劉雅琳

DNA是絕大多數(shù)生物的遺傳信息載體，能從分子層面反映生物個(gè)體之間的差異。通過(guò)深度挖掘古代材料中的DNA信息，可以了解生物群體的歷史演變情況，也能探究生物類群之間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。但由于古DNA難以長(zhǎng)久保存，內(nèi)源DNA含量低（獲得的DNA絕大部分是外源的微生物DNA），且容易受到污染（主要指出土后現(xiàn)在生活人的接觸造成的污染），所以從化石中獲取屬于研究對(duì)象的內(nèi)源古DNA并進(jìn)行深入分析研究非常困難。但也存在極個(gè)別由于保存環(huán)境理想，樣本可能保留了微量?jī)?nèi)源DNA的情況，這些材料給研究古DNA提供了機(jī)會(huì)。隨著技術(shù)手段的不斷提高，科學(xué)家已能從這些保存良好的材料中獲取極微量的古DNA片段。再利用生物信息學(xué)技術(shù)，將高度破碎化的DNA片段信息進(jìn)行拼接，從而獲得古代樣本中的遺傳信息，使我們能夠回溯到樣本生存的年代，以更廣闊的視角來(lái)分析人、動(dòng)植物，甚至于微生物的遺傳歷史。

古DNA研究簡(jiǎn)史

分子克隆技術(shù)、聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)相繼誕生之后，很快被引入古DNA研究中，許多學(xué)者試圖從博物館樣本、洞穴沉積物和永久凍土保存的古代動(dòng)植物，以及古人類材料中獲取DNA。1984年，希古奇（R. Higuchi）等獲取了已滅絕動(dòng)物斑驢的線粒體DNA序列片段，這是國(guó)際公認(rèn)的古DNA研究開(kāi)端[1]。然而，由于當(dāng)時(shí)的技術(shù)和對(duì)古DNA特征認(rèn)識(shí)的不足，早期研究中獲得的古DNA大多是來(lái)自外界的污染，且大部分結(jié)果不可重復(fù)。探索過(guò)程中，科學(xué)家逐漸積累了經(jīng)驗(yàn)，不斷改進(jìn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，為后來(lái)的研究發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。

隨著研究的深入，科學(xué)家們開(kāi)始意識(shí)到，對(duì)于高度降解的古DNA來(lái)說(shuō)，規(guī)范的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)十分重要，否則實(shí)驗(yàn)結(jié)果將由于污染而不可重復(fù)。隨著古DNA提取方法的改進(jìn)，以及研究標(biāo)準(zhǔn)的建立和完善，古DNA研究正式進(jìn)入可重復(fù)的階段。這一階段研究的對(duì)象側(cè)重于含量相對(duì)豐富的線粒體DNA片段或者少量核基因序列。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始進(jìn)行相關(guān)方面的嘗試，推動(dòng)了這一新興研究方向的快速發(fā)展。然而，由于PCR技術(shù)很難正確擴(kuò)增含量極低的內(nèi)源DNA片段，導(dǎo)致部分古DNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果仍然不可重復(fù)，所以針對(duì)人類的古DNA研究方法在該階段依舊受到極大的質(zhì)疑[2]。

隨著二代測(cè)序技術(shù)的誕生，古DNA研究迎來(lái)了高速發(fā)展的時(shí)代。由于二代測(cè)序技術(shù)能夠得到極短的DNA片段信息（這與古DNA的特征相似），所以實(shí)驗(yàn)人員可以進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)生物信息技術(shù)進(jìn)行拼接，來(lái)獲得可靠的古DNA數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)方法也在這一階段不斷被革新，2010年拉斯馬森（M. Rasmussen）等報(bào)道了4000多年前的愛(ài)斯基摩人基因組[2]，格林（R. E.Green）等依據(jù)3個(gè)尼安德特人樣品繪制了尼安德特人的基因組草圖[2]。隨后，越來(lái)越多的古人類基因組被公布出來(lái)，如丹尼索瓦人、早期現(xiàn)代人（包括田園洞人、Ust’-Ishim和Oase 1）等[3]，研究也逐漸深入化和多元化。這些研究共同推動(dòng)了古人類DNA研究不斷前進(jìn)，為古人類遷徙路線及人群間基因交流的探索提供了遺傳學(xué)支持。

古DNA研究難點(diǎn)

獲取合適的材料是開(kāi)展古DNA研究的第一個(gè)難點(diǎn)。古代材料由于距今年代久遠(yuǎn)，絕大部分已經(jīng)完全降解，保存良好的樣品十分稀少。例如，在中國(guó)南方溫暖潮濕的氣候條件下，很難發(fā)現(xiàn)保存良好的樣本。

其次，古樣本中內(nèi)源DNA含量極低，獲取它們十分困難。內(nèi)源DNA與環(huán)境中的微生物DNA混雜在一起，由于提取出的總DNA中，大部分是外源雜質(zhì)DNA，內(nèi)源DNA的比例非常低。即便是質(zhì)量相對(duì)較好的樣品，也難以提取出足量的DNA，所以，有時(shí)候需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能得到足夠用于分析的DNA信息。研究人員需要在混雜的DNA中，將含量極少的內(nèi)源DNA分離出來(lái)，并進(jìn)行研究。例如，第一個(gè)尼安德特人基因組草圖是通過(guò)1%—5%的內(nèi)源DNA重建的[4]。因此，科學(xué)家一直關(guān)注如何更好地將外源與內(nèi)源DNA分離開(kāi)來(lái)，如何降低外源雜質(zhì)的影響等問(wèn)題。

再次，古DNA還容易在獲取時(shí)遭受到出土后現(xiàn)在生活人的接觸造成的污染。任何形式的接觸都可能將操作人員的DNA帶入樣品中，進(jìn)而對(duì)內(nèi)源DNA造成污染。因此，古DNA的提取要在古DNA超凈實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)人員需全身防護(hù)。但即便是在超凈室內(nèi)、防護(hù)設(shè)備齊全與操作規(guī)范的前提下，也不能完全避免實(shí)驗(yàn)中的污染，所以這就要求研究人員在每一步都要建立空白對(duì)照，最終獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)的污染評(píng)估。

另外，DNA損傷也是古DNA研究面臨的關(guān)鍵問(wèn)題之一。DNA損傷是一種正常的生命現(xiàn)象，時(shí)刻在生物體內(nèi)發(fā)生，生物對(duì)其也有一套完善的修復(fù)機(jī)制，但是這種機(jī)制隨著生物的死亡而停止工作。DNA損傷程度與時(shí)間、溫度、酸堿度、濕度等因素有關(guān)，在寒冷干燥環(huán)境中保存的DNA損傷程度會(huì)小一些。生物死后的DNA損傷會(huì)導(dǎo)致DNA高度碎片化，且會(huì)帶來(lái)編碼錯(cuò)誤，直接影響DNA測(cè)序的質(zhì)量。

為了克服以上困難，研究人員提出了許多在實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)中的優(yōu)化方案，比如在發(fā)掘和實(shí)驗(yàn)過(guò)程中嚴(yán)格遵守操作流程，使用特殊的酶對(duì)古DNA片段進(jìn)行損傷修復(fù)等。新的古DNA捕獲技術(shù)是其中一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)，該技術(shù)大致分以下幾步：誘餌設(shè)計(jì)（能夠特異性識(shí)別古DNA的探針與磁珠相連形成誘餌）、總DNA獲取、文庫(kù)制備、雜交捕獲、雜質(zhì)DNA片段清除、高通量測(cè)序[5]。我們利用這一技術(shù)，將4萬(wàn)年前田園洞人的內(nèi)源DNA含量，從捕獲前的不足0.03%提高到捕獲后的46.8%[6]。同時(shí)，新古DNA捕獲技術(shù)也可用于對(duì)內(nèi)源DNA含量極低的樣本開(kāi)展研究。除此以外，古DNA單鏈文庫(kù)的構(gòu)建同樣是關(guān)鍵技術(shù)之一。采用新型的古DNA單鏈文庫(kù)技術(shù)，能夠獲取古樣品中單鏈DNA片段的信息，極大地提高古DNA片段的來(lái)源。針對(duì)古DNA特點(diǎn)開(kāi)發(fā)的提取、文庫(kù)構(gòu)建、古DNA捕獲和測(cè)序等技術(shù)，推動(dòng)了古DNA研究的高速發(fā)展。

古DNA技術(shù)的重要意義

古DNA技術(shù)在諸多方面發(fā)揮了重要作用，已經(jīng)幫助我們回答了以下問(wèn)題：繪制了已滅絕的古老型人類（尼安德特人、丹尼索瓦人）基因草圖，并說(shuō)明古老型人類與非洲以外現(xiàn)代人之間存在基因上的相互影響[3]；現(xiàn)代人祖先走出非洲并非只有一條遷徙路線[7]；中國(guó)南北方古人群早在9500年前已經(jīng)分化，至少在8300年前，南北人群融合與文化交流的進(jìn)程即已開(kāi)始，4800年前出現(xiàn)強(qiáng)化趨勢(shì)，至今仍在延續(xù)[8]。

古DNA研究不僅能夠?yàn)槲覀兓卮鹨陨先祟惢蚪涣骱瓦w徙的問(wèn)題，還在人類健康等方面具有重要意義。古人類基因貢獻(xiàn)對(duì)現(xiàn)代人在適應(yīng)環(huán)境和健康方面產(chǎn)生影響：現(xiàn)代人基因組中含有大量源自尼安德特人的能影響角蛋白合成的基因，從而能較快地適應(yīng)歐亞大陸較冷的環(huán)境；幫助藏族人適應(yīng)極高海拔環(huán)境的EPAS1基因，很有可能與丹尼索瓦人有關(guān)[3]。除了對(duì)人類自身DNA研究外，對(duì)古人類牙結(jié)石中保留的微生物DNA的研究，也能從進(jìn)化角度揭示了飲食變化對(duì)人類健康狀況造成的影響[9]。另外，古DNA研究已經(jīng)成功應(yīng)用于考古遺址出土沉積物中的生物古DNA信息的獲取，最近發(fā)表的有關(guān)白石崖溶洞遺址的沉積物DNA分析，為丹尼索瓦人在此長(zhǎng)期生存的推斷提供了重要證據(jù)[10]。

結(jié) 語(yǔ)

隨著技術(shù)的發(fā)展，古DNA研究實(shí)現(xiàn)了從片段到基因組的突破。而針對(duì)那些古DNA特有的難題，科學(xué)家們又推出了一系列對(duì)策，如控制污染、建立文庫(kù)、基因捕獲、鑒別內(nèi)源DNA等。

隨著古DNA技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，希望未來(lái)能夠從更大時(shí)間與空間尺度的樣本中獲取古DNA，如特別古老的樣本、炎熱環(huán)境中保存較差的樣本、外源污染多的樣本與各類環(huán)境沉積物樣本等。古DNA研究集中了考古學(xué)、遺傳學(xué)和生物信息學(xué)等多個(gè)研究領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)，致力于各學(xué)科合作還原重大事件的源起，同時(shí)古DNA研究的發(fā)展也推動(dòng)了各學(xué)科自身的進(jìn)步。

[1]Higuchi R， Bowman B， Freiberger M， et al. DNA sequences from the quagga， an extinct member of the horse family. Nature， 1984， 312（5991）： 282-284.

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[10]Zhang D， Xia H， Chen F， et al. Denisovan DNA in Late Pleistocene sediments from Baishiya Karst Cave on the Tibetan Plateau. Science， 2020， 370（6516）： 584-587.

關(guān)鍵詞：古DNA技術(shù) 研究歷史 研究難點(diǎn) ■