賈利強(qiáng)， 趙秋芳， 陳曙

(1.貴州師范學(xué)院生物科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550018； 2.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所，廣東 湛江 524091)

DNA Binding with one finger (DOF)轉(zhuǎn)錄因子是鋅指蛋白 (zinc finger proteins)家族的一個(gè)亞家族，是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子。DOF家族基因在動(dòng)物基因組中沒有同源基因，在其蛋白序列中具有一個(gè)明顯的鋅指結(jié)構(gòu)，所以這類植物特有的單個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子命名為DOF(DNA-binding with one finger)蛋白[1]。所有的DOF蛋白的N端具有一個(gè)保守的大約有52個(gè)氨基酸組成的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域C2-C2鋅指結(jié)構(gòu)，這個(gè)結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合到靶基因的啟動(dòng)子順勢(shì)元件序列AAAG上，調(diào)控靶基因的表達(dá)[2]。另外，在DOF蛋白的N端含有一個(gè)雙向的核定位信號(hào)序列(NLS,bipartite nuclear localization signal)[3]。DOF蛋白的C端序列的不保守，有報(bào)道表明,DOF蛋白的C端調(diào)控許多下游基因的表達(dá)，在植物的生長發(fā)育進(jìn)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4-5]。迄今為止，已報(bào)道了許多作物的DOF基因家族，大麥中有75個(gè)DOF基因[6],玉米中有46個(gè)[7],馬鈴薯中有35個(gè)[8], 大豆中有28個(gè)[9],木豆中有38個(gè)[10],水稻中有30個(gè)[11],42個(gè)候選DOF基因發(fā)現(xiàn)于苜?；蚪M中[12],25個(gè)在甘蔗中[13]。

玉米的DOF基因家族的初步研究已有報(bào)道，但是,這個(gè)家族基因在玉米生長發(fā)育中及應(yīng)答逆境脅迫的定量表達(dá)數(shù)據(jù)還很缺乏。本研究選用其中的一個(gè)亞家族共計(jì)8個(gè)基因作為研究對(duì)象，研究了這8個(gè)基因在玉米自交系鄭58不同器官中的特異表達(dá)模式及應(yīng)答NaCl，PEG6000，銨態(tài)氮和硝態(tài)氮脅迫時(shí)的響應(yīng)表達(dá)模式，為深入研究這些DOF基因的功能提供了有用的信息。

1 材料與方法

1.1 材料與試驗(yàn)處理

試驗(yàn)材料為玉米自交系鄭58。在鄭58授粉期及授粉15 d后采集根、莖、葉、花、穗和苞葉，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。對(duì)于NaCl和PEG 6000脅迫試驗(yàn)。參照前人的研究結(jié)果，玉米鄭58種子用2%的次氯酸鈉表面消毒，28 ℃黑暗催芽，挑選發(fā)芽一致的種子放置于固定在泡沫漂浮板的紗網(wǎng)上，于Hoagland培養(yǎng)液中生長，為了使根系健壯生長和防止綠藻產(chǎn)生，水培容器和支持苗的平板采用不透光的塑料。在人工氣候室(28 ℃光照16 h，黑暗8 h)長至三葉一心時(shí)，挑選大小一致的玉米幼苗轉(zhuǎn)到200 mmol·L-1NaCl溶液或者20%的PEG 6000溶液脅迫處理，分別于處理的0，1,6和24 h時(shí)間點(diǎn)采取葉片，液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱備用。對(duì)于不同氮形態(tài)的脅迫試驗(yàn)，將發(fā)芽整齊一致的玉米鄭58種子生長于含2 mmol·L-1的硝酸鉀或氯化銨的Hoagland培養(yǎng)液中，每周更換新的培養(yǎng)液，生長3周后，轉(zhuǎn)到含有0.02 mmol·L-1的硝酸鉀或者氯化銨的Hoagland培養(yǎng)液脅迫處理，分別在脅迫處理的0，1，6和24 h時(shí)迅速采集葉片，液氮速凍后，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。以試?yàn)處理0 h的樣品作為空白對(duì)照，將3株幼苗混樣作為1次生物學(xué)重復(fù)，共設(shè)置2次生物學(xué)重復(fù)試驗(yàn)。

1.2 8個(gè)ZmDOF基因生物信息學(xué)分析

本研究中，8個(gè)ZmDOF的蛋白和核苷酸序列及擬南芥的36個(gè)DOF蛋白序列。

從Phytozome中下載(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。根據(jù)在染色體中的物理位置，輸入到軟件MapInspect (http://www.plantbreeding.wur.nl/uk/software-mapinspect.html)，繪制這8個(gè)基因在染色體中的位置圖。這8個(gè)玉米DOF蛋白和擬南芥36個(gè)DOF蛋白生成的數(shù)據(jù)陣，利用軟件MEGA10(http://meme-suite.org/tools/meme)中的MUSLE算法進(jìn)行比對(duì)，取保守序列，用NJ法進(jìn)行進(jìn)化樹計(jì)算，參數(shù)設(shè)置為P-distance，pairwise deletion，bootstrap值取1 000。利用這8個(gè)基因的CDS和基因組序列，輸入在線軟件GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn)，繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用在線軟件MEME(http://meme-suite.org)對(duì)8個(gè)ZmDOF蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域搜索。

1.3 RNA提取及定量PCR

玉米葉片總RNA的提取利用Trizol試劑盒 (Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)提取。用DNase I(Takara, Dalian, China)去除總RNA中可能污染的基因組DNA?？俁AN的質(zhì)量和純度用NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì) (Thermo Scientific, USA)來測(cè)定。取3 μg總RNA用Super Script Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶(TaKaRa,Dalian,Chian)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，生成cDNA稀釋5倍用于后續(xù)的定量PCR反應(yīng)(羅氏480實(shí)時(shí)定量PCR儀)。擴(kuò)增體系為1 μL cDNA、上下游引物各0.5 μL、SYBR反應(yīng)MIX(2×)為5 μL和3 μL水。設(shè)定的PCR程序?yàn)椋?個(gè)循環(huán)95 ℃ 30 s; 45個(gè)循環(huán)95 ℃ 5 s; 60 ℃ 20 s; 72℃ 10 s。利用2-△△Ct算法來計(jì)算ZmDOF基因的相對(duì)表達(dá)量。玉米actin基因用作內(nèi)參。用于定量的8個(gè)玉米DOF基因的引物見表1。所有的試驗(yàn)重復(fù)至少3次，用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

表1 8個(gè)ZmDOF基因的實(shí)時(shí)熒光定量引物Table 1 qRT-PCR primers for expression on analysis of 8 ZmDOF genes

2 結(jié)果與分析

2.1 8個(gè)ZmDOF基因的生物信息學(xué)分析

根據(jù)玉米DOF基因家族的研究結(jié)果[35]，選定位于同一亞家族的8個(gè)基因作為研究對(duì)象，這8個(gè)基因是ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14，ZmDOF25，ZmDOF29，ZmDOF32，ZmDOF37和ZmDOF45(表2)，位于染色體1,2,4,5,7和10上 (圖1A)。除了ZmDOF45含有一個(gè)內(nèi)含子外，其他基因無內(nèi)含子 (圖1B)。這8個(gè)蛋白含有一個(gè)保守的C2-C2鋅指結(jié)構(gòu)域 (圖1C)。對(duì)這8個(gè)蛋白序列和36個(gè)擬南芥DOF蛋白序列構(gòu)成的數(shù)據(jù)列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 7軟件計(jì)算進(jìn)化樹，結(jié)果表明，這8個(gè)蛋白確實(shí)分布于一個(gè)亞家族中 (圖1D)。這個(gè)亞家族又可以進(jìn)一步細(xì)分為3個(gè)小家族，命名為Ⅰ,Ⅱ和Ⅲ，小家族Ⅰ包括4個(gè)基因，ZmDOF5，ZmDOF9,ZmDOF29和ZmDOF45；小家族Ⅱ包含有2個(gè)基因，ZmDOF14和ZmDOF37；小家族Ⅲ有2個(gè)基因，ZmDOF25和ZmDOF32。

表2 8個(gè)ZmDOFs的生物信息學(xué)分析

A.8個(gè)ZmDOF基因的染色體定位； B. 8個(gè)ZmDOF的基因結(jié)構(gòu)分析；

利用在線軟件MEME對(duì)這8個(gè)蛋白的保守基序進(jìn)行了分析，選取了前6個(gè)motif進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，Motif1分布于所有的這8個(gè)蛋白序列中。表明這個(gè)保守的基因序列在這8個(gè)DOF蛋白中有重要的作用。這個(gè)基因序列的分布模式也支持進(jìn)化樹的分類結(jié)果。一個(gè)家族內(nèi)蛋白具有相似的基因序列分布模式。亞家族Ⅲ的成員ZmDOF25和ZmDOF32都只有2個(gè)核心基序的分布。亞家族Ⅱ的成員ZmDOF14和ZmDOF37都有3個(gè)基序的分布且位置類似。

A. 8個(gè)ZmDOF蛋白的基序分析；B. 8個(gè)ZmDOF蛋白的基序分布示意圖。

選取玉米抽雄期根、莖、葉、雄花、穗和苞葉組織，利用熒光定量PCR技術(shù)，檢測(cè)了這8個(gè)基因的組織特異性表達(dá)模式。結(jié)果表明,這8個(gè)基因具有明顯的組織特異性表達(dá)特性 (圖3)。ZmDOF5，ZmDOF9和ZmDOF14主要在雌穗中表達(dá)，分別是根部表達(dá)的71,88和81倍以上。ZmDOF25和ZmDOF32主要在雄花中表達(dá)，分別是根部表達(dá)量的7 700倍和17倍。ZmDOF29主要在雄花和苞葉中表達(dá)，分別是根部表達(dá)量的33和14倍。ZmDOF45主要在雄花和根部表達(dá)，而ZmDOF37主要在苞葉中表達(dá)。這些表達(dá)數(shù)據(jù)表明，這些基因在玉米生長發(fā)育進(jìn)程中可能發(fā)揮著重要作用。

R，S，L，CB，T，E分別代表根、莖、葉、苞葉、雄花和幼穗。

這8個(gè)基因應(yīng)答逆境脅迫的響應(yīng)模式未知。為了探測(cè)這8個(gè)基因?qū)aCl脅迫和PEG脅迫的響應(yīng)模式，利用200 mmol·L-1的NaCl溶液和20% PEG 6000溶液處理三葉一心期的玉米幼苗，分別在處理后的0，1，6和24 h取葉片，利用熒光定量PCR技術(shù)探測(cè)了這8個(gè)基因的表達(dá)模式。所用到的引物見表1。在NaCl溶液脅迫處理1 h時(shí)，6個(gè)基因，ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14，ZmDOF32，ZmDOF37和ZmDOF45，表達(dá)量出現(xiàn)明顯上調(diào)，分別比處理前上調(diào)了6.9，3.7，2.1，3.9，2.7和4.5倍，之后這些基因的表達(dá)量又出現(xiàn)部分恢復(fù)，在脅迫處理24 h時(shí)，其表達(dá)量恢復(fù)到處理前的水平。表明這些基因是應(yīng)答NaCl脅迫的早期響應(yīng)基因。ZmDOF25和ZmDOF29在脅迫1 h后，表達(dá)出現(xiàn)明顯上調(diào)。直到脅迫處理結(jié)束，其表達(dá)量還維持在較高的水平。表明這2個(gè)基因在整個(gè)NaCl脅迫處理期間都處于被誘導(dǎo)的狀態(tài)。在20%PEG 6000溶液脅迫處理1 h后，ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14和ZmDOF25的表達(dá)量出現(xiàn)上調(diào)，分別比處理前上升了6.9，19.4，2.7和13.9倍。說明這些基因是應(yīng)對(duì)脅迫處理的早期響應(yīng)基因。而ZmDOF29，ZmDOF32，ZmDOF37和ZmDOF45的表達(dá)量在脅迫處理24 h后出現(xiàn)了明顯上調(diào)，分別比處理前上調(diào)了2.8，4.7，2.1和3.7倍。這表明這些基因是應(yīng)答PEG脅迫處理的晚期響應(yīng)基因。這些表達(dá)數(shù)據(jù)表明，這8個(gè)基因可能在不同時(shí)間內(nèi)不同程度地參與調(diào)控玉米應(yīng)答NaCl或PEG脅迫響應(yīng)途徑。

2.5 8個(gè)ZmDOFs對(duì)不同氮形態(tài)脅迫的響應(yīng)模式分析

本研究探測(cè)了這8個(gè)基因應(yīng)答銨態(tài)氮脅迫和硝態(tài)氮脅迫的響應(yīng)模式。結(jié)果表明，在這2種脅迫條件下，這8個(gè)基因的表達(dá)模式都發(fā)生了明顯變化(圖5)。在銨態(tài)氮脅迫處理1 h后，ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14，ZmDOF29，ZmDOF32和ZmDOF45都發(fā)生了明顯的上調(diào)，分別比處理前上調(diào)了3，4.5，3.5，6.6，5.1和4.9倍。銨態(tài)氮脅迫處理幾乎不影響對(duì)ZmDOF37基因的表達(dá)，表明ZmDOF37基因不參與玉米應(yīng)答銨態(tài)氮脅迫途徑。ZmDOF25的表達(dá)量在銨態(tài)氮脅迫處理早期沒有變化，在脅迫處理的24 h時(shí)，表達(dá)量上調(diào)了2.6倍，表明ZmDOF25是玉米應(yīng)答銨態(tài)氮脅迫的晚期響應(yīng)基因。相比于銨態(tài)氮脅迫處理，在硝態(tài)氮脅迫處理下，這8個(gè)基因的表達(dá)量變化幅度更大。其中有7個(gè)基因，ZmDOF5，ZmDOF9，ZmDOF14，ZmDOF25，ZmDOF29，ZmDOF32和ZmDOF45,在硝態(tài)氮脅迫處理1 h后，出現(xiàn)了明顯的上調(diào)，之后這7個(gè)基因的表達(dá)出現(xiàn)回落。相對(duì)于處理前，這7個(gè)基因的表達(dá)量分別上調(diào)了13.3，58.2，43.4，5.2，45.7，23.7和59.8倍。表明這些基因是玉米應(yīng)答硝態(tài)氮脅迫的早期響應(yīng)基因。ZmDOF37的表達(dá)受脅迫處理的抑制，在脅迫處理的1 h，其表達(dá)量下調(diào)了58%，在脅迫處理6 h時(shí)，其表達(dá)量更是出現(xiàn)了劇烈下降，表明ZmDOF37是玉米應(yīng)答硝態(tài)氮脅迫的負(fù)調(diào)控因子。這些表達(dá)數(shù)據(jù)表明，這8個(gè)基因在玉米應(yīng)答氮脅迫的響應(yīng)機(jī)制中可能發(fā)揮著生物學(xué)功能。

圖4 8個(gè)ZmDOFs對(duì)鹽脅迫和PEG脅迫的響應(yīng)模式

圖5 8個(gè)ZmDOFs應(yīng)答不同氮形態(tài)脅迫的響應(yīng)表達(dá)模式

3 結(jié)論與討論

利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)了一個(gè)DOF亞家族基因在玉米抽雄期不同器官中的表達(dá)模式。 結(jié)果表明,這8個(gè)基因的表達(dá)具有明顯的器官特異性。在前人的研究中，以玉米自交系B73為試驗(yàn)材料，利用RNA-Req技術(shù)，得出ZmDOF25主要在玉米的雄花、葉片和雌穗中表達(dá)，ZmDOF29在雌穗，ZmDOF32在幼嫩的莖、葉和雄花中表達(dá)，ZmDOF37在葉和穗部中表達(dá)[36]。而在本研究中，ZmDOF25在玉米的雄花中表達(dá)，ZmDOF29在苞葉和雄花中表達(dá)，ZmDOF32在雄花中表達(dá)，ZmDOF37主要在苞葉中表達(dá)。試驗(yàn)材料的不同可能是造成這些數(shù)據(jù)差異的原因之一。本研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充了前人的研究，用熒光定量PCR進(jìn)一步明確了這8個(gè)基因在玉米不同組織的表達(dá)模式，為研究這些基因在調(diào)控玉米組織器官生長發(fā)育進(jìn)程提供有用的信息。

葛敏等[37]利用土培的方法，在不同氮肥處理?xiàng)l件下，通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序比較了玉米V3期DOF基因家族的表達(dá)水平。其中，ZmDOF5,ZmDOF29和ZmDOF45沒有檢測(cè)到表達(dá)，ZmDOF9和ZmDOF25在高氮處理中表達(dá)，而低氮處理不表達(dá)，ZmDOF14則在高氮處理時(shí)不表達(dá)，而在低氮處理時(shí)表達(dá)，ZmDOF37則一直穩(wěn)定高表達(dá)。本研究利用更加靈敏的定量PCR技術(shù)，更能精細(xì)控制的水培系統(tǒng)，研究這8個(gè)ZmDOFs應(yīng)答不同氮形態(tài)的響應(yīng)表達(dá)模式。與前人的研究結(jié)果類似，ZmDOF5，ZmDOF29和ZmDOF45的本底表達(dá)量比較低，但是這3個(gè)基因在應(yīng)答不同氮形態(tài)脅迫時(shí)，其表達(dá)模式差異明顯，這3個(gè)基因?qū)ο鯌B(tài)氮脅迫表現(xiàn)敏感，都受到硝態(tài)氮脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。ZmDOF9和ZmDOF25也受到硝態(tài)氮脅迫的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，而不是抑制。不同品種的玉米幼苗在應(yīng)答氮脅迫時(shí)的耐受能力有明顯的差異，鄭單958耐受低氮脅迫的能力要強(qiáng)于浚單20、先玉335和登海662[38]。后續(xù)試驗(yàn)可以對(duì)這些品種的親本耐受低氮的能力進(jìn)行比較研究。