何明為 韋慶軍

摘要：目的：對(duì)比MSNs@DM和單純DM對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞炎癥損傷的作用。方法：提取5天齡的SD乳鼠的軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，分為空白對(duì)照組（Control），骨關(guān)節(jié)炎組（OA），香葉木素組（DM），載藥組（MSNs@DM），分別處理24小時(shí)后，行HE染色觀察各組大鼠的細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量，并提取各組大鼠的總RNA，行qRT-PCR檢測(cè)相關(guān)炎癥的表達(dá)。結(jié)果：與OA組相比，DM組和MSNs@DM組細(xì)胞形態(tài)較接近于Control組;在細(xì)胞數(shù)量上，MSNs@DM組和DM組均比OA組多，而且MSNs@DM組相較于DM組多。MSNs@DM組相關(guān)炎癥指標(biāo)基因的表達(dá)均低于OA組（P<0.05）和DM組（P<0.05）。結(jié)論：MSNs@DM相比于單純DM更能有效維持IL-1β誘導(dǎo)的大鼠體軟骨細(xì)胞炎癥損傷的形態(tài)，并抑制相關(guān)炎癥基因的表達(dá)，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎有積極的治療作用。

關(guān)鍵詞：介孔二氧化硅;香葉木素;軟骨細(xì)胞;骨關(guān)節(jié)炎

【中圖分類(lèi)號(hào)】R-03 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2107-2306（2020）01-026-02

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis， OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性改變?yōu)樘卣鞯募膊。瑫?huì)引起關(guān)節(jié)疼痛、僵硬、壓痛和活動(dòng)范圍縮小等，是常見(jiàn)的肌肉骨骼疾病之一[1]。目前治療OA的方式有止痛藥物（如撲熱息痛和非甾體抗炎藥）、手術(shù)等[2]。然而這些治療僅能緩解癥狀，很難延緩OA的發(fā)展。有研究表明，香葉木素（diosmetin， DM）具有較強(qiáng)的抗炎、抗氧化作用[3]，是治療OA的潛力藥物;但是由于DM水溶性差、不利于吸收的特點(diǎn)，藥物的實(shí)際利用率較低。介孔結(jié)構(gòu)的二氧化硅納米顆粒（mesoporous silica nanoparticles， MSNs），由于具有極高的比表面積和孔徑體積，已被作為藥物緩釋載體應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究中[4]。因此，本研究以MSNs為載體負(fù)載DM（MSNs@DM），研究其對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠體外骨關(guān)節(jié)炎的影響，為今后進(jìn)一步研究新型的OA治療方式提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1.材料與統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

1.1 材料 動(dòng)物為5天齡SD乳鼠，由廣西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。主要試劑：MSNs、DM（化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖1A）購(gòu)于麥克林公司（http：//www.macklin.cn/）;高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗、MTT和HE染色試劑盒購(gòu)買(mǎi)于北京索來(lái)寶公司（http：//www.solarbio.com/）;PCR引物合成于武漢金開(kāi)瑞生物公司;胎牛血清購(gòu)買(mǎi)于Gibco公司。主要儀器：全波長(zhǎng)熒光酶標(biāo)儀（Thermo，美國(guó)）;正置熒光顯微鏡（Olympus，日本），PCR儀（light-cycler，美國(guó)）。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，并以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）呈示。組間比較采用One-way ANOVA，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，P<0.05被認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.方法與結(jié)果

2.1 DM對(duì)IL-1β體外誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞炎癥損傷的作用

提取SD乳鼠原代軟骨細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)至第3代。將軟骨細(xì)胞接種于96孔板，每孔5×103個(gè)細(xì)胞，放置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞完全貼壁后，先加入含有不同濃度DM的高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1%雙抗）作用2小時(shí)，隨后更換含有相同濃度DM的高糖培養(yǎng)基（含IL-1β 10ng/mL，10%胎牛血清和1%雙抗）。作用24小時(shí)后，分別向每孔培養(yǎng)基中加入20μL的MTT，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中4小時(shí)后棄掉多余培養(yǎng)基，加入200μL DMSO并避光孵育15-20分鐘。最后用全波長(zhǎng)熒光酶標(biāo)儀在570nm處測(cè)定光密度值（OD value）。結(jié)果如圖1B所示，DM在20μM 時(shí)，對(duì)經(jīng)IL-1β體外誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞保護(hù)效果最佳。

2.2 MSNs@DM對(duì)IL-1β體外誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞炎癥損傷的作用

為對(duì)比MSNs@DM和DM對(duì)IL-1β （10ng/mL）體外誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞的作用，我們以MSNs作為藥物載體，按照等效濃度為20μM的量將DM載入MSNs中得到含20μM 的MSNs@DM。之后，我們將第3代軟骨細(xì)胞分別接種在6孔板（50×103個(gè)/孔）及24孔板（10×103個(gè)/孔）爬片中，分別為Control組，OA組，DM組，MSNs@DM組。按如前所述分組分別加入含不同藥物成分的培養(yǎng)基作用2小時(shí)后，更換含有相應(yīng)藥物成分的且含有IL-1β （10ng/mL）的高糖培養(yǎng)基。在干預(yù)24小時(shí)后，我們分別取出各組細(xì)胞爬片，用PBS緩沖液沖洗3遍后以多聚甲醛在室溫下固定20分鐘，之后進(jìn)行HE染色。染色結(jié)果如圖2，蘇木素將細(xì)胞核染成藍(lán)色，伊紅將細(xì)胞質(zhì)染成紅色。同OA組對(duì)比，我們發(fā)現(xiàn)DM組和MSNs@DM組細(xì)胞形態(tài)和數(shù)量更接近于Control組;并且OA組的細(xì)胞形態(tài)狹長(zhǎng)且數(shù)量減少，說(shuō)明IL-1β能誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞的炎癥損傷。此外，我們還從6孔板中提取了各組細(xì)胞的總RNA并進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)了炎癥因子的表達(dá)（MMP3、MMP13和IL6）。本研究所用引物：MMP3（上游：GGCTGTGTGCTCATCCTACC;下游：TGGAAAGGTACTGA AGCCACC）;MMP13（上游：GGACAAAGACTATCCCCGCC;下游：GGCATGACTCTCACAATGCG）; IL6（上游： ACAAGTCCGGAGA GGAGACT;下游： ACAGTGCATCATCGCTGTTC）;GAPDH（上游：TCCAGTATGACTCTACCCACG;下游：CACGACATACTCA GCACCAG）。PCR結(jié)果如圖3所示：與Control組對(duì)比，炎癥指標(biāo)MMP3、MMP13和IL6均明顯升高（p<0.05）。而對(duì)比DM組，MSNs@DM組的炎癥指標(biāo)表達(dá)更低（p<0.05）。以上結(jié)果提示MSNs@DM組比DM組更能有效抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。

3.討論

OA是全球老年人最常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病，也是慢性肌肉骨骼疼痛和行動(dòng)不便的主要原因[5]。目前對(duì)于OA尚無(wú)最佳的治療方式，OA進(jìn)展到晚期需要進(jìn)行關(guān)節(jié)置換術(shù)才能減輕疼痛和改善身體功能。因此，尋找能延緩OA進(jìn)展的方式將能為臨床治療提供指導(dǎo)性意義。

研究表明，IL-1β可引起軟骨細(xì)胞中的基質(zhì)金屬蛋白酶類(lèi)MMPs、IL6、TNF-α等炎癥因子合成、分泌及活性增加[6]，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞基質(zhì)降解進(jìn)而導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨的退變，最終發(fā)展為骨關(guān)節(jié)炎。DM是天然黃酮類(lèi)化合物的一種，廣泛存在于甘菊藍(lán)、紫草和薄荷等天然植物中，具有抗炎、抗氧化、抗休克等功效[7]。有研究報(bào)道，DM可通過(guò)抑制破骨細(xì)胞的分化，降低軟骨下骨的丟失，進(jìn)而對(duì)小鼠的骨關(guān)節(jié)炎有一定的治療作用[8]。然而，由于裸露在細(xì)胞外環(huán)境中的DM水溶性差，易被細(xì)胞外環(huán)境所代謝，以致細(xì)胞的藥物吸收率降低。因此，本研究使用具有緩釋作用的藥物載體MSNs包載DM，可以實(shí)現(xiàn)藥物載細(xì)胞外環(huán)境中的緩慢釋放，是之持續(xù)有效地對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β （10ng/mL）誘導(dǎo)后的軟骨細(xì)胞其炎癥指標(biāo)如MMP3、MMP13和IL6等表達(dá)量明顯增加。而在DM作用后，其炎癥指標(biāo)有所降低，我們的研究結(jié)果除了進(jìn)一步驗(yàn)證了DM對(duì)軟骨細(xì)胞驗(yàn)證損傷的保護(hù)作用之外，我們還發(fā)現(xiàn)了經(jīng)MSNs包載的DM，對(duì)軟骨細(xì)胞的驗(yàn)證損傷效果比單純藥物DM的治療更佳，提示了MSNs可作為藥物載體包載藥物并運(yùn)用在體外骨關(guān)節(jié)炎的治療中。

綜上所述，MSNs@DM比單純DM對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的體外軟骨細(xì)胞的損傷的保護(hù)作用更佳，能為OA的治療提供新的思路。

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基金項(xiàng)目：廣西研究生教育創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目（YCSW2019109）

（1.廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心 廣西南寧 530021;2 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 創(chuàng)傷骨科手外科 廣西南寧 530021）