謝娜，劉崇海，皮光環(huán)，雷勛明，蔡艷，劉昊昊，李小林

(1.四川省婦幼保健院，四川成都 631000；2.川北醫(yī)學(xué)院，四川南充 637000)

近幾十年來(lái)過敏性疾病發(fā)病率逐年增加，已成為嚴(yán)重的公共問題和疾病負(fù)擔(dān)[1]。我國(guó)嬰幼兒過敏性疾病患病率正逐漸接近發(fā)達(dá)國(guó)家和地區(qū)水平[2]。大多數(shù)過敏性疾病都從兒童開始發(fā)病，因此早期預(yù)防意義重大[3]。動(dòng)物模型證實(shí)腸道菌群對(duì)免疫系統(tǒng)發(fā)育有著重要意義[4]。有研究顯示過敏患兒腸道菌群腸球菌和乳酸桿菌數(shù)量明顯減少[5]，提示腸道菌群與過敏性疾病密切相關(guān)。人類生命早期輔助性T細(xì)胞(Th)1/Th2平衡以Th2為優(yōu)勢(shì)細(xì)胞，已有的研究顯示包括乳酸桿菌的益生菌可以促進(jìn)Th1分化[6]，如果早期進(jìn)行乳酸菌干預(yù)，是否可以改變Th1/Th2平衡狀態(tài)，進(jìn)而達(dá)到預(yù)防過敏性疾病的目的？因此，我們?cè)谛律∈蠛统赡晷∈笥枰匀樗釛U菌干預(yù)，探討乳酸桿菌干預(yù)對(duì)新生鼠和成年鼠Th1/Th2平衡和肺樹突狀細(xì)胞表型的影響，為生命早期乳酸桿菌干預(yù)預(yù)防過敏性疾病的發(fā)生提供參考。

1 資料和方法

1.1 材料

清潔級(jí)BALB/c小鼠分籠飼養(yǎng)于標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)籠，孕鼠懷孕20 d后所產(chǎn)新生鼠在同樣環(huán)境中飼養(yǎng)。本實(shí)驗(yàn)使用的乳酸桿菌是從正常人糞便分離所得，通過革蘭染色、觸酶實(shí)驗(yàn)，API-CH50系統(tǒng)鑒定。將乳酸桿菌接種于乳酸桿菌選擇性(LBS)培養(yǎng)基，置于37 ℃厭氧培養(yǎng)72 h后，收集乳酸桿菌，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次，血球計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)并將乳酸桿菌調(diào)整為109CFU/mL濃度。

1.2 方法

1.2.1 乳酸桿菌處理 新生鼠從出生后連續(xù)7 d每天經(jīng)口給予109CFU/mL濃度乳酸桿菌10 μL，利于乳酸桿菌定植。成年鼠選取滿6周的小鼠連續(xù)7 d每天經(jīng)口給予109CFU/mL濃度乳酸桿菌50 μL，實(shí)驗(yàn)第8天進(jìn)行盲腸內(nèi)容物培養(yǎng)以確定乳酸桿菌腸道定植情況。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組 新生鼠和成年鼠各40只，小鼠分為兩部分，第一部分40只，用于腸道菌群計(jì)數(shù)，其中新生鼠20只，隨機(jī)分為乳酸桿菌組和對(duì)照組各10只。乳酸桿菌組出生后連續(xù)口飼乳酸桿菌7 d，對(duì)照組用等量生理鹽水代替乳酸桿菌進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。第8天小鼠處死后取盲腸內(nèi)容物作乳酸桿菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。成年鼠20只同樣分為乳酸桿菌組和對(duì)照組，處理同前。第二部分40只小鼠分組同第一部分，在最后1次口飼乳酸桿菌后3周，取眼眶血的血清用于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)，取肺組織制備單個(gè)細(xì)胞懸液用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[7]方法，取盲腸內(nèi)容物加無(wú)菌稀釋液，稀釋成10-6～10-1稀釋度，進(jìn)行腸桿菌(伊紅美蘭EMB培養(yǎng)基)、腸球菌(EC培養(yǎng)基)、乳酸桿菌(LBS培養(yǎng)基)、雙歧桿菌(BS培養(yǎng)基)培養(yǎng)和計(jì)數(shù)。結(jié)果單位CFU/g。

1.2.4 細(xì)胞因子檢測(cè) 血清細(xì)胞因子濃度檢測(cè)采用ELISA試劑盒。小鼠干擾素γ(IFN-γ)和白細(xì)胞介素10(IL-10)試劑盒購(gòu)于R&D公司(USA)。白細(xì)胞介素4(IL-4)購(gòu)于Bender公司(Austria)。按試劑說明書進(jìn)行操作，ELISA酶標(biāo)儀于450 nm處檢測(cè)吸光度。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 小鼠肺研磨后，300目篩網(wǎng)過濾，制成單個(gè)細(xì)胞，取10 mL經(jīng)紅細(xì)胞裂解液處理10 min后，PBS洗2次，血球計(jì)數(shù)池計(jì)數(shù)后，取兩份等體積含細(xì)胞數(shù)為106懸液分別加入兩支試管。陽(yáng)性管加入異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的單克隆抗小鼠CD11C和E/Cy5標(biāo)記的單克隆抗小鼠CD8α以及PE標(biāo)記的單克隆抗小鼠主要組織相容性復(fù)合體MHC-Ⅱ類分子抗體，陰性管加入FITC標(biāo)記的單克隆抗小鼠CD11C以及PE/Cy5和PE標(biāo)記的同型對(duì)照抗體(抗體均為BioLegend公司產(chǎn)品)，每種抗體各加1 μg，4 ℃避光孵育30 min，PBS洗 3次，上機(jī)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群檢測(cè)

通過口飼乳酸桿菌，乳酸桿菌干預(yù)的新生鼠乳酸桿菌數(shù)量較對(duì)照組增加，而腸球菌和腸桿菌數(shù)量降低(P<0.01)；乳酸桿菌干預(yù)的成年鼠腸道乳酸桿菌數(shù)量增加(P<0.01)，但腸道腸球菌和腸桿菌數(shù)量變化差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示新生鼠腸道菌群相對(duì)于成年鼠更容易受環(huán)境因素影響。見表1。

表1 兩組腸道菌群數(shù)量比較 log10n/g

2.2 免疫指標(biāo)檢測(cè)

乳酸桿菌干預(yù)的新生鼠IFN-γ和IL-10水平較對(duì)照組高(P<0.05)，兩組IL-4水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。乳酸桿菌干預(yù)的成年鼠IFN-γ、IL-4和IL-10水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示乳酸桿菌干預(yù)對(duì)新生鼠有影響，可以提高IFN-γ水平，促進(jìn)Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，但乳酸桿菌干預(yù)對(duì)成年鼠沒有明顯影響。見表2。

表2 兩組小鼠血清IFN-γ、IL-4和IL-10水平比較 pg/mL

2.3 肺樹突狀細(xì)胞表型檢測(cè)

乳酸桿菌干預(yù)的新生鼠肺部CD11c+CD8α-水平為92.34%±0.94%，較對(duì)照組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；同時(shí)新生鼠干預(yù)組CD11c+CD8α+水平較對(duì)照組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；提示乳酸桿菌干預(yù)可以促使Th1/Th2平衡向Th1方向偏移。對(duì)照組新生鼠肺部?jī)H11.48%±1.73%的樹突狀細(xì)胞(DC)表達(dá)MHCⅡ類分子，說明外周組織中以未成熟DC為主，經(jīng)過乳酸桿菌干預(yù)后，新生鼠肺部14.03%±1.14%的DC表達(dá)MHCⅡ類分子，較對(duì)照組明顯增加，提示乳酸桿菌可以刺激肺部DC成熟。成年鼠乳酸桿菌干預(yù)組CD11c+CD8α-、CD11c+CD8α+和CD11c+MHCⅡ+水平與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組小鼠肺部DC亞型和成熟度的流式檢測(cè)水平比較 %

3 討論

通過給小鼠口飼乳酸桿菌，腸道菌群檢測(cè)顯示無(wú)論新生鼠還是成年鼠，乳酸桿菌數(shù)量均明顯增高，但對(duì)于其他腸道菌群的影響，兩組小鼠反應(yīng)有差異。新生鼠乳酸桿菌數(shù)量增加，明顯影響腸道的腸球菌和腸桿菌數(shù)量，而成年鼠雖然乳酸桿菌數(shù)量明顯增加，但對(duì)其他腸道菌群影響不大，提示生命早期腸道菌群不穩(wěn)定，很容易被環(huán)境因素干擾。

Th1/Th2平衡在過敏性疾病中至關(guān)重要[8-10]。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-10和IL-13等，IL-4可以促進(jìn)B細(xì)胞完成IgE抗體類型轉(zhuǎn)化，在過敏性疾病中發(fā)揮重要作用[11-12]。Th1分泌IFN-γ可以抑制Th2的分化和功能[13]。調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)是機(jī)體對(duì)T細(xì)胞活化的一種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，將T細(xì)胞參與的免疫反應(yīng)控制在一個(gè)適當(dāng)?shù)姆秶鷥?nèi)，不對(duì)機(jī)體造成損傷，通過分泌可溶性分子如IL-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等調(diào)節(jié)免疫功能。通過對(duì)相關(guān)細(xì)胞因子水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，成年鼠口飼乳酸桿菌后對(duì)IL-4、IFN-γ和IL-10沒有明顯影響，但是在新生鼠乳酸桿菌可以明顯提高IFN-γ和IL-10水平，本研究結(jié)果顯示乳酸桿菌干預(yù)對(duì)IL-4的影響不大。分析原因可能是成年鼠已經(jīng)接受多種抗原刺激，腸道菌群和免疫系統(tǒng)均發(fā)育成熟，不易受環(huán)境影響。相關(guān)研究顯示，嬰幼兒出生后數(shù)小時(shí)細(xì)菌開始在腸道定植，約3歲時(shí)形成與成人相似的穩(wěn)定腸道菌群構(gòu)成[14]，而新生鼠出生后，無(wú)論是腸道菌群還是免疫系統(tǒng)均處于逐漸發(fā)育的過程，在此過程中對(duì)外界刺激會(huì)出現(xiàn)不同的反應(yīng)，兩者均容易受外界因素影響。國(guó)內(nèi)有研究顯示，嗜酸乳桿菌La28在干預(yù)第14天和第28天時(shí)小鼠血清Th2因子IL-6含量降低，嗜酸乳桿菌6091干預(yù)28 d時(shí)血清IL-6含量降低，而植物乳桿菌LP45、鼠李糖乳桿菌GG對(duì)小鼠Th1/Th2平衡沒有影響[15]，提示不同乳酸桿菌菌株對(duì)免疫系統(tǒng)的影響有所不同[16]。

DC是功能最強(qiáng)的專職抗原遞呈細(xì)胞(antigen presen-ting cells，APC)，是唯一可激活初始T淋巴細(xì)胞的APC[17]。DC高水平表達(dá)MHC Ⅱ類分子可表達(dá)參與抗原攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)的特殊膜受體[18]；有效攝取和處理抗原，然后遷移至T細(xì)胞區(qū)；提高抗原提呈效率，少量抗原和DC即可激活T細(xì)胞。體內(nèi)DC按其發(fā)育程度可分為成熟DC和未成熟DC。正常情況下，體內(nèi)絕大多數(shù)DC處于未成熟狀態(tài)，未成熟DC有很強(qiáng)的吞噬能力，低表達(dá)MHCⅡ和共刺激分子如CD80、CD83或CD86，有很強(qiáng)的外周組織監(jiān)視能力[19]。成熟DC高表達(dá)MHCⅡ類分子和共刺激分子具有很強(qiáng)激活T細(xì)胞的能力。不同DC亞型對(duì)Th1/Th2平衡影響不同，CD8α-DC則可促進(jìn)Th2發(fā)育，CD8α+DC則促進(jìn)Th1分化[20]。

本研究結(jié)果顯示，成年鼠乳酸桿菌干預(yù)對(duì)小鼠DC亞型和成熟度均沒有明顯影響，但是在新生鼠模型中，乳酸桿菌干預(yù)可以對(duì)兩者均產(chǎn)生明顯的影響，表現(xiàn)為乳酸桿菌干預(yù)可以上調(diào)CD11c+CD8α+DC表達(dá)，下調(diào)CD11c+CD8α-DC表達(dá)，同時(shí)CD11c+MHCⅡ+表達(dá)較對(duì)照組明顯增高。再次說明乳酸桿菌可以促進(jìn)機(jī)體向Th1優(yōu)勢(shì)發(fā)展，同時(shí)可以促進(jìn)DC的成熟度。而相關(guān)研究提示益生菌可以影響T細(xì)胞亞群分化，促進(jìn)Th1介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，進(jìn)一步抑制IgE抗體的產(chǎn)生從而調(diào)節(jié)過敏反應(yīng)[21]，也有相關(guān)研究提示生命早期乳酸桿菌干預(yù)可以促進(jìn)新生鼠Th1/Th2平衡向Th1方向偏移[22]，對(duì)成年鼠免疫狀態(tài)沒有影響[23]，可能是生命早期乳酸菌干預(yù)可以預(yù)防過敏性疾病的機(jī)制。

綜上所述，乳酸桿菌干預(yù)可以提高新生鼠IFN-γ和IL-10水平，上調(diào)CD11c+CD8α+DC、CD11c+MHCⅡ+表達(dá)，下調(diào)CD11c+CD8α-DC表達(dá)，而在成年鼠中沒有明顯變化，說明乳酸桿菌干預(yù)對(duì)新生鼠的影響與成年鼠有一定差異，生命早期可以促進(jìn)新生鼠Th1/Th2平衡向Th1方向偏移，而對(duì)成年鼠沒有影響。