姚 奇，周 茜，任東林，萬星陽△

（1.深圳市人民醫(yī)院肛腸外科，深圳 518020；2.中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院肛腸外科，廣州 510655）

胃癱綜合征（gastroparesis）是指在無明確機(jī)械性梗阻的情況下出現(xiàn)的胃排空延遲，主要癥狀包括腹脹、惡心嘔吐、過早的飽腹感，其中特發(fā)性胃癱（idiopathic gastroparesis，IG）占50%以上[1]。Cajal間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal,ICC）是一種特殊的間質(zhì)細(xì)胞，能夠產(chǎn)生生理慢波、控制胃腸道平滑肌的收縮和蠕動(dòng)，被認(rèn)為是胃腸道平滑肌的起搏細(xì)胞[2]。ICC 的表型或數(shù)量變化是多種胃腸動(dòng)力紊亂性疾病的主要因素，與IG 的發(fā)生密切相關(guān)[3]。胃腸道的ICC數(shù)量往往通過c-kit蛋白表達(dá)檢測(cè)來體現(xiàn)，c-kit 受體是胃腸道ICC 特異性標(biāo)志物[2,4-5]。中藥黃芪在胃癱中可發(fā)揮獨(dú)特的治療作用，并有研究表明，黃芪可通過刺激消化道ICC 的c-kit 表達(dá)，維持ICC的表型及數(shù)量穩(wěn)定[5-6]。本研究采用洛派丁胺構(gòu)建IG大鼠模型，經(jīng)黃芪甲苷灌胃處理后通過組織免疫熒光法檢測(cè)大鼠胃組織中c-kit的表達(dá)水平，評(píng)估其對(duì)ICC 數(shù)量及表型的影響，在動(dòng)物水平探究黃芪甲苷對(duì)IG的治療作用及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

24 只SPF 級(jí)Sprague Dawley（SD）雄性大鼠，年齡6～8 周，體重100～130 g，購于中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（粵）2016-0029。實(shí)驗(yàn)前穩(wěn)定飼養(yǎng)1周，控制動(dòng)物房溫度25 ℃，相對(duì)濕度50%，晝夜時(shí)間分明，不禁食、不禁水。

1.2 主要試劑與設(shè)備

黃芪甲苷（純度為98%，成都德斯特生物科技有限公司）用生理鹽水稀釋為73 mg/kg；CD117（ckit）兔單克隆抗體（14-1172-81，Introgen，美國）；山羊抗兔Cy3 熒光二抗（SA00009-1，Proteintech，湖北）；含40,6-二mid 基-2-苯基吲哚的熒光固定劑（ZLI-9557；ZSGB Bio，北京）；5%山羊血清封閉液（SL038，Solarbio，北京）；溫恒溫器（CM3050S；Leica Microsystems，Wetzlar，德國）；激光共聚焦掃描顯微鏡（TCS-SP8，徠卡系統(tǒng)顯微系統(tǒng)貿(mào)易有限公司，上海）。

1.3 構(gòu)建胃癱大鼠模型

將24 只健康的SPF 級(jí)SD 大鼠，隨機(jī)分為空白組、模型組、黃芪甲苷低劑量組和黃芪甲苷高劑量組，每組6只。除空白組外，其余各組均給大鼠灌胃10 mg/kg 洛派丁胺，連續(xù)5 d，構(gòu)建IG 模型，空白組等體積生理鹽水灌胃。造模5 d后，大鼠體重、進(jìn)食量明顯降低、活動(dòng)減少[5]，模型組繼續(xù)灌胃洛派丁胺混懸液，低劑量組和高劑量組在造模的同時(shí)分別給予32 mg/kg、64 mg/kg黃芪甲苷進(jìn)行治療，空白組給予等體積生理鹽水，連續(xù)5 d。

1.4 觀察指標(biāo)

記錄每日大鼠的精神狀態(tài)、體重、進(jìn)食量、飲水量。胃癱大鼠模型構(gòu)建效果通過胃排空率及胃重量評(píng)估。

1.4.1 酚紅胃排空測(cè)定及胃稱重 大鼠取材前禁食12 h，期間自由飲水。隨機(jī)每組選擇3 只大鼠，0.05%的酚紅溶液以500 μL/只的體積灌胃，30 min后水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈放血處死大鼠，立即取全胃稱重。胃浸泡于5 mL氫氧化鈉溶液和0.5 mL 三氯乙酸溶液中，3 000 r/min 的速度勻漿20 min，取上清液1 mL 加入4 mL 的氫氧化鈉溶液中，分光光度計(jì)測(cè)定胃排空值：

胃排空率（%）=（1-X/Y）×100

X：胃內(nèi)殘留酚紅溶液的吸光度

Y：酚紅與氫氧化鈉混合溶液的吸光度

1.4.2 胃組織結(jié)構(gòu)觀察及蘇木精―伊紅（HE）染色 隨機(jī)每組取3只大鼠，處死大鼠并解剖，自賁門上1 cm至幽門下1 cm，取全胃，組織分為兩份，一份固定于10%福爾馬林中，分級(jí)酒精脫水，石蠟包埋，一份冰凍于-80 ℃冰箱。切片厚度3～5 μm，切片置于載玻片上，脫蠟后用蘇木精、伊紅染色，用中性樹脂封片，蓋上蓋玻片，觀察組織形態(tài)。

1.4.3 組織免疫熒光染色 60 ℃烘箱內(nèi)烤片1 h，依次向石蠟切片放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ、95%酒精、85%酒精、75%酒精內(nèi)洗去多余石蠟。以檸檬酸鈉抗原修復(fù)液修復(fù)抗原，將0.3% Trition 和0.1% Tween 溶于PBS，通透細(xì)胞膜。25°C 環(huán)境下用5%山羊血清封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)1 h，將標(biāo)本在4 ℃下與c-kit 一抗（1∶200）稀釋液孵育過夜，然后與Cy3 偶聯(lián)的山羊抗兔熒光二抗（1∶300）稀釋液孵育。在25 ℃的黑暗環(huán)境中放置1 h，PBS 清洗3 次后DAPI 孵育20 min。樣品用熒光固定劑固定，并在激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察并拍照記錄。通過Image J軟件進(jìn)行熒光半定量，每組平均單位熒光密度使用GraphPad Prim6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4.4 蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn) 冰凍大鼠胃組織解凍后除去黏膜部分，取胃固有肌層研磨、勻漿，加入RIPA 裂解液提取蛋白后定量蛋白濃度，SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)印至PVDF 膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h 后孵育一抗（1∶1 000）稀釋液，置于4 ℃冰箱過夜，第2 天孵育相應(yīng)的二抗（1∶5 000）稀釋液1 h后進(jìn)行ECL（Pierce）孵育后顯影。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0 統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對(duì)胃癱大鼠胃重量及胃排空率的影響

大鼠造模第5 天，模型組和黃芪甲苷各劑量組小鼠可見飲水量和飲食量較空白組略微下降，但無明顯差異，各組大鼠的精神狀態(tài)也無明顯差異（均P＞0.05）。予黃芪甲苷干預(yù)5 d后取材可見，模型組胃重量對(duì)比空白組明顯增加，排空率顯著下降，模型構(gòu)建成功。與模型組比較，黃芪甲苷高劑量組胃重量較模型組明顯下降，胃排空率明顯上升（P＜0.05），而黃芪甲苷低劑量組胃重量與排空率與模型組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 各組胃重量及胃排空率比較

表1 各組胃重量及胃排空率比較

與模型組比較，*P＜0.05。

2.2 胃癱大鼠模型胃組織結(jié)構(gòu)及Cajal細(xì)胞形態(tài)及分布

HE 染色可見黃芪甲苷可減輕胃癱大鼠胃組織中的炎性細(xì)胞浸潤，減輕固有肌層的水腫、增厚。組織免疫熒光法染色后于熒光顯微鏡下觀察，c-kit表達(dá)集中于黏膜層和固有肌層（圖1A）。黏膜肌層多為圓形、環(huán)細(xì)胞核紅染，可識(shí)別為肥大細(xì)胞。Cajal 細(xì)胞多位于固有肌層，空白組Cajal 細(xì)胞形態(tài)與實(shí)驗(yàn)組類似，單個(gè)細(xì)胞呈梭狀形態(tài)，環(huán)細(xì)胞核紅染，多個(gè)細(xì)胞呈網(wǎng)狀交織分布，緊密環(huán)繞神經(jīng)節(jié)。模型組c-kit 熒光強(qiáng)度明顯降低，Cajal 細(xì)胞數(shù)量減少，形態(tài)邊緣圓鈍，少見交叉相連（圖1B）。

圖1 胃癱大鼠模型胃組織結(jié)構(gòu)及Cajal細(xì)胞形態(tài)及分布

2.3 黃芪甲苷對(duì)大鼠胃組織中Cajal細(xì)胞的影響

通過Image J 軟件對(duì)組織免疫熒光染色進(jìn)行熒光半定量統(tǒng)計(jì)，平均每個(gè)200×視野下固有肌層c-kit熒光強(qiáng)度比較，結(jié)果表明，與空白組比較，模型組平均熒光強(qiáng)度明顯下降（0.313±0.071vs0.532±0.084，P=0.016）；與模型組比較，高劑量組顯著回升（0.487±0.034vs0.313±0.071，P=0.049），而空白組無明顯差異（0.487±0.034vs0.532±0.084，P=0.631），低劑量組也無明顯差異（0.314±0.065vs0.313±0.071，P=0.999）。通過免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組大鼠胃固有肌層組織內(nèi)c-kit表達(dá)量，空白組平均c-kit表達(dá)最高，胃癱模型組c-kit 表達(dá)量明顯下降，黃芪甲苷可部分回調(diào)c-kit表達(dá)量，維持ICC表面c-kit的穩(wěn)定表達(dá)（圖2）。

圖2 黃芪甲苷對(duì)胃癱大鼠胃組織ICC改變的影響

3 討論

目前，IG最常用的治療方式為控制熱量及營養(yǎng)攝入等生活習(xí)慣調(diào)節(jié)，促胃動(dòng)力劑、止吐藥劑神經(jīng)調(diào)節(jié)劑等藥物及在癥狀較為嚴(yán)重的情況下采用手術(shù)治療。研究報(bào)道，僅有約2%的胃癱患者嚴(yán)格遵從飲食調(diào)節(jié)建議，藥物使用也受肝臟、腎臟損害等副作用局限，IG 的治療效果差強(qiáng)人意，漫長而反復(fù)的治療過程對(duì)IG 患者的身心健康和生活質(zhì)量都造成了較大的影響[6]。而中醫(yī)藥中許多復(fù)方制劑和針灸療法治療胃癱綜合征歷史悠久且具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，在臨床應(yīng)用中取得了良好的效果[7-8]。然而，IG發(fā)病的機(jī)制十分復(fù)雜，中藥促胃動(dòng)力的機(jī)制涉及胃腸運(yùn)動(dòng)的幾乎所有的調(diào)節(jié)環(huán)節(jié)和因素，其作用機(jī)制并不明了。因此，本研究擬從傳統(tǒng)中草藥寶庫中挖掘治療胃癱的新型藥物，并探討其治療IG的潛在機(jī)制。

中醫(yī)認(rèn)為，胃癱屬于“嘔吐”、“反胃”的范疇，主要由于胃失和降、氣逆于上引起，其中醫(yī)辨證主要包括脾胃虛弱、脾腎陽虛及胃陰不足。IG多為胃氣不足、功能減退的病理變化，因飲食不節(jié)、損傷胃氣，或素體虛弱、久病胃氣不復(fù)等所致。黃芪為豆科植物，主要藥理作用是“益氣固表”。黃芪用于治療胃癱綜合征歷史悠久，《傷寒雜病論》中提到，黃芪建中湯、防己黃芪湯、烏頭湯等黃芪類經(jīng)方可用于胃癱綜合征，并經(jīng)研究證實(shí)[9]。ICC 的表達(dá)對(duì)胃癱、便秘等胃腸紊亂型疾病的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生了重要影響，胃癱患者或動(dòng)物模型中均可見ICC 的數(shù)量顯著減少或表型改變。據(jù)報(bào)道，黃芪可增強(qiáng)肌條的收縮幅度，能使糖尿病性胃輕癱大鼠胃組織中ICC 形態(tài)和數(shù)量向正常轉(zhuǎn)化，使c-kit mRNA的表達(dá)數(shù)量增多[10]。這些研究表明，黃芪復(fù)方藥方可通過保護(hù)結(jié)腸ICC促進(jìn)胃動(dòng)力，治療IG，但其復(fù)方成分復(fù)雜，經(jīng)機(jī)體吸收、代謝后發(fā)揮治療作用的成分并不明確。隨著提取、純化技術(shù)的逐漸成熟，黃芪皂苷的成分之一，黃芪甲苷被認(rèn)為是黃芪皂苷中生物利用度最高的成分，黃芪甲苷或許是黃芪改善胃癱癥狀的關(guān)鍵[11]。

本研究結(jié)果顯示，造模后模型組排空率顯著下降，已成功構(gòu)建胃癱大鼠模型。實(shí)驗(yàn)組使用黃芪甲苷處理后，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可減少胃重量、增加胃癱大鼠胃排空率（P＜0.05）。組織免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果顯示，不同組中c-kit陽性細(xì)胞主要分布于黏膜層及固有肌層。根據(jù)c-kit 染色特性及細(xì)胞的形態(tài)可基本判斷，黏膜層中呈橢圓形的c-kit陽性細(xì)胞為肥大細(xì)胞，ICC表現(xiàn)為多突觸的梭形結(jié)構(gòu)，相鄰ICC互相交織呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，集中分布于胃固有肌層。而模型組中，Cajal 細(xì)胞形態(tài)邊緣圓鈍，細(xì)胞之間少見交叉相連。熒光強(qiáng)度分析及蛋白質(zhì)免疫印跡可見，模型組固有肌層中的c-kit 表達(dá)量，較對(duì)照組明顯下降，黃芪甲苷可顯著增加胃固有肌層中的c-kit表達(dá)（P＜0.05）。c-kit是位于5號(hào)染色體位點(diǎn)上的原癌基因，它編碼kit受體（即CD117），是一種酪氨酸蛋白激酶受體，可被ICC 廣泛表達(dá)并通過與其天然配體干細(xì)胞因子（stem cell factor，SCF）結(jié)合，調(diào)控MAPK、Wnt、NF-κB 等信號(hào)通路，決定著細(xì)胞的表型及分化，被認(rèn)為是胃腸道ICC 的特異性標(biāo)志物[12]。研究大量研究表明，便秘、腸易激綜合征等胃腸動(dòng)力紊亂疾病中，c-kit陽性細(xì)胞顯著降低，ICC的表型及數(shù)量在維持一定胃腸動(dòng)力中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[13]。c-kit 表達(dá)增高可促進(jìn)細(xì)胞增殖，c-kit 的缺失可導(dǎo)致ICC 失去釋放慢波的特性，逐漸分化為平滑肌細(xì)胞[14]。并且，當(dāng)c-kit刺激增加，ICC向肌細(xì)胞分化的過程可被一定程度上逆轉(zhuǎn)，這種ICC 與肌細(xì)胞之間的雙向分化作用或是胃腸動(dòng)力紊亂治療的關(guān)鍵，尋找能夠維持ICC細(xì)胞c-kit表達(dá)的治療手段是本研究的主要目的。

總之，本研究通過動(dòng)物建模觀察黃芪甲苷的促胃動(dòng)力作用、胃組織病理結(jié)構(gòu)及c-kit陽性細(xì)胞的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷可促進(jìn)ICC表達(dá)c-kit，一定程度上逆轉(zhuǎn)ICC 向肌細(xì)胞分化的趨勢(shì)，使胃癱大鼠胃組織中總體c-kit表達(dá)上升，明顯增加了固有肌層中c-kit陽性細(xì)胞的數(shù)量，增加胃排空率，從而改善IG 癥狀。黃芪甲苷可有效促進(jìn)胃動(dòng)力，或可成為IG治療的新型單體藥物。