傅若秋，李 斌，王顯鳳，張 琳，王林麗，陳劍鴻

（中國(guó)人民解放軍陸軍軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院藥劑科，重慶400042）

神經(jīng)退行性疾病是中老年人的常見疾病，如阿爾茨海默病、帕金森病、肌萎縮側(cè)索硬化、多發(fā)性硬化等[1]，發(fā)病原因較復(fù)雜，大多機(jī)制不明，其共同點(diǎn)為大腦和脊髓的神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)生病變，出現(xiàn)損傷，常用的治療策略為對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行保護(hù)[2]。中藥及中藥單體在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞方面有獨(dú)特作用，如半夏瀉心湯、天麻鉤藤飲、槲皮素、花青素等多種中藥復(fù)方制劑或中藥單體均可防護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受損傷[3－6]。杞歸八味口服液（曾用名益精靈口服液）為我院特色自制制劑，由何首烏、枸杞子、菟絲子、牛膝、當(dāng)歸、補(bǔ)骨脂、茯苓、陳皮8味中藥組方，具有健腦安神、滋補(bǔ)肝腎功效，用于治療失眠多夢(mèng)、健忘、腰膝酸軟、神疲乏力等癥，療效顯著，已在臨床使用近30年。其組方中所含甜菜堿、β蛻皮甾酮、異鼠李素等活性成分具有神經(jīng)保護(hù)作用[7－9]。前期研究證實(shí)，其具有神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)節(jié)作用，可抗抑郁和增強(qiáng)小鼠的學(xué)習(xí)能力[10]。本研究中探討了杞歸八味口服液對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞損傷的防護(hù)作用及其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；GS－15KGS型高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）；CKX41型光學(xué)倒置顯微鏡（日本Olympus公司）；165－8001型蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜槽、Chem I Doc型超高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio－Rad公司）；HR30－11A2型生物安全柜（青島海爾股份有限公司）；C6型流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）；STNERGYH1型酶標(biāo)儀（美國(guó)Agilent公司）。

試藥：杞歸八味口服液（醫(yī)院制劑，批號(hào)為200413）；魚藤酮（美國(guó)Selleck公司，批號(hào)為S2348）；PRIM培養(yǎng)基（美國(guó)Hyclone公司，批號(hào)為SH30809.01）；胎牛血清（天津康源生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為20200408）；Western細(xì)胞裂解液（批號(hào)為P0013），BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)為P0009），胰酶消化液（批號(hào)為C02010），均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（美國(guó)BD公司，批號(hào)為556547）；CCK－8試劑盒（美國(guó)MCE公司，批號(hào)為HY－K0301）；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔免疫球蛋白（Ig）G（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)為ZB2305）；預(yù)染蛋白Marker（美國(guó)Thermo公司，批號(hào)為26619型）；蛋白激酶B（AKT）抗體（批號(hào)為ab200195），磷酸化AKT（p－AKT）抗體（批號(hào)為ab192623），哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗 體（批 號(hào) 為ab2723），磷 酸 化mTOR（pmTOR）抗體（批號(hào)為ab137133），c－Jun氨基端蛋白激酶（JNK）抗體（批號(hào)為ab179461），磷酸化JNK（p－JNK）抗體（批號(hào)為ab124756），均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體（美國(guó)CST公司，批號(hào)為21185）；聚腺苷二磷酸－核糖多聚酶（PARP）抗體（批號(hào)為13371－1－AP），cleaved－Caspase3（c－Caspase3）抗體（批號(hào)為19677），均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）。

細(xì)胞：鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞株（美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，批號(hào)為CRL－1721）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

PC12細(xì)胞用PRIM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）于37℃、5% CO2條件下恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 CCK－8試驗(yàn)檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞，經(jīng)胰酶消化后得細(xì)胞懸液，按（5 000個(gè)細(xì)胞，90 μL）／孔接種于96孔板中，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，加入受試藥物10 μL。藥物分組：1)杞歸1組、2組、3組、4組、5組（以杞歸八味口服液原液濃度為100%計(jì)，作用濃度分別為0.1%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%），藥物作用24 h；2)魚藤酮1組、2組、3組、4組、5組（相當(dāng)于魚藤酮0.5，1.0，2.0，4.0，8.0 μmol／L），藥物作用24 h；3)杞歸八味口服液聯(lián)用魚藤酮：空白對(duì)照組（水）、魚藤酮4組，以及杞歸1，2，3，4，5（0.2%，0.4%，0.6%，0.8%）＋魚藤酮4組，先給予杞歸八味口服液預(yù)處理2 h，再給予魚藤酮作用24 h。藥物處理結(jié)束后，每孔加入CCK－8試劑10 μL，置培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀于450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)吸光度，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞懸液，按2.0×105個(gè)／孔接種于6孔板中，每孔培養(yǎng)基體積2 mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，給予杞歸八味口服液及魚藤酮藥液作用24 h。胰酶消化后收集于15 mL離心管中，800 r／min離心5 min，棄上清液，用2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）混懸細(xì)胞，800 r／min離心5 min，棄上清液，加入凋亡檢測(cè)染色液（含Annexin V－FITC染液2 μL，PI染液5 μL，Binding buffer 100 μL），混勻，室溫避光染色15 min。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，并計(jì)算凋亡率。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡（Western blotting）法檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞懸液，按2.0×106個(gè)／孔接種于100 mm培養(yǎng)皿中，每孔培養(yǎng)基10 mL，于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，給予杞歸八味口服液預(yù)處理2 h，然后給予魚藤酮作用24 h。提取全細(xì)胞蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白含量。蛋白液中加入5×loading buffer混勻，于98℃加熱使蛋白變性。變性后的蛋白樣品用聚丙烯凝膠電泳進(jìn)行分離，分離后的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，加一抗孵育過(guò)夜。次日回收一抗，TBST漂洗后于室溫下孵育二抗1 h。TBST漂洗后加入發(fā)光底物，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行曝光。WB條帶用Image J 1.37C軟件測(cè)量其灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參蛋白的灰度比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響

與空白對(duì)照組比較，杞歸3組、4組、5組的細(xì)胞存活率均顯著升高，且呈量效依賴趨勢(shì)（P＜0.05）；魚藤酮1組、2組、3組、4組、5組的細(xì)胞存活率均顯著降低，且呈量效依賴趨勢(shì)（P＜0.01）。詳見表1。

表1 杞歸八味口服液及魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞存活率的影響Tab.1 Effects of Qigui Bawei Oral Liquid and rotenone on the survival rate of PC12 cells

2.2 對(duì)魚藤酮降低PC12細(xì)胞存活率的影響

與魚藤酮4組比較，杞歸3，4，5＋魚藤酮4組的細(xì)胞存活率均顯著升高，且呈量效依賴趨勢(shì)（P＜0.01）?？梢?，聯(lián)用杞歸八味口服液可明顯減弱魚藤酮導(dǎo)致的細(xì)胞存活率下降。詳見表2。

表2 杞歸八味口服液對(duì)魚藤酮降低PC12細(xì)胞存活率的影響Tab.2 Effect of Qigui Bawei Oral Liquid on rotenone reducing the survival rate of PC12 cells

2.3 對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響

與空白對(duì)照組比較，魚藤酮組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與魚藤酮組比較，杞歸4＋魚藤酮4組細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.01）?？梢姡~藤酮能明顯誘導(dǎo)PC12細(xì)胞凋亡，但杞歸八味口服液能阻止魚藤酮誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞凋亡。詳見圖1和表3。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)PC12細(xì)胞凋亡情況A.Blank control group B.Rotenone group 4 C.Qigui group 4 D.Qigui group 4＋rotenone group 4Fig.1 The apoptosis of PC12 cells detected by flow cytometry

2.4 對(duì)魚藤酮激活凋亡相關(guān)蛋白和AKT／mTOR及JNK信號(hào)通路的影響

與空白對(duì)照組比較，魚藤酮4組PARP蛋白表達(dá)水平顯著降低，c－Caspase3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與魚藤酮組比較，杞歸4＋魚藤酮4組PARP蛋白表達(dá)水平顯著升高，c－Caspase3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）?？梢?，魚藤酮能明顯激活凋亡相關(guān)蛋白，但聯(lián)用杞歸八味口服液可明顯減弱魚藤酮對(duì)凋亡蛋白的激活。與空白對(duì)照組比較，魚藤酮4組p－AKT和p－mTOR蛋白表達(dá)水平均顯著降低，p－JNK蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與魚藤酮4組比較，杞歸4＋魚藤酮4組p－AKT和p－mTOR蛋白表達(dá)水平均顯著升高，p－JNK蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）?？梢?，魚藤酮抑制了AKT／mTOR信號(hào)通路，并激活了JNK信號(hào)，但聯(lián)用杞歸八味口服液可明顯減弱魚藤酮對(duì)AKT／mTOR及JNK信號(hào)通路的影響。詳見表3和圖2。

表3 細(xì)胞凋亡率及蛋白表達(dá)水平比較(±s)Tab.3 Comparison of apoptosis rate and protein expression level(±s)

表3 細(xì)胞凋亡率及蛋白表達(dá)水平比較(±s)Tab.3 Comparison of apoptosis rate and protein expression level(±s)

注：與空白對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與魚藤酮4組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。Note：Compared with those in the blank control group，*P＜0.05，**P＜0.01；compared with those in the rotenone group 4，△P＜0.05，△△P＜0.01.

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圖2 Western blotting法檢測(cè)PC12細(xì)胞的蛋白表達(dá)水平A.Blank control group B.Rotenone group 4 C.Qigui group 4 D.Qigui group 4＋rotenone group 4Fig.2 The protein expression of PC12 cells detected by Western blotting

3 討論

PC12細(xì)胞是一種大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞株，具有神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的普遍特征，且可傳代，廣泛用于神經(jīng)生理及藥理學(xué)研究[11]。魚藤酮是一種從豆科魚藤屬植物中提取的異黃酮化合物，在農(nóng)業(yè)上作為殺蟲劑被廣泛使用，因具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性，也被作為神經(jīng)細(xì)胞損傷的造模藥物廣泛應(yīng)用[12]。在構(gòu)建魚藤酮損傷的PC12細(xì)胞模型中，不同研究者所用的魚藤酮?jiǎng)┝考白饔脮r(shí)間不一致，作用濃度為0.5～10 μmol／L，作用時(shí)間為4～24 h[13－15]，這可能與各實(shí)驗(yàn)室所用培養(yǎng)條件、細(xì)胞狀態(tài)及細(xì)胞對(duì)藥物的敏感度不一致有關(guān)。通過(guò)前期試驗(yàn)，選擇魚藤酮濃度為4 μmol／L，作用時(shí)間為24 h，成功構(gòu)建了PC12細(xì)胞損傷模型，細(xì)胞凋亡率可達(dá)33%，細(xì)胞活性下降約40%。

通過(guò)預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，0.5%及1.0%濃度的杞歸八味口服液可增強(qiáng)PC12細(xì)胞的活性，但2.0%濃度的杞歸八味口服液反而使PC12細(xì)胞活性降低。進(jìn)一步考察杞歸八味口服液在0.1%～0.8%濃度范圍內(nèi)對(duì)PC12細(xì)胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.4%～0.8%濃度的杞歸八味口服液可增強(qiáng)PC12細(xì)胞的活性，可明顯減弱魚藤酮導(dǎo)致的PC12細(xì)胞活性下降，且0.6%濃度時(shí)作用即達(dá)到最大，故選擇0.6%濃度作為后續(xù)藥理機(jī)制研究的作用濃度。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的一種常見方式，也是魚藤酮損傷PC12細(xì)胞的主要原因[16]。PARP蛋白可特異性地識(shí)別DNA斷裂末端并結(jié)合，是一種重要的DNA修復(fù)酶，當(dāng)?shù)蛲霭l(fā)生時(shí)，可被上游的Caspase－3剪切降解而喪失DNA修復(fù)功能[17]。Caspase－3是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，通過(guò)自身剪切激活后，再催化PARP發(fā)生降解[18]。因此，Caspase－3剪切激活及PARP發(fā)生降解被認(rèn)為是凋亡發(fā)生的標(biāo)志[19]。本試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，魚藤酮誘導(dǎo)PC12細(xì)胞發(fā)生凋亡，Wester blotting試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，魚藤酮可導(dǎo)致PARP降解（PARP蛋白表達(dá)水平降低）和Caspase－3剪切激活（c－Caspase3蛋白表達(dá)水平升高）。同時(shí)，杞歸八味口服液能減弱魚藤酮誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并減弱魚藤酮導(dǎo)致的PARP蛋白表達(dá)水平的降低及c－Caspase3蛋白表達(dá)水平的升高，表明杞歸八味口服液減輕了魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用。

常見的有PI3K／AKT／mTOR，MAPK（JNK／ERK／P38），STAT3，Wnt／β－catenin，NF－κB等[20]信號(hào)通路蛋白參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控。而AKT／mTOR通路的抑制及JNK信號(hào)激活是魚藤酮導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷的常見機(jī)制[21－22]。AKT是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，作用廣泛，與細(xì)胞內(nèi)許多信號(hào)通路有關(guān)；mTRO是AKT的下游分子，屬于一種不典型的絲氨酸／酪氨酸蛋白激酶。AKT／mTOR信號(hào)通路對(duì)維持細(xì)胞存活、促進(jìn)細(xì)胞增殖和生長(zhǎng)非常重要。在中樞神經(jīng)誘導(dǎo)損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，抑制AKT／mTOR通路可加重神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，而激活該通路則可對(duì)神經(jīng)細(xì)胞起保護(hù)作用[23]。JNK是一種絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，屬于MAPK家族的一員，在細(xì)胞凋亡的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，JNK磷酸化激活后能介導(dǎo)多種細(xì)胞（如神經(jīng)、心肌、肝、腫瘤等）的凋亡反應(yīng)[24]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，魚藤酮可抑制AKT／mTOR信號(hào)通路，并激活JNK信號(hào)；同時(shí)發(fā)現(xiàn)杞歸八味口服液可減弱魚藤酮對(duì)AKT／mTOR通路的抑制及對(duì)JNK的激活作用，表明杞歸八味口服液通過(guò)AKT／mTOR及JNK途徑保護(hù)了PC12細(xì)胞。

綜上所述，杞歸八味口服液可減輕魚藤酮對(duì)PC12細(xì)胞的損傷作用，可能與其減弱了魚藤酮對(duì)AKT／mTOR及JNK信號(hào)通路的影響有關(guān)。由于杞歸八味口服液成分復(fù)雜，其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的具體物質(zhì)基礎(chǔ)（有效單體化合物）還有待進(jìn)一步研究。