田雨風(fēng)，徐 剛

(貴州省森林資源與環(huán)境研究中心/貴州大學(xué)林學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

馬尾松(Pinus massoniana)是松科松屬的常綠高大喬木，俗名青松、山松，是我國東部地區(qū)分布最廣泛的針葉樹種，分布于江蘇、浙江、福建、廣東、臺(tái)灣等地區(qū)[1]。馬尾松的經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，是重要的用材、造紙、工業(yè)原料樹種[2]。然而，馬尾松的良種供應(yīng)不足一直是影響馬尾松人工林產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的瓶頸問題[3]。扦插繁殖是一種較好的良種基因型擴(kuò)繁方法，但馬尾松優(yōu)質(zhì)插穗大量獲取較難，同時(shí)插穗生根能力具有年齡效應(yīng)[4]，且受季節(jié)限制，增殖系數(shù)較低。通過組織培養(yǎng)，建立馬尾松良種快繁體系，能對(duì)少量的外植體進(jìn)行大量繁殖，批量提供馬尾松優(yōu)質(zhì)種苗。

關(guān)于馬尾松組織培養(yǎng)已有報(bào)道，以莖段[5—6]、幼胚[7—8]、下胚軸[9]、頂芽[10]等材料作為外植體，成功獲得了馬尾松愈傷組織、體胚[11]和組培苗[11—14]，目前只有以胚為外植體能建立完整體系。齊力旺等[15]與顧淑榮等[16]對(duì)部分裸子植物進(jìn)行過胚乳組織培養(yǎng)研究，均未能建立完整體系。馬尾松胚乳組織培養(yǎng)尚未見報(bào)道。馬尾松的胚乳是由大孢子直接發(fā)育而成的單倍體，因此以胚乳為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)有望獲得單倍體材料，通過單倍體育種具有快速純合基因、縮短育種年限、提高育種效率等優(yōu)勢，可與多種育種技術(shù)相結(jié)合，加快育種研究。因此，本研究以馬尾松成熟胚乳為材料，通過篩選合適的基本培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑配比，以及熱激處理探索馬尾松胚乳愈傷組織誘導(dǎo)以及增殖方法，為馬尾松胚乳組織培養(yǎng)以及馬尾松單倍體育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采自貴州省都勻馬寨馬尾松良種基地的成熟馬尾松種子。

1.2 外植體處理消毒方式

馬尾松種子保存于4 ℃冰箱，接種前一天取出剝?nèi)シN殼，并浸泡在無菌水中，存放于4 ℃冰箱冷藏12 h。將剝?nèi)ネ鈿さ姆N子在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行表面殺菌處理(表1)，每種消毒劑處理后均使用無菌水沖洗3～4次。將消毒的種子置于濾紙吸干水分，切除胚芽再縱切去除胚，余下的胚乳接種于 WPM+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 2.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1培養(yǎng)基中，pH為5.8，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)30個(gè)外植體，每天觀察記錄外植體污染與生長狀況并拍照，30 d后統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率等。

1.3 6-BA浸泡對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

以 WPM+NAA 2.0 mg·L-1+2,4-D 1.0 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1+瓊脂 7 g·L-1為培養(yǎng)基，pH為 5.8。種子去殼后浸泡于無菌水中，存放在4 ℃冰箱12 h，接種前去殼種子在6-BA溶液中浸泡30 min，6-BA溶液濃度設(shè)計(jì)為四個(gè)水平，0、0.2、0.5和1.0 mg·mL-1(表2)，每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30個(gè)胚乳材料，每7 d觀察并記錄愈傷生長狀況，持續(xù)觀察30 d。

1.4 基本培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑濃度篩選

愈傷誘導(dǎo)以基本培養(yǎng)基、NAA和 6-BA以及2,4-D設(shè)計(jì)四因素三水平的正交試驗(yàn)(表3)，選用正交表 L9(34)，均添加蔗糖 30 g·L-1，瓊脂 7 g·L-1，pH調(diào)至5.8，每處理4個(gè)重復(fù)，每重復(fù)20個(gè)胚乳材料，每7 d觀察愈傷生長狀況，持續(xù)觀察30 d。

1.5 熱激處理

以 DCR+NAA 2.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1為接種培養(yǎng)基，添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，pH為5.8。在接種后，放置于培養(yǎng)箱中熱激處理，設(shè)計(jì)溫度梯度 35 ℃、40 ℃、45 ℃，時(shí)間梯度 5 min、10 min、15 min的兩因素三水平隨機(jī)區(qū)組，并將相對(duì)濕度調(diào)至85%。每處理3個(gè)重復(fù)，每重復(fù)30個(gè)胚乳材料，每7 d觀察愈傷生長狀況，持續(xù)觀察30 d。

1.6 愈傷組織繼代培養(yǎng)

用基本培養(yǎng)基(DCR、GD、WPM)與NAA (0.1～0.3 mg·L-1)以及 6-BA (0.5～1 mg·L-1)組合設(shè)計(jì)馬尾松胚乳愈傷組織繼代培養(yǎng)基，再添加蔗糖30 g·L-1、瓊脂7 g·L-1。光照強(qiáng)度 1500 lx，光照時(shí)間12 h·d-1，培養(yǎng)3周后，統(tǒng)計(jì)愈傷組織變綠數(shù)量以及生長狀況。

以WPM為基本培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)三種生長調(diào)節(jié)劑配比用于增殖培養(yǎng)：Z1(NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1)、Z2 (NAA 0.1 mg·L-1+KT 2.0 mg·L-1)、Z3 (NAA 0.1 mg·L-1+2,4-D 0.1 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1)。培養(yǎng)基均添加蔗糖 30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1。轉(zhuǎn)化后的愈傷再轉(zhuǎn)接入增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)3周，統(tǒng)計(jì)增殖情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方式篩選

從表1可以看出，六個(gè)處理的外植體污染率沒有極顯著差異，消毒效果均較好。使用 HgCl2消毒的三個(gè)處理愈傷誘導(dǎo)率較低甚至為 0，而死亡率較高；用 NaClO消毒的三個(gè)處理愈傷誘導(dǎo)率高達(dá)66.67%，最低的也為 46.67%，死亡率最高的僅為20.00%?？梢娪肗aClO消毒更適用于馬尾松成熟胚乳。HgCl2可能對(duì)胚乳材料造成一定殺滅作用。在使用NaClO消毒的三個(gè)處理中，隨著NaClO處理時(shí)間的增長，愈傷組織誘導(dǎo)率逐漸下降，且三個(gè)處理間差異顯著。從死亡率看，HgCl2處理和NaClO處理具有顯著差異，NaClO處理的愈傷死亡率顯著低于HgCl2處理，使用NaClO的三個(gè)處理中，死亡率呈現(xiàn)隨消毒時(shí)間增長而升高的趨勢。綜合來看，75%酒精 30 s+2% NaClO 15 min消毒處理污染率為0.00%，且愈傷誘導(dǎo)率較高，胚乳材料死亡率較低，為最適宜的消毒處理方式。

表1 不同消毒方式對(duì)馬尾松胚乳的消毒效果Table 1 Sterilization results of Pinus massoniana endosperm by different disinfection methods

2.2 6-BA浸泡對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

使用 6-BA浸泡處理對(duì)胚乳愈傷誘導(dǎo)的影響如表2。即使培養(yǎng)基中不含細(xì)胞分裂素，使用6-BA浸泡后，對(duì)于愈傷組織的誘導(dǎo)仍具有一定的促進(jìn)作用。在4個(gè)濃度6-BA浸泡處理下，隨著6-BA濃度的不斷增加，其愈傷誘導(dǎo)率也不斷升高。未使用 6-BA浸泡的誘導(dǎo)率最低(55.00%)；浸泡濃度為1.0 mg·L-1時(shí)誘導(dǎo)率最高(87.78%)。從該表中還能看出，隨著6-BA濃度增加，愈傷誘導(dǎo)率的增幅也逐漸變小，在浸泡濃度為 0～0.2 mg·L-1之間時(shí)，濃度每增加0.1 mg·L-1，誘導(dǎo)率提高 7.50%；在濃度為0.2～0.5 mg·L-1之間時(shí)，濃度每增加 0.1 mg·L-1誘導(dǎo)率提高3.70%；在濃度為0.5～1.0 mg·L-1時(shí)，濃度每增加0.1 mg·L-1誘導(dǎo)率只提高1.33%。

表2 6-BA浸泡對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響Table 2 The effect of 6-BA soaking on callus induction

2.3 基本培養(yǎng)基與生長調(diào)節(jié)劑配比篩選

在不同基本培養(yǎng)基和生長調(diào)節(jié)劑配比處理下，胚乳愈傷組織誘導(dǎo)30 d后結(jié)果見表3。9號(hào)處理(A3B3C2D1)的愈傷誘導(dǎo)率最高，達(dá)68.75%；其次為4號(hào)處理(A2B1C2D3)，誘導(dǎo)率為67.5%；1號(hào)處理(A1B1C1D1)誘導(dǎo)率最低，僅為2.50%。極差分析表明，各因素對(duì)誘導(dǎo)率的影響效應(yīng)依次為A＞B＞D＞C，理論最佳組合為A2B3C2D3或A3B3C2D3。為了進(jìn)一步比較A2B3C2D3與A3B3C2D3兩個(gè)理論最佳組合的優(yōu)劣，以這兩最佳組合培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)20個(gè)胚乳材料。方差分析表明，影響胚乳愈傷誘導(dǎo)率的四個(gè)因素(基本培養(yǎng)基、NAA、6-BA、2,4-D)都具有顯著性影響，主次關(guān)系為A＞B＞C＞D，此次序與極差分析次序有異，由于極差分析不能反映結(jié)果是誤差引起還是因素引起，因此以方差分析為準(zhǔn)(表4)；A3B3C2D3組合愈傷誘導(dǎo)率與A2B3C2D3的結(jié)果表明(表5)，基本培養(yǎng)基WPM和DCR對(duì)愈傷誘導(dǎo)率的影響不具有顯著性差異。因此認(rèn)為DCR+NAA 2.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1為愈傷啟動(dòng)誘導(dǎo)的適宜培養(yǎng)基。

表3 愈傷誘導(dǎo)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal test results of callus induction

表4 愈傷誘導(dǎo)正交試驗(yàn)的方差分析Table 4 Analysis of variance in orthogonal test of callus induction

表5 正交試驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 5 Orthogonal test verification results

2.4 熱激處理對(duì)愈傷誘導(dǎo)的影響

不同熱激時(shí)間和熱激溫度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)影響如表6所示。隨著熱激時(shí)間增加，愈傷誘導(dǎo)率出現(xiàn)先增加再減小的趨勢；隨著熱激溫度的升高，愈傷組織的誘導(dǎo)率在熱激5 min時(shí)呈減小趨勢，在熱激10 min和15 min時(shí)則表現(xiàn)為不斷增加；誘導(dǎo)率在45 ℃下熱激10 min和15 min時(shí)相對(duì)較高，分別為66.25%和67.50%。高的熱激溫度更容易誘導(dǎo)成團(tuán)的愈傷組織，在45 ℃條件下熱激10 min時(shí)誘導(dǎo)率最高為 8.75%。綜合來看，馬尾松胚乳愈傷組織最佳的熱激方式為45 ℃下熱激10 min。此外，就熱激時(shí)間和熱激溫度的影響來看，兩者對(duì)總愈傷誘導(dǎo)率均具有顯著影響(P＜0.05)，但前者的影響大于后者；而這兩者對(duì)于成團(tuán)愈傷組織的誘導(dǎo)則不具有顯著影響(P＞0.05)。

表6 熱激對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 6 The effect of heat shock on callus induction

培養(yǎng)30 d后熱激處理過后的愈傷組織與未熱激的愈傷組織有明顯的差異。未經(jīng)過熱激處理的胚乳誘導(dǎo)出的愈傷組織只是切割面有突起，愈傷組織不成團(tuán)且不明顯，而且難以增殖，需繼代3周后才成團(tuán)狀(圖1:a～b)。熱激處理過的愈傷組織生長狀態(tài)分為兩類：1)多數(shù)胚乳僅在切割面有凸起，但突起程度大于未熱激處理，且愈傷組織更加晶瑩透亮(圖1:c～d)，說明愈傷誘導(dǎo)的情況更加良好；2)少數(shù)胚乳從切割面或者切割縫隙中突起成團(tuán)，愈傷組織晶瑩透亮且量大，誘導(dǎo)情況良好，易增殖發(fā)育(圖1:e～f)。

圖1 馬尾松胚乳熱激誘導(dǎo)愈傷比較Fig.1 Heat shock comparison on callus induction of Pinus massoniana endosperm

2.5 基本培養(yǎng)基對(duì)增殖的影響

從暗培養(yǎng)轉(zhuǎn)至光培養(yǎng)，部分愈傷發(fā)生褐化與死亡現(xiàn)象，其余愈傷轉(zhuǎn)為綠色。GD培養(yǎng)基中綠色愈傷率均為30%左右，褐化率高且褐化程度高，不利于愈傷組織的繼代；DCR與WPM培養(yǎng)基對(duì)繼代培養(yǎng)沒有明顯差異(表7)。處理1相較于處理2以及處理5相較于處理6，較低濃度的NAA與6-BA使其綠色愈傷率均提高約20%，更低濃度的NAA與6-BA更適于繼代培養(yǎng)，但愈傷組織無增殖。

表7 馬尾松胚乳愈傷組織的轉(zhuǎn)化Table 7 Succession of endosperm callus of Pinus massoniana

將綠色的愈傷組織進(jìn)一步增殖(表8)。培養(yǎng)基Z1～Z3的增殖率沒有顯著差異，Z1和Z2誘導(dǎo)率稍高。在增殖速度上，Z1、Z2高于Z3，Z1與Z2的愈傷組織綠色更深，愈傷組織質(zhì)密，表面有些許突起，出現(xiàn)即將分化的征兆(圖2:a)；而Z3的愈傷組織綠色較淺且質(zhì)地疏松(圖2:b)。因此馬尾松胚乳愈傷組織的增殖培養(yǎng)基以添加NAA 0.1 mg·L-1、6-BA(或KT)2.0 mg·L-1較佳，增殖率可達(dá)80%以上。

圖2 馬尾松胚乳綠色愈傷組織Fig.2 Green callus of Pinus massoniana endosperm

表8 馬尾松胚乳愈傷組織增殖Table 8 Proliferation of callus of Pinus massoniana endosperm

3 結(jié)論與討論

由于外植體通常具有較多的表面污物和內(nèi)生菌易發(fā)生污染[17]，因此在植物組織培養(yǎng)中首先應(yīng)對(duì)外植體進(jìn)行消毒處理。研究發(fā)現(xiàn)，馬尾松剝殼種子最佳消毒方式為75%酒精30 s+2% NaClO 15 min。NaClO處理不但能徹底消毒，還能較好地保持胚乳活性，而 HgCl2毒性較大，對(duì)胚乳材料造成較大的傷害，不宜作為馬尾松去殼種子的消毒劑。

本研究表明，基本培養(yǎng)基DCR與WPM比GD更適合馬尾松胚乳愈傷誘導(dǎo)和繼代培養(yǎng)?；九囵B(yǎng)基為外植體提供營養(yǎng)物質(zhì)并起支撐作用[18]，其中營養(yǎng)元素的種類和濃度適合于外植體是組織培養(yǎng)成功的前提。前人研究發(fā)現(xiàn)，在針葉樹組織培養(yǎng)中培養(yǎng)基氮元素一般需低濃度[19]。GD培養(yǎng)基氮元素濃度較高，而DCR與WPM培養(yǎng)基氮元素濃度較低。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，在馬尾松胚乳組織培養(yǎng)中生長素比細(xì)胞分裂素更重要，且是必需的；細(xì)胞分裂素可增加愈傷的誘導(dǎo)頻率，但不是必需的。沒有生長素的培養(yǎng)基極難誘導(dǎo)出愈傷組織(如正交試驗(yàn)1號(hào)處理誘導(dǎo)率只有2.50%)；而沒有細(xì)胞分裂素的培養(yǎng)基，仍能以較高頻率誘導(dǎo)出愈傷組織(如正交試驗(yàn)6號(hào)處理誘導(dǎo)率達(dá) 56.25%，8號(hào)處理誘導(dǎo)率達(dá) 53.75%)。植物生長調(diào)節(jié)劑的比例在組織培養(yǎng)中很重要。吳元立等[20]發(fā)現(xiàn)，在銀杏(Ginkgo biloba)成熟胚乳培養(yǎng)中，細(xì)胞分裂素與生長素的比值在0.5～0.9范圍內(nèi)能有效誘導(dǎo)愈傷組織發(fā)生，在 0.9時(shí)誘導(dǎo)率最高。初立業(yè)等[21]認(rèn)為，在松科植物的組織培養(yǎng)中，通常是高濃度生長素配合低濃度細(xì)胞分裂素的愈傷誘導(dǎo)效果較好。本研究中，細(xì)胞分裂素與生長素比例為0.5時(shí)，愈傷誘導(dǎo)效果最好(如正交試驗(yàn) 9號(hào)處理67.5%和4號(hào)處理68.75%)，繼代培養(yǎng)則需要較低濃度的生長素(0.1 mg·L-1NAA)與細(xì)胞分裂素，否則引起愈傷褐化。此外，生長素總濃度過高抑制愈傷的發(fā)生，兩個(gè)最佳組合處理的生長素總濃度均達(dá)4.0 mg·L-1，在此濃度下馬尾松胚乳愈傷組織的誘導(dǎo)受到抑制。本研究中，培養(yǎng)基DCR+NAA 2.0 mg·L-1+ 6-BA 1.0 mg·L-1對(duì)馬尾松胚乳愈傷誘導(dǎo)效果最佳，誘導(dǎo)率高達(dá)68.75%。

愈傷組織的繼代與增殖需要低濃度 NAA(0.1 mg·L-1)，愈傷組織須在低濃度細(xì)胞分裂素(0.5 mg·L-1)下進(jìn)行轉(zhuǎn)化，適應(yīng)光照環(huán)境，此條件下幾乎無增殖，繼代20 d后以濃度稍高的6-BA或KT(2.0 mg·L-1)調(diào)節(jié)增殖，愈傷增殖率高達(dá)83.33%，愈傷質(zhì)密，增殖效果好，說明在馬尾松愈傷增殖中適用更高濃度的細(xì)胞分裂素。

馬尾松愈傷組織誘導(dǎo)和生長緩慢，通常需要60 d才能形成團(tuán)狀愈傷組織，而本研究發(fā)現(xiàn)，適宜的熱激處理不僅可提高馬尾松胚乳愈傷質(zhì)量并加快愈傷組織成團(tuán)時(shí)間。呂曉波等[22]在愈傷誘導(dǎo)中首先運(yùn)用熱激處理，對(duì)于粳稻花藥的愈傷誘導(dǎo)率提升12.5%。齊力旺等[23]在幾種裸子植物胚乳培養(yǎng)中也運(yùn)用了熱激處理，熱激后愈傷較好，并且相較于未熱激的處理，愈傷誘導(dǎo)率提高 55%～60%。本研究與之不同的是適宜的熱激處理愈傷誘導(dǎo)率無顯著性變化，但熱激的愈傷狀況更好。王敬駒等[24]認(rèn)為在胚乳培養(yǎng)中存在假愈傷組織化現(xiàn)象，一般這一狀態(tài)突破時(shí)間較長，而熱激可打破這一現(xiàn)象，加快胚乳組織成為真正的愈傷組織的進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，45 ℃下處理胚乳10 min，愈傷誘導(dǎo)率最高且質(zhì)量最好，加快了愈傷組織的形成，僅需30 d即可形成團(tuán)狀愈傷組織，節(jié)省了時(shí)間成本。但熱激時(shí)間過長或過短都對(duì)愈傷誘導(dǎo)無促進(jìn)作用，10 min較合適。

本研究確定了適用于馬尾松胚乳組織培養(yǎng)外植體的消毒方式，發(fā)現(xiàn)熱激處理可提高愈傷誘導(dǎo)率和質(zhì)量；生長素可促進(jìn)胚乳愈傷誘導(dǎo)，且是必需的；細(xì)胞分裂素浸泡種子可代替培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素，且能取得較理想的效果；初步確定WPM和DCR培養(yǎng)基適用于馬尾松胚乳組培。培養(yǎng)基(DCR+NAA 2.0 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1)的愈傷誘導(dǎo)率最高，可作為進(jìn)一步優(yōu)化馬尾松胚乳愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)。通過繼代培養(yǎng)成功得到綠色愈傷組織，在增殖培養(yǎng)基(WPM+NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1+蔗糖 30 g·L-1+瓊脂7 g·L-1)中愈傷增殖率達(dá)80%以上，愈傷質(zhì)密，為后續(xù)愈傷分化奠定了基礎(chǔ)。