黃文慧

摘要：斑馬魚經(jīng)常被作為模式生物而廣泛應用于發(fā)育生物學和遺傳學研究中，乙醇是一種常用的提取生物活性成分的有機溶劑。故我們用乙醇和斑馬魚為材料來進行自主實驗，在0%、0.5%、1%乙醇濃度的溶液中飼養(yǎng)斑馬魚兩周后，通過對斑馬魚存活率、均體長、均體重的變化來探討酒精對斑馬魚的影響。在飼養(yǎng)期過后通過石蠟切片及其器官顯微照片的觀察探究酒精對斑馬魚心臟結構以及發(fā)育的影響。實驗探究結果表明隨著乙醇濃度的升高，其對斑馬魚心臟的發(fā)育起抑制作用。

關鍵詞：乙醇;斑馬魚;心臟發(fā)育;毒害作用;石蠟切片;HE染色

斑馬魚（Danio rerio）是一種發(fā)現(xiàn)于印度和巴基斯坦水域的熱帶魚，被廣泛應用于發(fā)育生物學和遺傳學等研究領域，近年來正逐漸用于人類疾病模型的構建及藥物篩選方面的研究[1]。乙醇是一種有機物，在常溫、常壓下是一種易燃、易揮發(fā)的無色透明液體。乙醇對胚胎的致畸作用在許多脊椎動物中都有發(fā)現(xiàn)[2]，經(jīng)生物學研究發(fā)現(xiàn)斑馬魚胚胎循環(huán)系統(tǒng)及關鍵基因的活性對乙醇非常敏感，隨著乙醇濃度的升高，不完整的循環(huán)系統(tǒng)等畸形率也逐漸升高[3]。

1 實驗材料

1）實驗用魚：本實驗用斑馬魚（Barchydanio rerio var）為未成熟的幼魚，均于保定市花鳥魚蟲市場由專人統(tǒng)一購入，用在室溫下放置過一段時間的水（去除氯氣，防止其對魚產(chǎn)生毒害作用）飼養(yǎng)兩周。

2）實驗試劑：乙醇來自河北大學生命科學學院發(fā)育實驗室，純度為95%，實驗過程中需要用去氯自來水配置乙醇（100% 、95% 、85%、 75%、70%、 50% 、30%）用于斑馬魚的培養(yǎng)、石蠟切塊和HE染色。

2 實驗過程及方法

本組共6人，每兩個人為一個實驗組，其中兩人為一個對照組（空白對照）、0.5%乙醇、1%乙醇，每組做兩個平行實驗，每個燒杯中放8條斑馬魚置于配好的不同濃度的酒精溶液培養(yǎng)。10月10日至10月23日期間為斑馬魚的培養(yǎng)時間，在此過程中不斷記錄斑馬魚的換水、喂食的時間及次數(shù)，每周計算斑馬魚的體長、體重、存活率至23日，之后進行解剖取材、固定、石蠟包埋、切片、HE染色、普通顯微鏡下結果觀察、顯微攝影。

據(jù)表1分析以及同組人員的實驗對照探究發(fā)現(xiàn)：1%乙醇組的斑馬魚在短時間內(nèi)死亡率最高，0.5%乙醇組次之，空白對照組最末?？赡茉颍?/p>

①乙醇溶液的濃度可能是直接影響因素，由此可見乙醇對其的毒害作用可能隨濃度升高而增強（待后續(xù)分析）。

②從第一條魚死亡后溶液中可能殘留毒素，其可能會對其余存活的魚有毒害作用。

③換水問題。即培養(yǎng)液渾濁程度亦會影響斑馬魚的生長。

根據(jù)各實驗組及對照組體重數(shù)據(jù)繪制散點圖并計算回歸方程如圖1。

據(jù)圖2可知，斑馬魚的平均體重與乙醇濃度呈正相關，且相關程度呈線性關系。斑馬魚的平均存活數(shù)與乙醇濃度近似呈現(xiàn)負相關，但并未呈現(xiàn)嚴格的線性關系?？赏茰y隨著乙醇濃度的增加，斑馬魚的存活數(shù)下降。原因是乙醇不利于斑馬魚的生長，甚至有毒害作用。

兩周飼養(yǎng)期結束，挑選本實驗組（對照組）長勢良好、體型適中的斑馬魚進行解剖，將要取材的斑馬魚進行冰凍處理，使其活動能力下降，將斑馬魚固定在小蠟盤上，用大頭針固定，對其進行解剖，找出斑馬魚的一些器官，放入固定瓶中，接下來進行石蠟切片及HE染色，下圖是使用DP71顯微鏡在10倍、20倍和40倍物鏡下進行顯微攝影拍攝斑馬魚心臟部位的石蠟切片，以20倍為例。

3 實驗結論與分析

根據(jù)顯微圖片顯示：切下的部分為心臟的肌肉部分，其中占大多數(shù)的是心肌細胞，并未觀察到明顯的心臟各部腔室的區(qū)分。根據(jù)小組間對不同乙醇濃度實驗組的心臟切片的顯微觀察，我們觀察到空白對照組的心臟切片組織分明，可以觀察到分明的心肌細胞于心臟切片邊緣較為有序排列;對于0.5%乙醇組的心臟切片我們可以看到心肌組織較為致密。而1%乙醇組的心臟玻片較0.5%乙醇組和空白對照組的心臟形態(tài)明顯不同，即心臟出現(xiàn)了局部水腫的情況，并且心臟組織的致密性亦不及前兩組。通過平行對照，我們可以得出的結論是：

1）乙醇對于斑馬魚心臟有毒害作用，具體表現(xiàn)在心臟的形態(tài)和結構等方面。

2）隨著乙醇濃度的升高，其對斑馬魚的毒害作用越明顯。

結論：

值得反思的是，本文利用乙醇與斑馬魚開展的自主實驗對乙醇的致畸作用有了初步的認識與進展。另外，作為一種維生素A的生物活性形式，視黃酸（RA）可以降低甚至能逆轉乙醇在胚胎心臟發(fā)育中的毒性。RA信號對心臟發(fā)育起重要作用，可影響心肌細胞分化、早期心臟前后模式的形成、左右決定、心內(nèi)膜墊的形成及心臟環(huán)化。而斑馬魚是研究脊椎動物早期發(fā)育的最重要的模式動物之一，利用斑馬魚研究乙醇影響心臟發(fā)育的機制是可行的。由此可見，本實驗利用斑馬魚得出的乙醇致畸的實驗結論是可信的.

參考文獻：

[1]王思鋒，劉可春，韓利文等.溶劑乙醇對斑馬魚胚胎發(fā)育的影響[A].濟南：山東科學.2007，20（3）：10-11.

[2]龔春華，李軍，秦玉明等.乙醇對斑馬魚胚胎發(fā)育中tenascin-c基因表達的影響[A].南京：實用兒科臨床雜志.2008，23（1）：55-56.

[3]錢林溪，王躍祥，蔣璆等.乙醇干擾斑馬魚胚胎發(fā)育中底索和背主動脈的形成.上海：中國科學C輯.2005，35（4）：326-327.

（河北大學生命科學學院 河北保定 071002）