線,統(tǒng)計細胞0～5 d生長情況.同時將轉染12 h的細胞以200個/孔的量鋪于6孔板中,加入2 mL培養(yǎng)基,放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d,當集落大小肉眼可見時,利用吉姆薩染液對細胞集落染色,拍照保存并計算細胞克隆數.

1.6 細胞劃痕實驗

將轉染mimics的陰性對照組和實驗組細胞培養(yǎng)至細胞匯合度為90%單層鋪滿,利用滅菌的黃槍頭快速劃過培養(yǎng)皿內的細胞劃出劃痕標記,用培養(yǎng)基沖去細胞碎片,隨后用3%血清的培養(yǎng)基培養(yǎng),分別在0,24,48 h時定點拍照并保存,同時計算細胞遷移率.根據劃痕寬度H計算遷移率A公式如下

A=[(H1-H2)/H2]×100%

式中:H1為實驗組;H2為對照組.

1.7 熒光定量PCR

使用TRIZOL試劑提取細胞總RNA,采用NANO Drop2000測定RNA濃度,用DEPC水調平每組濃度,分別取3 μg總RNA應用miRNA逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA;取2 μL cDNA和適量SYBR酶和miR-642a-5p、U6(內參)引物進行熒光定量PCR定量分析miR-642a-5p的表達.引物序列如表1所示.

表1 定量PCR引物序列

1.8 Western Blotting

收集轉染48 h后的細胞,RIPA裂解液抽提細胞總蛋白.將Marker、對照組、實驗組進行SDS-PAGE蛋白分離,隨后將分離的蛋白轉移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉1.5 h,使用其特異性抗體與目的蛋白孵育過夜(4 ℃),第2天37 ℃ 1 h孵育二抗,充分洗凈后,滴加化學發(fā)光液,利用Tanon5200全自動化學發(fā)光圖像分析儀對條帶曝光,獲得蛋白表達信號后拍照保存.

1.9 統(tǒng)計分析

柱狀圖和折線圖中的實驗數據均以平均數±標準差(mean±standard deviation)表示,采用SPSS 11.0軟件進行單因素方差分析,其中p<0.05為顯著性差異(*);p<0.01為極顯著差異(**).

2 結果與討論

2.1 藻藍色素蛋白抑制LTEP-a2細胞體外增殖、遷移能力

在前期研究中,以非小細胞肺癌LTEP-a2為模型,采用四甲基偶氮唑藍(MTT)檢測以及劃痕愈合、熒光定量PCR、Western等實驗探究了藻藍蛋白對LTEP-a2細胞的影響.從結果中發(fā)現藻藍蛋白能明顯抑制LTEP-a2細胞的體外增殖能力;同時,劃痕實驗、經典遷移基因表達檢測結果證明了藻藍蛋白可以顯著抑制細胞的體外遷移能力[20].但這一過程中的小分子調控機制還尚不清晰(圖1).為了深入探索藻藍蛋白的抗肺癌機制,本文進行了深入的探究.

圖1 藻藍色素蛋白抑制LTEP-a2細胞體外增殖、遷移能力Fig.1 The inhibition ability of phycocyanin to the proliferation and migration of LTEP-a2 cells in vitro

2.2 miRNA轉錄組學篩選差異miRNA并體外驗證

首先提取了藻藍色素處理后的A549細胞總RNA,并進行miRNA轉錄組測序前的質量檢測.圖2分別為對照組(圖2(a)和藻藍色素處理組(圖2(b))的RNA完整性分析結果.圖2結果顯示,RNA條帶清晰,無色素、蛋白、糖類等雜質污染,RNA的18 S和28 S亞基處的峰完整且集中程度較高,28/23 S亮度大于18/16 S.初步顯示了RNA結構的完整性.此外,表2顯示了RNA質量檢測的相關數據,表2結果顯示,1～6組樣品中,每組RNA總量均大于5 μg,濃度大于250 ng/μL,OD260/280均大于1.8,RNA的RIN值均大于8,總量滿足2次建庫需要.以上結果表明RNA樣本結構完整,沒有發(fā)生明顯降解,符合樣本要求,可以進行后續(xù)的miRNA轉錄組測序分析.

圖2 藻藍蛋白處理組與對照處理組LTEP-a2細胞中的RNA完整性檢測Fig.2 RNA integrity test in phycocyanin-treated and control LTEP-a2 cells

表2 不同樣本RNA的質量檢測數據

通過高通量測序篩選和統(tǒng)計學分析,篩選出了一系列藻藍蛋白處理后差異表達的miRNA.圖3為差異miRNA篩選火山圖(volcano-plots),圖中每個點代表一個特定的miRNA,▲表示顯著上調的miRNA,▼表示顯著下調的miRNA,●為非顯著差異miRNA,并且,越靠兩側和上端的點表達差異越顯著.本文篩選到了一個感興趣的上調表達的miRNA,miR-642a-5p(log2FC(PC/control為1.02),并且進行了轉錄組的qRT-PCR驗證.圖3 qRT-PCR結果顯示,藻藍蛋白處理后,miR-642a-5p相對表達量約為對照組的5倍,這與轉錄組的趨勢是一樣的.以上結果說明藻藍蛋白作用LTEP-a2細胞后確實能上調miR-642a-5p的表達.

圖3 藻藍蛋白處理LTEP-a2細胞后的miRNA轉錄組分析Fig.3 miRNA transcriptome analysis of LTEP-a2 cells after treatment with phycocyanin

2.3 qRT-PCR檢測轉染mimics后LTEP-a2細胞miR-642a-5p的過表達效果

miR-642a-5p在多種腫瘤細胞中參與了調控作用[13-14],那么它是否也介導了藻藍蛋白抑制非小細胞肺癌生長的調控過程呢？為了驗證猜測,首先在LTEP-a2細胞中分別轉染了miRNA模擬物Neg.mimics和miR-642a-5p mimics,48 h后采用miRNA qRT-PCR檢測了miR-642a-5p在細胞內的表達.

結果顯示,與對照組相比,在外源轉染mimics后,LTEP-a2細胞內miR-642a-5p的表達量顯著升高(如圖4所示).綜上所述,在LTEP-a2細胞中miRNA mimics的轉染效率很高,可以進行后續(xù)的實驗.

圖4 轉染后實時熒光定量PCR檢測miR-642a-5p在LTEP-a2細胞內的表達Fig.4 Expression of miR-642a-5p in LTEP-a2 cells after transfection detected in real time by fluorescence quantitative PCR

2.4 過表達miR-642a-5p對LTEP-a2細胞體外增殖能力的影響

轉染miR-642a-5p后,采用MTT的方法檢測了細胞的體外增殖能力.結果顯示,與對照組相比,過表達miR-642a-5p后明顯抑制了細胞的體外增殖能力,處理后的第4天起細胞增殖出現極顯著差異(如圖5所示).此外,培養(yǎng)2 w后,轉染miR-642a-5p組細胞的集落個數明顯少于對照組(圖5),同時結果具有統(tǒng)計學意義.以上結果表明,miR-642a-5p確實能夠顯著降低LTEP-a2細胞的體外增值能力.

圖5 過表達miR-642a-5p對LTEP-a2細胞體外增殖能力的影響Fig.5 Effect of miR-642a-5p overexpression on the in vitro proliferation of LTEP-a2 cells

2.5 過表達miR-642a-5p抑制LTEP-a2細胞的體外遷移能力

在LTEP-a2細胞轉染miR-642a-5p mimics 24,48 h后對遷移距離進行了測量和統(tǒng)計.如圖6(a)6(b),結果顯示,LTEP-a2細胞轉染陰性對照24,48 h后的平均遷移率為14.5%,19.6%,而轉染mimics 24,48 h后的平均遷移率為6.5%,15%,細胞的遷移能力有所下降,說明LTEP-a2細胞在過表達miR-642a-5p后體外遷移能力受到抑制.隨后檢測了過表達miR-642a-5p后細胞內遷移相關蛋白MMP2,MMP9的表達水平.基質金屬蛋白酶(matrixmetalloproteinases,MMPs)作為一類調節(jié)細胞遷移功能的重要的蛋白酶,對調節(jié)細胞外基質生長有重要作用,同時,血管是細胞外基質的主要成分,血管形成是腫瘤轉移的主要因素,MMP2,MMP9均屬明膠酶類,是能夠降解IV型膠原的主要基質水解酶,其中MMP9是MMPs系統(tǒng)中最大的酶,MMP2能降解I型膠原纖維,均與細胞遷移密切相關,并在惡性腫瘤中都有過度的表達[21-22].圖6(c)6(d)顯示mimics轉染48 h后的實時熒光定量PCR,結果顯示,細胞中MMP2、MMP9轉錄物的量有所下調,同時Western Blot結果也顯示,在LTEP-a2細胞過表達miR-642a-5p后,MMP2,MMP9蛋白水平的表達同樣也是下調的.以上結果表明過表達miR-642a-5p能夠抑制LTEP-a2細胞的體外遷移能力.

圖6 過表達miR-642a-5p抑制LTEP-a2細胞的體外遷移能力Fig.6 Inhibition ability of mir-642a-5p overexpress to the migration of LTEP-a2 cells in vitro

2.6 過表達miR-642a-5p對LTEP-a2細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

NF-κB是一個有5個重要轉錄因子的家族,在響應基因的啟動子區(qū)域,可以形成或與之結合形成共識的DNA序列,進而調節(jié)細胞增殖、凋亡和分化[23].為了探究藻藍蛋白是否能夠通過介導miR-642a-5p影響NF-κB通路的活性而影響細胞的增殖、遷移等生理功能,對通路蛋白的水平進行了檢測.圖7顯示,藻藍蛋白處理LTEP-a2細胞后,IKKα/β,IκBα,p65蛋白的磷酸化水平顯著降低.IKKα,IKKβ是IκBα的催化亞基,同時也作為p65蛋白的抑制劑,IKKα/β蛋白磷酸化可以使IκBαSer 32位發(fā)生磷酸化,導致IκBα的蛋白酶體依賴性降解,接著是p65磷酸化和NF-κB激活[24].而miR-642a-5p過表達后,同樣可以發(fā)現蛋白的表達與藻藍蛋白處理后基本一致,因此,研究結果表明miR-642a-5p參與了藻藍蛋白抑制NF-κB通路的過程,從而影響了LTEP-a2細胞的增殖和遷移.

圖7 過表達miR-642a-5p對LTEP-a2細胞NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響Fig.7 Effect of miR-642a-5p overexpression on the expression of NF-κB signaling pathway proteins in LTEP-a2 cells

2.7 抑制miR-642a-5p的表達促進LTEP-a2細胞的增殖和遷移能力

為了進一步證實miR-642a-5p對細胞增殖和遷移的影響,進行了miR-642a-5p的敲低實驗.采用miR-642a-5p抑制劑轉染LTEP-a2細胞,并對細胞的增殖和遷移能力進行了檢測,圖8結果顯示,抑制miR-642a-5p的表達后,能夠顯著促進LTEP-a2細胞的體外增殖和遷移能力,這一結果與過表達miR-642a-5p正好相反,進一步對本研究的結果進行了證實.

圖8 抑制miR-642a-5p對LTEP-a2細胞生長和遷移的影響Fig.8 Effect of miR-642a-5p inhibition on the proliferation and migration of LTEP-a2 cells

3 結 論

本研究以LTEP-a2典型的非小細胞肺癌細胞為研究模型,通過藻藍蛋白處理后,采用高通量miRNA轉錄組測序,對差異miRNA進行篩選,獲得一個感興趣的上調miRNA miR-642a-5p,體外驗證miRNA的表達量與轉錄組一致.隨后對轉染miR-642a-5p的細胞的增殖和遷移能力進行檢測,發(fā)現miR-642a-5p在細胞中的過表達能使細胞生長緩慢,克隆形成能力削弱;同時,劃痕愈合能力也大大減弱,經典遷移蛋白 MMP2、MMP9在轉錄水平和蛋白水平上都有明顯降低.研究結果能夠為功能性藻藍色素蛋白的應用和非小細胞肺癌的治療提供理論基礎.