柯 帥,王文波,廖紅展,彭志柱,邱縣生,唐慧敏,李清華,夏學巍

(桂林醫(yī)學院 附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科，廣西 桂林 541000)

多型性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)又稱為膠質(zhì)母細胞瘤，是最常見也最具侵襲性的原發(fā)惡性腦腫瘤。經(jīng)過標準化治療后的膠質(zhì)母細胞瘤患者，中位總生存期為14.6個月，診斷為膠質(zhì)母細胞瘤就預示了患者的不良預后[1]。由于其低存活率、短生存期、高復發(fā)的特點，讓膠質(zhì)母細胞瘤已經(jīng)成為令人聞風喪膽的可怕疾病[2]。傳統(tǒng)的手術(shù)聯(lián)合術(shù)后大劑量放化療的治療方案無法有效提高膠質(zhì)母細胞瘤患者的生存時間，保障患者預后[3]。因此，針對膠質(zhì)母細胞瘤藥物治療靶點的研究成為全世界研究者們臻待解決的問題。

1986年， Renato Dulbecco首次提出全基因組測序的概念，為全世界癌癥研究點亮了一束光[4]。通過生物信息手段，分析不同個體基因組間的結(jié)構(gòu)差異，同時完成SNP及基因組結(jié)構(gòu)注釋，可以由宏觀到微觀來認識惡性腫瘤的發(fā)生機制[5]。Cameron W. Brennan等提出在一個統(tǒng)計支持的隊列中，系統(tǒng)的基因組分析可以定義核心生物學通路的概念，以此來促進在分子層面上對膠質(zhì)母細胞瘤的了解[6]。全面闡明膠質(zhì)母細胞瘤中的基因變化可以提供新的靶點，達到診斷、預后預測和治療的目的，基因組學亞型的確定，更可以將膠質(zhì)母細胞瘤類型細化，進行分類診療。從最開始的基因組學亞分型研究，到藥物靶點的確定，再到目前藥物通過血腦屏障、藥物載體的研發(fā)，針對膠質(zhì)母細胞瘤的研究一直沒有間斷過[7]。但是，即便如此，影響膠質(zhì)母細胞瘤疾病進展的因素和作用機制，仍然是困擾研究者們的難題。

在轉(zhuǎn)錄水平分析膠質(zhì)母細胞瘤的基因表達水平，試圖尋找一個新的標記物，有利于從分子層面了解膠質(zhì)母細胞瘤。數(shù)據(jù)均來自TCGA(the Cancer Genome Atlas，https://cancergenome.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫。在TCGA數(shù)據(jù)庫中搜索膠質(zhì)母細胞瘤mRNA樣本，經(jīng)過仔細篩查，從中選取符合研究標準的樣本集，其中共有膠質(zhì)母細胞瘤169例和正常腦組織5例，隨之進行差異基因的篩選。將篩選出來的差異基因利用GO(Gene Ontology)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes pathway enrichment analysis)富集分析進行功能注解。然后，通過構(gòu)建差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)篩選出連通性最高的核心基因。最后，利用Kaplan-Meier法對各個核心基因進行生存分析，從而獲得與膠質(zhì)母細胞瘤生存時間相關(guān)的核心基因KCNAB2。

1 材料與方法

1.1 篩選差異基因

膠質(zhì)母細胞瘤樣本均來自TCGA，下載腫瘤樣本和正常對照樣本的mRNA表達數(shù)據(jù)。將基因的表達量轉(zhuǎn)換為數(shù)值，對重復的基因取平均值并過濾表達量低的基因，然后構(gòu)建設(shè)計矩陣和對比矩陣，計算標準化因子，估計散度，隨后對兩組數(shù)據(jù)間進行雙馬尾檢驗，矯正p值，導出基因。根據(jù)所獲得的各個基因的p值及l(fā)ogFC值篩選差異基因。以上計算均依靠R軟件(R 3.5.2)進行。

1.2 GO和KEGG富集分析

GO富集分析是一種常用的基因功能分析方法，通過將數(shù)量龐大的基因按照生物學進程、分子功能、細胞組分進行聚類富集調(diào)查的方法，對基因功能進行注解。KEGG富集分析是一種現(xiàn)在廣泛使用的系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細胞中代謝途徑及基因產(chǎn)物功能的分析方法。KEGG可以將基因按照所在的生物學通路進行富集調(diào)查，從而對目標基因做進一步注解[8]。利用DAVID (https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)工具[9]對差異基因進行注解和探索。

1.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和篩選核心基因

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(Protein-protein Interaction，PPI)是由單個蛋白間的相互作用關(guān)系連接而成，蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建可以幫助我們了解疾病狀態(tài)下生物信號、能量代謝以及蛋白之間的功能聯(lián)系[13]。利用STRING(The search tool for the retrieval of interacting genes，https://string-db.org/)平臺分析差異基因的蛋白互作信息。將蛋白互作網(wǎng)絡(luò)導入cytoscape軟件，制作蛋白互作網(wǎng)絡(luò)鳥瞰圖。利用cytohubba計算各差異基因之間連通性得分，得分高的選定為核心基因。鑒于BottleNeck在大數(shù)量基因數(shù)據(jù)計算時具有更好的表現(xiàn),并且，BottleNeck算法得到的核心基因(Hub-bottlenecks)更傾向于神經(jīng)信號轉(zhuǎn)導通路，BottleNeck得分被選用來選取核心基因[10]。

1.4 ONCOMINE

ONCOMINE(https://www.oncomine.org/)被用來對所獲得的核心基因進行進一步差異分析。ONCOMINE癌基因芯片數(shù)據(jù)挖掘平臺是目前世界上最大的癌基因芯片數(shù)據(jù)庫和整合數(shù)據(jù)挖掘平臺，可用于比較主要癌癥類型和各自正常組織的差異表達分析，進行一個或多個基因的查詢[11]。 借助已有的研究，綜合回顧、分析核心基因在各個探針中的表達情況。

1.5 生存分析

為探索核心基因與膠質(zhì)母細胞瘤患者生存時間的聯(lián)系，評估核心基因?qū)δz熱質(zhì)母細胞瘤患者生存時間的影響，利用患者的生存數(shù)據(jù)進行生存分析。將核心基因表達量的改變與膠質(zhì)母細胞瘤患者的生存時間和生存幾率的關(guān)系繪制為生存曲線，計算p值，p值<0.05為具有統(tǒng)計學的生存曲線。

2 結(jié)果分析

2.1 差異基因

從TCGA中下載獲取膠質(zhì)母細胞瘤轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)169例，正常對照腦組織標本5例，基因17 848個。共獲得差異基因3 183個，上調(diào)基因1 582個，下調(diào)基因1 601個，所獲結(jié)果可視化為熱圖(見圖1)。

2.2 GO和KEGG富集分析

表1 GO富集分析結(jié)果Table 1 Results of GO enrichment analysis

*注： BP: Biological process生物學進程; CC:Cellular component細胞組分; MF:Molecular function分子功能。

表2 KEGG富集分析結(jié)果Table 2 Results of KEGG enrichment analysis

2.3 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)和篩選核心基因

利用STRING得到的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，共有1 951個節(jié)點，6 967條邊(見圖2)。將結(jié)果導入cytoscape。利用cytohubba對差異基因連通性進行計算，將BottleNeck得分前十的差異基因選定為核心基因，得分第一為HIST1H2BH(Histone Cluster 1 H2B Family Member H)，BottleNeck得分64分，得分第二為AR(Androgen Receptor)，BottleNeck得分54分。KCNAB2(Potassium Voltage-Gated Channel Subfamily A Regulatory Beta Subunit 2)排在第九位，BottleNeck得分26分。在后續(xù)的生存分析中，發(fā)現(xiàn)只有AR與KCNAB2與膠質(zhì)母細胞瘤患者生存時間存在統(tǒng)計學意義的相關(guān)性，因此將研究重點放在尚未被驗證過的KCNAB2基因上。

圖1 差異基因分布熱圖Fig.1 DEGs distribution heatmap

注：X軸代表TCGA樣本號，Y軸代表基因名。黑色代表非差異基因，紅色代表上調(diào)差異基因，黃色代表下調(diào)差異基因。由于基因數(shù)量巨大，只在Y軸顯示部分不同表達量的基因。

圖2 差異基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)鳥瞰圖 Fig.2 Bird’s eye view of protein-protein interaction network

注：圖中共有1 951個節(jié)點，6 967條邊。

2.4 ONCOMINE聯(lián)合分析

將KCNAB2基因?qū)隣NCOMINE，各研究中KCNAB2表達量箱線圖輸出結(jié)果見圖3，結(jié)果提示KCNAB2在各個研究的不同探針結(jié)果里均存在不同程度的低表達。綜合三個已有的研究進行meta分析。meta分析的結(jié)果提示，在Bredel Brain2的研究中KCNAB2的低表達程度最顯著，綜合分析的p值為2.67X10-10。

圖3 ONCOMINE聯(lián)合分析結(jié)果Fig.3 Result of ONCOMINE analysis

Fig.3 Result of ONCOMINE analysis

注：KCNAB2在不同探針下的表達量，x軸的1代表KCNAB2在正常腦組織中的表達量，2代表KCNAB2在GBM中的表達量。(a)中p值1.28X10-10，F(xiàn)C值-7.957；(b)中p值0.016，F(xiàn)C值-2.264；(c)中p值2.67X10-10，F(xiàn)C值-9.866；(d)中p值2.72X10-7，F(xiàn)C值-3.100；(e)中p值7.6 X10-14，F(xiàn)C值-6.271；(f)中p值8.56X10-10，F(xiàn)C值-7.526。

2.5 生存分析

利用Rstudio將168例膠質(zhì)母細胞瘤樣本的基因表達信息與生存信息進行匹配，繪制核心基因生存曲線，其中只有KCNAB2和AR具有統(tǒng)計學意義，結(jié)果可視化輸出見圖4。

圖4 AR和KCNAB2的存活曲線Fig.4 Survival curves of AR and KCNAB2

注：x軸為存活時間(d)，y軸為存活率，紅色曲線代表基因的高表達，綠色曲線代表基因的低表達。

與膠質(zhì)母細胞瘤生存相關(guān)的核心基因主要為AR和KCNAB2。AR基因最早在前列腺癌的研究中被發(fā)現(xiàn)，在Zalcman,N等的文獻里已經(jīng)證實其可作為膠質(zhì)母細胞瘤的一個重要化學藥物治療靶點，AR的表達沉默可以導致膠質(zhì)母細胞瘤的細胞活力降低；在細胞系中，AR的沉默會導致膠質(zhì)母細胞瘤細胞在體內(nèi)和體外的凋亡[12-13]。KCNAB2膠質(zhì)母細胞瘤的表達差異關(guān)系及對患者生存時間的影響均為首次提出，通過分析KCNAB2的生存曲線可以發(fā)現(xiàn)，KCNAB2過表達時膠質(zhì)母細胞瘤患者表現(xiàn)出更低的生存率。這提示我們，在膠質(zhì)母細胞瘤中存在著一條KCNAB2相關(guān)的作用機制，可以影響膠質(zhì)母細胞瘤患者的生存率。

3 討 論

腦膠質(zhì)瘤來源于神經(jīng)上皮細胞，占顱腦腫瘤的40%～50%，是最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤。多型性膠質(zhì)母細胞瘤又稱為膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)，由星形膠質(zhì)瘤惡變而來,占全部顱腦腫瘤的10.2%[14]。是成人最常見也最具侵襲性的惡性顱腦腫瘤，grade IV級[15]。膠質(zhì)母細胞瘤患者中位生存期僅為12～16個月，5年生存率不足5%[16]，診斷為膠質(zhì)母細胞瘤就預示了患者的不良預后[17]。目前，針對膠質(zhì)母細胞瘤的方案，主要是手術(shù)聯(lián)合術(shù)后大劑量放療和化療，盡管近年來，手術(shù)、放療和化療的綜合治療手段得到了長足的發(fā)展，但是膠質(zhì)母細胞瘤的預后仍取決于首次手術(shù)切除程度。膠質(zhì)母細胞瘤具有浸潤性生長的特性，這使得手術(shù)完全切除腫瘤組織成為幾乎不可能的事情[18]。隨著分子生物學的飛速發(fā)展，針對膠質(zhì)母細胞瘤的基因治療被全世界的研究者寄予厚望，基因治療有望在膠質(zhì)母細胞瘤患者中取得良好的治療效果，甚至最終治愈這一可怕疾病。

篩選得到的十個核心基因分別是：HIST1H2BH、AR、SNAP25、VAMP2、GNAI1、TP53、CDK1、DYNC1I1,KCNAB2 andSLC04C1。相較于正常腦組織，SNAP25、VAMP2、GNAI1、DYNC1I1、KCNAB2，SLC04C1在膠質(zhì)母細胞瘤中低表達，而HIST1H2BH、AR、TP53、CDK1在膠質(zhì)母細胞瘤中高表達。

離子通道基因KCNAB2，別名AKR6A5、HKvbeta2、HKvbeta2.1、HKvbeta2.2、KCNA2B，KV-BETA-2。編碼電壓門控K+通道β亞單位蛋白Kvb2，位于1號染色體1p36區(qū)域。1p36缺失綜合征的患者，在受精卵形成時，由于該染色體片段的缺失，導致部分患者KCNAB2基因的缺失，這一部分缺失KCNAB2基因的患者出現(xiàn)了聯(lián)想學習和聯(lián)想記憶功能為主要表現(xiàn)的認知功能障礙，通過研究發(fā)現(xiàn)，KCNAB2基因的缺失可以導致杏仁核外側(cè)核投射神經(jīng)元的神經(jīng)生理學改變，包括動作電位的慢后超極化(SAHP)的降低和神經(jīng)元興奮性的增加，從而導致患者聯(lián)想記憶和聯(lián)想學習能力受[19-20]。另外，KCNAB2基因缺失的患者中絕大多數(shù)出現(xiàn)了嚴重癲癇表型，由于離子通道的異?？梢栽黾影d癇的易感性，可以認為KCNAB2基因作為癲癇表型基因家族的一個候選基因。但是仍有很大一部分1p36缺失綜合征的患者出現(xiàn)了癲癇表型，卻未發(fā)現(xiàn)存在KCNAB2基因的缺失，提示：KCNAB2基因的缺失是患者發(fā)生嚴重癲癇的一個重要危險因素[21]。除了KCNAB2基因，在膠質(zhì)母細胞瘤患者中一定還存在一個潛在的機制，或其他責任基因的共同作用，從而導致患者嚴重癲癇表型的出現(xiàn)。在膠質(zhì)母細胞瘤的患者中，KCNAB2基因的低表達是否也會導致患者出現(xiàn)嚴重癲癇和認知功能障礙有待我們進一步的實驗去尋求實踐支持。

4 結(jié) 論

1)KCNAB2基因在膠質(zhì)母細胞瘤患者中存在顯著的低表達；

2)KCNAB2基因的高表達與膠質(zhì)母細胞瘤患者生存時間的縮短存在相關(guān)性，可能作為膠質(zhì)母細胞瘤藥物治療的有效靶標；

3)Kvb2為鉀離子通道蛋白，KCNAB2基因的低表達可能是導致膠質(zhì)母細胞瘤細胞膜電位改變的因素，甚至是導致膠質(zhì)母細胞瘤癲癇表型的因素之一。