才 讓，王永芹，祁蕙燕，張 輝，趙 瑩

（青海省西寧市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，西寧 810000）

膀胱癌是目前我國最為常見的泌尿系統(tǒng)腫瘤，其中有將近75%的膀胱癌為非肌層浸潤性膀胱癌（NMIBC）[1]。NMIBC復(fù)發(fā)較為普遍且難以預(yù)測(cè)，因此尋找能夠預(yù)測(cè)NMIBC患者復(fù)發(fā)的潛在生物標(biāo)志物尤為重要[2-3]。微小RNA（microRNA，miR）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為19～24 個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其在真核生物中普遍存在[4]。研究表明，某些miR在癌組織及其癌旁組織中的表達(dá)水平不同，其對(duì)于癌癥的預(yù)測(cè)及預(yù)后判斷具有很大的應(yīng)用價(jià)值[5-6]。其中miR-138在許多癌癥的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。有研究報(bào)道，miR-138 在前列腺癌組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，主要通過調(diào)節(jié)叉頭框蛋白（forkhead box protein 1，F(xiàn)OXC1）表達(dá)抑制癌細(xì)胞增殖[7]；miR-138 在頭頸鱗狀細(xì)胞癌中異常表達(dá)，可抑制癌細(xì)胞侵襲，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[8]。此外，miR-149 在許多癌組織中呈低表達(dá)，在調(diào)節(jié)人類癌細(xì)胞增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程中起著重要作用[9]。有研究表明，miR-149可能對(duì)于NMIBC、結(jié)直腸癌、宮頸癌等均起到抑制作用[10-12]；miR-149 通過調(diào)節(jié)Ras 相關(guān)蛋白1抑制成神經(jīng)細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖[13]。本研究通過檢測(cè)miR-138和miR-149在NMIBC組織中的表達(dá)，分析兩者與NMIBC患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系，為NMIBC早期診斷和預(yù)后判斷提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集2013 年1 月至2015 年2 月在青海省西寧市第一人民醫(yī)院行手術(shù)治療的49 例NMIBC患者的癌組織及其癌旁組織。NMIBC患者中男40例，女9例；年齡38～87歲，中位年齡67歲；TNM分期：Ta期32例，T1期17例；腫瘤直徑＜3 cm 25 例，≥3 cm 24 例；有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移29 例，無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移20例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者27例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者22例。本研究已取得醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）法檢測(cè)組織中miR-138和miR-149表達(dá) 用Trizol提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，ABI 7500 型熒光定量PCR 儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR 條件：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s；60 ℃，1 min，共41 個(gè)循環(huán)，總體系為20 μL。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列如下：miR-138正向引物：5’-GCTGGTGTTGTGAATCAG-3’，反向引物：5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；miR-149正向引物：5’-TCTGGCTCCGTGTCTTC-3’，反向引物：5’-GAACATGTCTGCGTATCTC-3’；U6 正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。采用2-DDCT法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪 定期對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪方式為膀胱鏡復(fù)查，時(shí)間為患者被確診后的5年內(nèi)，每3個(gè)月復(fù)查一次，直至患者死亡或最后隨訪時(shí)間。統(tǒng)計(jì)患者術(shù)后生存時(shí)間和5年生存率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier 分析術(shù)后生存情況，生存率比較采用Log-rank 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-138 和miR-149的表達(dá)NMIBC患者癌組織miR-138、miR-149 相對(duì)表達(dá)量分別為0.31±0.11、0.51±0.08，低于癌旁組織的1.04±0.07、1.03±0.09（t=12.991、30.229，均P＜0.001）。

2.2 miR-138、miR-149 表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 miR-138和miR-149的表達(dá)水平在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NMIBC患者中明顯降低（P＜0.05），而在不同性別、腫瘤等級(jí)、TNM分期、腫瘤直徑的患者中的表達(dá)無明顯差異（P＞0.05），見表1。

表1 miR-138、miR-149表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

2.3 miR-138與miR-149表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 以miR-138中位數(shù)為分界線，將NMIBC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，中位數(shù)為0.22，高表達(dá)組24例、低表達(dá)組25例。高表達(dá)組和低表達(dá)組的5年生存率分別為87.50%（21/24）和68.00%（17/25），術(shù)后生存時(shí)間分別為（59.08±1.60）個(gè)月和（51.28±2.80）個(gè)月（Log-Rank χ2=11.231，P=0.001），見圖1A。以miR-149中位數(shù)為分界線，將NMIBC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，中位數(shù)為0.50，高表達(dá)組24例、低表達(dá)組25 例。高表達(dá)組和低表達(dá)組的5 年生存率分別為83.33%（20/24）和60.00%（15/25），術(shù)后生存時(shí)間分別為（56.96±1.87）個(gè)月和（50.56±2.64）個(gè)月（Log-Rank χ2=7.203，P=0.010），見圖1B。

圖1 miR-138與miR-149表達(dá)與患者預(yù)后的Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，是一種對(duì)患者的生命產(chǎn)生威脅的疾病。膀胱癌可分為NMIBC和肌層浸潤性膀胱癌，目前NMIBC的治療方式主要是經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)和術(shù)后膀胱內(nèi)灌注化療，但是在治療后一部分患者會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)的情況[1-3]，而復(fù)發(fā)對(duì)患者生存預(yù)后有極大影響。miR是一類非常重要的機(jī)體調(diào)控因子，成熟的miRNA 可以標(biāo)靶mRNA 的3’端非編譯區(qū)或者編譯區(qū)，從而沉默標(biāo)靶基因，并且在諸多病理生理過程中發(fā)揮著重要的生物調(diào)節(jié)作用[14-15]。研究表明，miR在肺癌、前列腺癌和乳腺癌等惡性腫瘤中存在異常表達(dá)，其表達(dá)與患者的病理特征有關(guān)[16-18]。miR-138作為腫瘤抑制因子，可通過靶向鋅指E 盒結(jié)合的同源盒蛋白2（zinc finger e-box binding homeobox 2，ZEB2）抑制膀胱癌細(xì)胞癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[19]；同時(shí)，膀胱癌中miR-138 表現(xiàn)為異常下調(diào)，與頭頸癌和甲狀腺癌中的觀察結(jié)果一致，其中miR-138 的下調(diào)與端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)的表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)[20]。此外，最近有研究發(fā)現(xiàn)，miR-138可能在非小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥的發(fā)展中發(fā)揮重要作用，是肌肉浸潤性膀胱癌中常用的關(guān)鍵藥物[21]。

本研究結(jié)果表明，NMIBC組織中miR-138相對(duì)表達(dá)量明顯低于癌旁組織，表明miR-138 有可能作為抑制性的miR 發(fā)揮作用，參與NMIBC 的發(fā)生和發(fā)展。這與Yang 等[20]發(fā)現(xiàn)在膀胱癌中miR-138 異常下調(diào)相一致。此外，miR-138 的表達(dá)水平與NMIBC腫瘤轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性特征相關(guān)聯(lián)，發(fā)生腫瘤高轉(zhuǎn)移和明顯淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的NMIBC患者癌組織中miR-138 的表達(dá)水平降低。同時(shí)，本研究對(duì)NMIBC 患者生存預(yù)后情況進(jìn)行分析顯示，NMIBC 患者中miR-138 表現(xiàn)為高表達(dá)時(shí)患者具有較長的術(shù)后生存時(shí)間和較高的術(shù)后生存率。表明組織中miR-138 的表達(dá)水平能夠體現(xiàn)NMIBC 患者的腫瘤治療情況，提示其可能成為NMIBC 患者預(yù)后預(yù)測(cè)的輔助指標(biāo)。

本研究結(jié)果還顯示，miR-149在NMIBC組織中的表達(dá)明顯低于癌旁組織，且與患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移存在一定關(guān)聯(lián)，miR-149 表達(dá)水平在發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的NMIBC 患者中明顯降低，這說明miR-149 在NMIBC 組織樣本中表達(dá)下調(diào)時(shí)，NMIBC 患者出現(xiàn)明顯的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，同時(shí)腫瘤較容易發(fā)生遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。miR-149 在許多癌癥中表現(xiàn)為低表達(dá)，在癌癥細(xì)胞的調(diào)節(jié)和腫瘤發(fā)生過程中發(fā)揮著重要作用[9]。有研究表明，miR-149-5p可以通過靶向Fas配體(FASLG)抑制急性髓系白血病細(xì)胞系THP-1的凋亡，進(jìn)而通過死亡結(jié)構(gòu)域(p-FADD)和caspase-2、caspase-3 和caspase-8 的啟動(dòng)對(duì)Fas 相關(guān)磷酸化形式產(chǎn)生負(fù)面影響[22]；另外有文獻(xiàn)報(bào)道，miR-149-5p的表達(dá)水平與多配體蛋白聚糖-1（syndecan-1，SDC-1)有關(guān)，SDC-1 是前列腺癌中沉默的4 種哺乳動(dòng)物肝素硫酸酯蛋白多糖之一[23]，SDC-1 的增加有利于細(xì)胞的存活[24]。同時(shí)，本研究結(jié)果表明，miR-149 在NMIBC發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮抑癌功能，預(yù)后結(jié)果顯示，NMIBC 患者中miR-149 出現(xiàn)高表達(dá)時(shí)，NMIBC患者具有更長的預(yù)后生存時(shí)間，表明其可以作為潛在的NMIBC預(yù)后判斷的生物標(biāo)志物。

綜上所述，miR-138 和miR-149 在NMIBC 的發(fā)生和發(fā)展過程中均表現(xiàn)為異常的低表達(dá)。二者高表達(dá)在NMIBC的腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮抑制功能，可以抑制NMIBC 的惡性進(jìn)展，同時(shí)，二者低表達(dá)水平與NMIBC 患者的不良生存預(yù)后相關(guān)，表明二者可作為NMIBC的潛在生物標(biāo)志物和潛在治療靶點(diǎn)。