杜晗蔚，羅艷敏，呂閃閃，孫金鳳，王延凱，胡秀麗，田志強(qiáng)

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

高溫脅迫作為一種限制產(chǎn)量的因素，已經(jīng)成為糧食安全的主要威脅之一。目前對植物響應(yīng)熱脅迫機(jī)制的研究大多集中在擬南芥方面，而在農(nóng)作物方面，對脅迫耐受性分子機(jī)制的系統(tǒng)研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)滯后于擬南芥。與擬南芥相比，農(nóng)作物通常更為復(fù)雜，并可能具有其他機(jī)制來應(yīng)對熱脅迫，不同的農(nóng)作物可能具有獨(dú)特及相同的高溫脅迫響應(yīng)基因和機(jī)制[1]。玉米是世界上最重要的農(nóng)作物之一。近幾年，頻繁發(fā)生的熱脅迫對玉米生長、產(chǎn)量和品質(zhì)等均有不利影響。因此，對玉米耐逆性進(jìn)行更深入的研究將有助于發(fā)現(xiàn)提高玉米耐逆性的新基因和機(jī)制，服務(wù)于分子育種[2-3]。

植物已經(jīng)進(jìn)化出復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，以快速響應(yīng)生物和非生物環(huán)境脅迫[1,4]。CDPKs作為一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，參與植物眾多生理過程。每個CDPK均受到多種機(jī)制的嚴(yán)格調(diào)控，以確保準(zhǔn)確的信號傳輸和足夠的響應(yīng)激活[5-6]。一些CDPKs能夠?qū)Χ喾N刺激做出反應(yīng)，包括鹽、干旱、寒冷、脫落酸(abscisic acid，ABA)和過氧化氫(H2O2)[7-10]。然而，關(guān)于哪種CDPK調(diào)節(jié)植物對高溫脅迫信號響應(yīng)的相關(guān)信息仍然有限。研究表明，只有擬南芥Ca2+/CaM依賴性AtCBK3可以激活熱應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子(heat shock factor，HSF)，從而進(jìn)一步觸發(fā)下游熱激蛋白(heat shock protein，HSP)的表達(dá)，以提高耐熱性[11]。然而，ZmCDPKs在植物響應(yīng)高溫脅迫中的作用機(jī)制仍不清楚。

熱應(yīng)激會導(dǎo)致未折疊的蛋白質(zhì)積累，而這些蛋白質(zhì)對植物細(xì)胞有害。為了抵抗熱脅迫，植物產(chǎn)生了使這些未折疊的蛋白質(zhì)復(fù)性或降解的機(jī)制。HSF介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)途徑是耐熱性的主要調(diào)節(jié)因子[19-22]。高溫脅迫條件下，HSF能夠迅速誘導(dǎo)HSP的表達(dá)。而HSPs作為分子伴侶，可以通過使變性蛋白復(fù)性進(jìn)而在維持蛋白質(zhì)含量中起重要作用[23]。研究表明，Ca2+/CaM 參與高溫、干旱高溫復(fù)合脅迫誘導(dǎo)的sHSP表達(dá)量的增加和抗氧化防護(hù)酶活性的提高[24]。

全球變暖對農(nóng)作物產(chǎn)量構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。CDPK/CPK在植物對逆境的響應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用。但是，關(guān)于CDPKs在植物抵抗高溫脅迫中的作用機(jī)制仍然不清楚。本研究分析了玉米中40種CDPKs的結(jié)構(gòu)特征，并通過玉米原生質(zhì)體瞬時過表達(dá)或沉默技術(shù)發(fā)現(xiàn)ZmCDPK7可以在提高玉米耐熱性中起到顯著的作用。這不僅為理解CDPKs提高作物耐熱機(jī)制提供了理論依據(jù)，而且將為培育出一批綜合抗性突出、適應(yīng)性廣的優(yōu)良玉米新品種提供候選基因資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以玉米品種鄭單958葉片為試驗(yàn)材料。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米CDPK家族的進(jìn)化樹分析 使用DNAMAN軟件對40個CDPKs的氨基酸序列進(jìn)行比對后，又運(yùn)用MEGA5中的鄰接法(NJ)[25-26]構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 玉米CDPK家族的特征分析 使用PROSITE(https://prosite.expasy.org/)預(yù)測ZmCDPKs的蛋白結(jié)構(gòu)域和功能位點(diǎn)。

1.2.3ZmCDPK1-40表達(dá)分析 對玉米品種鄭單958三葉期幼苗進(jìn)行8 h的高溫處理后取第2片葉，使用RNAprep Pure植物總RNA提取試劑盒(TsingKe,Beijing)提取葉片總RNA；使用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Vazyme, Nanjing) 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix(Vazyme, Nanjing)、 StepOnePlus熒光定量PCR儀(ABI，the USA)進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR(所用引物見原文相關(guān)附件中表1)。ZmActin7是本試驗(yàn)的內(nèi)參基因。

1.2.4ZmCDPK7瞬時表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)化 使用玉米泛素基因Ubi啟動子驅(qū)動的真核表達(dá)載體pXZP008進(jìn)行重組載體的構(gòu)建。構(gòu)建方法是同源重組法。對載體的BamHⅠ(5′GGATCC 3′),XbaⅠ(5′TCTAGA 3′)兩個位點(diǎn)進(jìn)行雙酶切；以玉米品種鄭單958三葉期幼苗葉片cDNA為模板，使用KOD OneTM PCR Master Mix(TOYOBO，Shanghai)高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增合成(所用引物見原文相關(guān)附件中附表1)；使用ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit試劑盒(Vazyme, Nanjing)進(jìn)行同源重組；使用大腸桿菌(Escherichiacoli)感受態(tài)細(xì)胞(DH5α)進(jìn)行重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化。

1.2.5ZmCDPK7dsRNA(雙鏈RNA)的制備 根據(jù)RNAi的引物設(shè)計原則,設(shè)計用來制備體外轉(zhuǎn)錄DNA模板的引物：ds-ZmCDPK7-F和ds-ZmCDPK7-R。使用2×Taq Master Mix(Vazyme, Nanjing)、玉米葉片cDNA,RNase-free H2O,ds-ZmCDPK7-F和ds-ZmCDPK7-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到用于體外轉(zhuǎn)錄的DNA模板(所用引物見原文相關(guān)附件中表1)。使用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production System-T7試劑盒(Promega，the USA)做基因沉默。

1.2.6 原生質(zhì)體制備 將玉米品種鄭單958幼苗進(jìn)行黑暗培養(yǎng)使其黃化，取黃化苗的第2片葉切成細(xì)絲，浸入20 mL 酶解液，避光，放入真空泵抽真空40 min 左右，再置于水平搖床上40 r·min-1酶解3 h。酶解完成后80 r·min-1震蕩5 min。通過300目細(xì)胞篩過濾，將濾液分裝入2 mL 離心管中，100×g離心2 min，棄上清液，加入1 mL 冰上預(yù)冷的洗脫緩沖液緩慢吹打，使原生質(zhì)體懸浮，冰上孵育40 min。120×g 離心2 min， 棄上清液，加入1 mL MMG溶液緩慢吹打，重懸原生質(zhì)體。配方見表1。

1.2.7 原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化 分別取20 μg 瞬時表達(dá)載體pXZP008-ZmCDPK7質(zhì)粒和25 μg制備得到的雙鏈至2 mL 離心管中，緩慢加入100 μL 原生質(zhì)體，輕輕吹打混勻。緩慢加入110 μL PEG4000溶液，輕輕吹打混勻。黑暗下25 ℃孵育40 min。緩慢加入440 μL 洗脫緩沖液，輕輕顛倒混勻。100 g 離心2 min，棄上清液。再次加入440 μL 洗脫緩沖液離心洗滌1次。加入1 mL 原生質(zhì)體培養(yǎng)液重懸原生質(zhì)體，再加入1 μL 羧芐青霉素，25 ℃黑暗培養(yǎng)20 h。所需試劑配方見表1[27]。

表1 玉米原生質(zhì)體提取及轉(zhuǎn)化所需溶液的配制Table 1 The preparation of solutions for corn protoplast extraction and transformation

1.2.8 原生質(zhì)體生理指標(biāo)測定 收集瞬時表達(dá)載體pXZP008-ZmCDPK7和制備得到的雙鏈轉(zhuǎn)化后的原生質(zhì)體到離心管內(nèi)，34 ℃，30 min脅迫處理,參照蘇州科銘生物的生理指標(biāo)測定試劑盒。測定H2O2含量、CAT活性、APX活性及MDA含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米CDPK家族的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

玉米CDPK家族成員的鑒定，在一些文獻(xiàn)中已經(jīng)有過報道，分別鑒定了35個CDPKs成員[28]、39個CDPKs成員[29]或40個CDPKs成員[30]。但基于NCBI基因數(shù)據(jù)庫的更新，本研究對玉米中的CDPK 家族成員進(jìn)行了新的鑒定。使用已知的擬南芥和水稻的CDPK蛋白質(zhì)序列在NCBI上(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)對玉米的基因數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST搜索。通過反復(fù)的序列比對，從玉米基因庫中鑒定了40個CDPKs(ZmCDPK1～ZmCDPK40),分析得到了每個CDPK的基因組序列、cDNA序列以及啟動子序列。為了進(jìn)一步了解40個ZmCDPKs之間的親緣關(guān)系，使用MEGA7[31]的NJ(Neighbor-joining)法[32]構(gòu)建玉米CDPK家族的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。Bootstrap共同樹[33]是由1 000次重復(fù)推斷得到的，用于分析類群的進(jìn)化歷史。構(gòu)建時使用泊松校正方法計算進(jìn)化距離。該分析涵蓋了所有的40個ZmCDPKs的氨基酸序列。

系統(tǒng)進(jìn)化樹將玉米CDPK家族分成了4個不同的亞族。 The phylogenetic tree divides the maize CDPK family into four different subfamilies.

為了分析ZmCDPK家族的保守性，對玉米CDPK家族的4個亞族的成員分別進(jìn)行了基因(圖2)與蛋白結(jié)構(gòu)分析(圖3)。玉米CDPK家族基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)顯示出了ZmCDPKs的外顯子結(jié)構(gòu)在遺傳水平上是高度保守的。在40個ZmCDPKs基因中，有29個具有7或8個外顯子。同時ZmCDPK家族蛋白的結(jié)構(gòu)域也具有很高的保守性，均包含氨基端可變區(qū)、激酶功能區(qū)、連接區(qū)及鈣調(diào)蛋白類結(jié)構(gòu)域。

圖中全長代表ZmCDPK基因在基因組中的完整序列，黑色區(qū)域代表基因的外顯子，灰色區(qū)域代表基因的內(nèi)含子。外顯子數(shù)目顯示了其分布的的保守性，這也間接地展現(xiàn)出了家族各基因之間的親緣關(guān)系。 The full length in the figure represents the complete sequence of the ZmCDPK gene in the genome. The black region represents the exon of the gene, and the gray region represents the intron of the gene.The number of exons shows the conservation of its distribution, which also indirectly shows the genetic relationship between the genes of the family.

圖中全長代表ZmCDPK蛋白完整的氨基酸序列。灰色區(qū)域代表氨基端可變區(qū)；青綠色區(qū)域代表激酶功能區(qū)；淡紫色區(qū)域代表連接區(qū)；磚紅色區(qū)域代表鈣調(diào)蛋白類結(jié)構(gòu)域。 The full length in the figure represents the complete amino acid sequence of the ZmCDPK protein.The gray region represents the amino terminal variable region; the cyan region represents the kinase functional region; the lavender region represents the junction region; and the brick red region represents the calmodulin-like domain.

2.3 玉米CDPK家族基因的染色體分布

為了深入了解ZmCDPK家族，利用MapInspect軟件繪制了玉米CDPK家族基因的染色體分布圖(圖4)。標(biāo)尺代表各染色體的基因組大小，將ZmCDPK1～ZmCDPK40分別標(biāo)記在各染色體的不同位置上，這也是它們在各染色體基因組上真實(shí)的分布位置。從圖4中ZmCDPKs的染色體分布圖可以看出，40個ZmCDPKs在1,2,3,4，5，7，8，10號染色體上有分布。其中，ZmCDPK3，ZmCDPK6，ZmCDPK20，ZmCDPK8分布在1號染色體上；ZmCDPK1，ZmCDPK11，ZmCDPK25，ZmCDPK12，ZmCDPK15，ZmCDPK14，ZmCDPK7，ZmCDPK17分布在2號染色體上；ZmCDPK27，ZmCDPK29，ZmCDPK18，ZmCDPK34，ZmCDPK16分布在3號染色體上；ZmCDPK5，ZmCDPK23，ZmCDPK19，ZmCDPK21，ZmCDPK24分布在4號染色體上；ZmCDPK30，ZmCDPK31，ZmCDPK10，ZmCDPK9，ZmCDPK26分布在5號染色體上；ZmCDPK33，ZmCDPK22，ZmCDPK2，ZmCDPK32分布在7號染色體上；ZmCDPK37，ZmCDPK36，ZmCDPK38，ZmCDPK13，ZmCDPK35分布在8號染色體上；ZmCDPK28，ZmCDPK39，ZmCDPK4，ZmCDPK40分布在10號染色體上。結(jié)果顯示了40個ZmCDPKs可能各自具有不同的表達(dá)調(diào)控模式。

比例尺代表基因組大小，mtmt代表玉米的染色體，各條染色體的長度均顯示其真實(shí)的基因組大小(與比例尺比較)。 The scale represents the size of the genome, mtmt represents the chromosome of the corn, and the length of each chromosome shows its true genome size(Compared to the scale).

在玉米幼苗遭受8 h的高溫處理后，應(yīng)用實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR)分析了玉米的40個CDPKs表達(dá)特性。結(jié)果顯示，與對照相比，在40個ZmCDPKs中，ZmCDPK6，ZmCDPK7，ZmCDPK13，ZmCDPK30，ZmCDPK32，ZmCDPK33，ZmCDPK37，ZmCDPK38，ZmCDPK40等多個ZmCDPKs的表達(dá)受高溫脅迫誘導(dǎo)，但其中ZmCDPK7最為顯著(圖5)。

A，ZmCDPK1-20表達(dá)分析；B，ZmCDPK21-40表達(dá)分析。數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示 (3個生物學(xué)重復(fù))。 A, ZmCDPK1-20 expression analysis; B, ZmCDPK21-40 expression analysis.The data are expressed as mean±standard deviation (3 biological replicates).

2.5 ZmCDPK7對熱誘導(dǎo)的ZmRBOHs，ZmAPX1，ZmCAT1與ZmHSPs表達(dá)的影響

利用PEG介導(dǎo)的ZmCDPK7在玉米原生質(zhì)體中瞬時遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，研究了ZmCDPK7對ZmCAT1，ZmAPX1，ZmsHSP17.4，ZmHSP70與ZmRBOHs表達(dá)的影響。將ZmCDPK7瞬時過表達(dá)載體pXZP008-ZmCDPK7，ZmCDPK7瞬時沉默dsRNA分別轉(zhuǎn)入玉米原生質(zhì)體，培養(yǎng)20 h后進(jìn)行34 ℃，30 min高溫處理，提取原生質(zhì)體RNA，利用qRT-PCR分析ZmRBOHs的基因表達(dá)水平。結(jié)果顯示，與對照相比，瞬時過表達(dá)ZmCDPK顯著促進(jìn)了高溫誘導(dǎo)的ZmHSPs17.4，ZmHSP70，ZmCAT1，ZmAPX1的表達(dá)(圖6 A～D)及CAT和APX的酶活性增加(圖6 E～F)，但抑制了高溫誘導(dǎo)的MDA和H2O2含量的增加(圖6G～H)；而瞬時沉默ZmCDPK7后，結(jié)果正好與此相反(圖6I～P)。

圖中OE-ZmCDPK7代表在玉米原生質(zhì)體中瞬時過表達(dá)ZmCDPK7；RNAi-ZmCDPK7代表瞬時沉默ZmCDPK7。數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(3個生物學(xué)重復(fù))；不同字母表示各組之間差異顯著(Duncan’s test，P<0.05)。 In the figure, OE-ZmCDPK7 represents transient overexpression of ZmCDPK7 in maize protoplasts; RNAi-ZmCDPK7 represents transient silencing of ZmCDPK7.The data represent mean ± standard deviation (3 biological replicates); different letters indicate significant differences between groups (Duncan’s test, P<0.05).

此外，瞬時過表達(dá)和沉默ZmCDPK7后，與對照組相比，分別顯著促進(jìn)和抑制了高溫脅迫誘導(dǎo)的ZmRBOHA(圖7A和E)和ZmRBOHB(圖7B和F)的表達(dá)水平，但對ZmRBOHC(圖7C和G)和ZmRBOHD(圖7D和H)的基因表達(dá)水平?jīng)]有顯著影響。

數(shù)據(jù)表示平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(3個生物學(xué)重復(fù))；不同字母表示各組之間差異顯著(Duncan’s test，P<0.05)。 The data represents mean±standard deviation (3 biological replicates); different letters indicate significant differences between groups (Duncan’s test, P<0.05).

3 結(jié)論與討論

鈣依賴蛋白激酶CDPKs蛋白家族在植物中廣泛存在，在植物生長發(fā)育、環(huán)境脅迫響應(yīng)中起著重要的作用[34-36]。為了確定ZmCDPK7在玉米原生質(zhì)體耐熱性的作用研究，分析了玉米CDPK家族的基因以及蛋白特征，玉米CDPK基因的外顯子分布結(jié)構(gòu)以及蛋白質(zhì)的功能結(jié)構(gòu)域的分布結(jié)構(gòu)均是非常保守的。這些數(shù)據(jù)均驗(yàn)證了玉米中的40個ZmCDPKs基因類似水稻和小麥中的CDPKs[37-38]。

在玉米中，關(guān)于CDPKs響應(yīng)非生物脅迫的報道大多集中在凍害[39]、干旱[40]以及損傷[41]等方面，而關(guān)于ZmCDPK響應(yīng)并調(diào)控高溫脅迫的報道卻很少。從40個ZmCDPKs基因中鑒定到了在高溫脅迫條件下表達(dá)水平會顯著增加的ZmCDPK7。本研究表明，ZmCDPK7的啟動子中有一個響應(yīng)高溫脅迫的順式作用元件CCAAT-box，這可能是ZmCDPK7響應(yīng)高溫脅迫的主要原因之一，但是還需要通過進(jìn)一步啟動子活性分析來驗(yàn)證這一假設(shè)。

運(yùn)用原生質(zhì)體瞬時轉(zhuǎn)化體系，發(fā)現(xiàn)ZmCDPK7的瞬時過表達(dá)和沉默可以分別提高和降低高溫誘導(dǎo)的ZmsHSP17.4，ZmHSP70，ZmRBOHs的基因表達(dá)水平增加。這表明ZmCDPK7參與調(diào)控了高溫誘導(dǎo)的ZmsHSP17.4，ZmHSP70，ZmRBOHs的表達(dá)。植物體在遭受非生物脅迫后，常伴隨有蛋白質(zhì)的變性現(xiàn)象，而sHSP和HSP70家族蛋白能夠穩(wěn)定蛋白質(zhì)構(gòu)象，幫助變性蛋白維持可重折疊的感受態(tài)狀態(tài)，這對于植物抵抗高溫脅迫是極其重要的[41]。ZmCDPK7可能通過調(diào)控ZmsHSP17.4和ZmHSP70伴侶活性提高了玉米對高溫脅迫的耐性。植物RBOHs能夠通過調(diào)節(jié)植物體內(nèi)活性氧(ROS)的含量參與植物脅迫反應(yīng)。本研究表明，ZmCDPK7能夠調(diào)節(jié)玉米中一些RBOHs的活性，從而在提高玉米的耐熱性中發(fā)揮作用。此外，ZmCDPK7的瞬時過表達(dá)還可以增加高溫誘導(dǎo)的抗氧化防護(hù)酶APX1，CAT1的表達(dá)量，以及二者的活性，抑制高溫脅迫誘導(dǎo)的MDA與H2O2的含量。而瞬時沉默ZmCDPK7則表現(xiàn)出相反的作用。這些結(jié)果均能夠說明，ZmCDPK7在玉米響應(yīng)高溫脅迫時發(fā)揮了重要的作用。

綜上所述，本研究揭示了在玉米遭受高溫脅迫時，ZmCDPK7很有可能作為脅迫信號通路的收斂點(diǎn)，從多個方面作用來提高玉米的耐高溫脅迫能力。ZmCDPK7在玉米高溫脅迫中的功能分析為提高植物耐性方面提供了一定的理論依據(jù)，同時也進(jìn)一步完善了單子葉作物響應(yīng)高溫脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，但仍有很多具體調(diào)控的機(jī)制不清楚，需要進(jìn)一步深入研究。