趙歡 王璟璐 廖生進(jìn) 張穎 盧憲菊 郭新宇 趙春江

摘要： 植物顯微表型主要是指植物組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞水平的表型信息，是植物表型組學(xué)研究的重要組成部分。針對(duì)傳統(tǒng)籽粒顯微性狀檢測(cè)方法效率低、誤差大且指標(biāo)單一等問(wèn)題，本研究利用Micro-CT掃描技術(shù)對(duì)5種類型11個(gè)品種玉米籽粒開(kāi)展顯微表型精準(zhǔn)鑒定研究。基于對(duì)CT序列圖像的處理解析，共獲取籽粒、胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔的34項(xiàng)顯微表型指標(biāo)。其中，胚乳空腔表面積、籽粒體積、胚乳體積比和胚乳空腔比表面積等4項(xiàng)表型指標(biāo)在不同類型玉米間差異顯著（P-value<0.05）。普通玉米胚乳空腔表面積和籽粒體積顯著大于其它類型玉米，高油玉米胚乳空腔比表面積最大，甜玉米胚乳空腔比表面積最小，爆裂玉米胚乳體積比最大。進(jìn)一步利用34項(xiàng)玉米籽粒表型指標(biāo)開(kāi)展差異分析和聚類分析，可將11個(gè)不同品種玉米分為四類，其中第一類以普通玉米為主，第二類以爆裂玉米為主，第三類是甜玉米，第四類是高油玉米。結(jié)果表明，Micro-CT掃描技術(shù)不僅可以實(shí)現(xiàn)玉米籽粒顯微表型的精準(zhǔn)鑒定，還可以為玉米籽粒分類、品種檢測(cè)等提供技術(shù)支撐。

關(guān)鍵詞： 植物表型組學(xué);顯微表型;Micro-CT;玉米籽粒;表型鑒定

中圖分類號(hào)： S126??? ??? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A??? 文章編號(hào)： 202103-SA004

引用格式：趙歡， 王璟璐， 廖生進(jìn)， 張穎， 盧憲菊， 郭新宇， 趙春江. 基于Micro-CT的玉米籽粒顯微表型特征研究[J]. 智慧農(nóng)業(yè)（中英文）， 2021， 3 （1）： 16-28.

Citation：ZHAO Huan， WANG Jinglu， LIAO Shengjin， ZHANG Ying， LU Xianju， GUO Xinyu， ZHAO Chunjiang. Study on the micro-phenotype of different types of maize kernels based on Micro-CT[J]. Smart Agriculture， 2021， 3 （1）： 16-28. （

1? 引? 言

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，隨著新一代信息技術(shù)迅速發(fā)展，大數(shù)據(jù)時(shí)代及育種4.0[1]的到來(lái)，使得農(nóng)業(yè)科學(xué)從傳統(tǒng)的理論科學(xué)、實(shí)驗(yàn)科學(xué)和計(jì)算科學(xué)轉(zhuǎn)向數(shù)據(jù)密集型知識(shí)發(fā)現(xiàn)研究的科學(xué)發(fā)展階段，推動(dòng)作物科學(xué)進(jìn)入以大數(shù)據(jù)為核心的組學(xué)研究時(shí)代[2]。進(jìn)入組學(xué)研究時(shí)代的農(nóng)業(yè)基礎(chǔ)研究，迫切需要借助先進(jìn)的信息化手段和自動(dòng)化、高通量的表型獲取與解析平臺(tái)，打破傳統(tǒng)作物表型鑒定和分析技術(shù)的限制，從組學(xué)研究高度深入挖掘“表型—基因型—環(huán)境型”內(nèi)在關(guān)系研究[2]，從而更好地為植物功能基因組學(xué)和作物分子育種研究服務(wù)[3]。

植物表型已在作物育種[4]、分子生物學(xué)[5]和微生物學(xué)[6]等多個(gè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。Tardieu等[7]將植物表型定義為反映植物結(jié)構(gòu)和組成的，或反映植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和結(jié)果的受基因型和環(huán)境互作產(chǎn)生的全部或部分可辨識(shí)特征和性狀。趙春江[2]對(duì)植物表型進(jìn)行更為系統(tǒng)、全面的總結(jié)，即植物表型是指能夠反映植物細(xì)胞、組織、器官、植株和群體結(jié)構(gòu)及功能的物理、生理和生化性狀。植物表型涉及范圍廣，小到核苷酸序列，大到植株群體[8-10]，都屬于植物表型的研究范疇。

顯微表型是植物表型的重要組成部分，是指在植物組織、細(xì)胞和亞細(xì)胞層面上能反映植株內(nèi)部和生化的特征和性狀[2]，在特異基因精準(zhǔn)鑒定和功能預(yù)測(cè)上能夠發(fā)揮重要作用。但相對(duì)于器官、植株和群體水平的表型信息獲取與解析，顯微表型相關(guān)工作相對(duì)較少、發(fā)展相對(duì)滯后。如何全面、快速獲得植物基于組織細(xì)胞的表型信息，是植物表型組學(xué)的重要研究?jī)?nèi)容。針對(duì)傳統(tǒng)顯微表型研究存在的問(wèn)題，構(gòu)建現(xiàn)代顯微表型研究技術(shù)是滿足當(dāng)前植物表型組學(xué)尤其是顯微表型精準(zhǔn)鑒定的關(guān)鍵。

以X射線掃描技術(shù)等為代表的新的成像技術(shù)極大促進(jìn)了植物表型組學(xué)和植物發(fā)育生物學(xué)的發(fā)展。X射線電子計(jì)算機(jī)斷層掃描——Micro-CT，是一種三維斷層掃描成像技術(shù)，根據(jù)植物不同組織對(duì)X射線吸收和透過(guò)率的差異，重建獲得植物組織的斷面或立體圖像[11]。Micro-CT最初應(yīng)用于醫(yī)學(xué)研究，后因?yàn)槠渚哂蟹乔秩胄?、非破壞性和高分辨率等特點(diǎn)，近幾年被逐漸引用到農(nóng)業(yè)領(lǐng)域中并得到高度關(guān)注。在玉米研究中，基于Micro-CT掃描技術(shù)可以從顯微水平對(duì)玉米表型進(jìn)行鑒定和功能研究，如提取玉米根系導(dǎo)管三維信息研究其與植物抗旱性的關(guān)系[12]，獲取莖稈維管束信息研究其與抗倒伏性的關(guān)系[13，14]等。將CT圖像與圖像自動(dòng)處理軟件相結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)玉米顯微表型數(shù)據(jù)的高通量獲取和解析，進(jìn)而與基因組數(shù)據(jù)相結(jié)合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，挖掘顯微表型相關(guān)的候選基因[11]，實(shí)現(xiàn)多組學(xué)間的交叉融合。

玉米籽粒作為決定玉米產(chǎn)量的重要“庫(kù)”，內(nèi)部含有淀粉、蛋白質(zhì)、脂肪、水溶性多糖、維生素、礦物質(zhì)以及人體必需的氨基酸等多種生理活性物質(zhì)[15]。根據(jù)玉米植物學(xué)特征和生物學(xué)特性，可將玉米籽粒劃分為多種類型。如根據(jù)特殊用途和利用價(jià)值，玉米籽?？杀粍澐譃槠胀ㄓ衩缀吞胤N玉米，其中特種玉米包含甜玉米、糯玉米、高油玉米和爆裂玉米等多種類型[16-19]。玉米籽粒主要由胚、胚乳和種皮構(gòu)成，近幾年研究還發(fā)現(xiàn)了玉米籽?？涨坏拇嬖?。根據(jù)其分布位置不同，空腔又被詳細(xì)劃分胚空腔、胚乳空腔和皮下空腔[20]。傳統(tǒng)玉米籽粒表型獲取分析方法主要分為兩大類，一是利用考種儀獲取玉米籽粒的常規(guī)RGB圖像并對(duì)其進(jìn)行分析，能得到籽粒的長(zhǎng)度、寬度、厚度和密度等外部形態(tài)特征表型參數(shù)，以及籽粒顏色紋理特征[21]。同Micro-CT相比，獲得樣品顏色紋理特征是常規(guī)RGB圖像具備的顯著優(yōu)勢(shì)，但其也具有不可忽略的局限性，即基于考種RGB圖像無(wú)法提供籽粒內(nèi)部形態(tài)特征，實(shí)現(xiàn)籽粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)研究。二是制作籽粒石蠟切片，在光學(xué)顯微鏡下觀察籽粒形態(tài)結(jié)構(gòu)并拍攝圖像，利用相關(guān)算法將多個(gè)切片圖像進(jìn)行疊加從而取得整個(gè)籽粒的表型特征。雖然采用“切片+顯微鏡”觀察能獲得籽粒內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)特征，但是切片制備過(guò)程復(fù)雜，會(huì)出現(xiàn)人工和機(jī)械誤差，使得獲取的序列圖像出現(xiàn)如位置偏移等諸多問(wèn)題，進(jìn)而導(dǎo)致基于切片圖像的三維重構(gòu)和可視化效果較差[22]。此外，籽粒切片處理后，籽粒完整性受到嚴(yán)重破壞，無(wú)法用于后續(xù)研究?；赬射線斷層掃描技術(shù)的植物作物學(xué)組織研究方法克服了傳統(tǒng)制片的復(fù)雜過(guò)程，實(shí)現(xiàn)了無(wú)損、三維的組織成像結(jié)果及三維表型的定量分析。Rousseau等[23]首次采用同步輻射X射線同軸成像顯微技術(shù)研究玉米籽粒的三維解剖結(jié)構(gòu)，并通過(guò)調(diào)節(jié)圖像閾值和主動(dòng)輪廓算法（Active Contour Method）進(jìn)行籽粒種皮、珠心、胚乳和胚等結(jié)構(gòu)的分割，驗(yàn)證了X射線斷層掃描技術(shù)能夠快速獲取植物組織的空間結(jié)構(gòu)和分割組織內(nèi)部不同的結(jié)構(gòu)信息;Guelpa等[24，25]利用uCT掃描估計(jì)粉質(zhì)胚乳和硬質(zhì)胚乳的真實(shí)密度以及整顆籽粒的密度，結(jié)合空腔比值和孔隙率實(shí)現(xiàn)了玉米籽粒硬度分類和品質(zhì)分級(jí);Shao等[26]基于Micro-CT獲取的玉米籽粒三維圖像發(fā)現(xiàn)玉米籽粒密度、孔隙度等表型特征與種子飽滿度分級(jí)密切相關(guān)。但是目前關(guān)于利用Micro-CT對(duì)不同類型玉米籽粒顯微表型特征進(jìn)行研究的報(bào)道尚不多見(jiàn)。

本研究以常見(jiàn)5種類型的11個(gè)品種玉米籽粒作為研究對(duì)象，研究基于Micro-CT的玉米籽粒顯微表型精準(zhǔn)鑒定方法，探究不同類型籽粒顯微性狀特征差異，以期為籽粒分類、品質(zhì)檢測(cè)提供依據(jù)。

2? 試驗(yàn)材料與方法

2.1 試驗(yàn)材料

選取常見(jiàn)5種類型的11個(gè)品種玉米籽粒作為研究對(duì)象，分別為普通玉米：B73，丹599，京92，京724，MC01;爆裂玉米：830和105;糯玉米：京黃糯269和京科糯2016;甜玉米：京科甜608;高油玉米：RY732。每個(gè)品種選取3顆生長(zhǎng)發(fā)育一致的籽粒用于后續(xù)CT掃描。

2.2 籽粒CT掃描

利用X-射線顯微CT系統(tǒng)（美國(guó)Bruker公司，SkyScan 1172型）對(duì)玉米籽粒進(jìn)行CT掃描。掃描電壓為40 kV，電流為250 uA，掃描像素間隔設(shè)置為13.55 um，樣品距光源和相機(jī)距光源的距離分別為259.850 mm和345.591 mm，掃描模式為2 K模式（2000×1332 px），設(shè)置系統(tǒng)以0.4°為間隔對(duì)樣品進(jìn)行180°持續(xù)掃描（如圖1步驟B）。

2.3 CT圖像重構(gòu)

利用CT Scan NRecon（美國(guó)Bruker 公司，版本1.6.9.4）軟件對(duì)CT掃描原始圖像進(jìn)行圖像重構(gòu)，獲得一系列籽粒橫截面格式為8-bit BMP的重構(gòu)虛擬圖像，分辨率為2000×2000 px（如圖1步驟C）。

2.4 圖像分割與表型指標(biāo)計(jì)算

結(jié)合ScanIP圖像處理軟件對(duì)CT圖像進(jìn)行三維分割和表型指標(biāo)計(jì)算，具體步驟如下。

（1）胚結(jié)構(gòu)分割。胚部的分割主要根據(jù)圖像中胚和胚乳部分灰度值的不同進(jìn)行區(qū)分，采用區(qū)域生長(zhǎng)（Region Growing）法進(jìn)行圖像分割。由于胚的灰度值與胚乳中的灰度值有重合，因此，在3D全序列切片上，胚乳部分會(huì)影響到胚的分割。采用單張2D序列圖，選擇性跳躍生長(zhǎng)的操作可較好獲得胚的輪廓。在本研究中選擇20張圖像進(jìn)行區(qū)域生長(zhǎng)，然后利用閉（close）操作實(shí)現(xiàn)胚的完整分割（如圖1步驟D）。

（2）空腔結(jié)構(gòu)分割?？涨晃挥谧蚜?nèi)部，根據(jù)其分布位置不同，空腔可詳細(xì)劃分為胚空腔、胚乳空腔和皮下空腔?？涨徊糠峙c其它結(jié)構(gòu)一方面灰度值差距明顯，另一方面與其他結(jié)構(gòu)獨(dú)立不連通。根據(jù)其結(jié)構(gòu)上獨(dú)立不連通這一特性，使用Region growing在當(dāng)前活動(dòng)mode上操作，分割得到胚空腔的完整結(jié)構(gòu)，胚乳空腔和皮下空腔分割過(guò)程同上。在獲得胚空腔、胚乳空腔、皮下空腔完整結(jié)構(gòu)后，將三者的mode相加得到總空腔的完整結(jié)構(gòu)。

（3）胚乳結(jié)構(gòu)分割。在空腔和胚結(jié)構(gòu)都獲得的情況下，直接利用完整籽粒的mode減去空腔和胚的部分即可得到胚乳部分（含種皮），之后利用腐蝕（erode）操作去除種皮部分。

（4）三維表型指標(biāo)計(jì)算。通過(guò)以上步驟（1）～（3）可實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米籽粒內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)的分割，精細(xì)分割出胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔等不同的組織（如圖1步驟E），進(jìn)一步對(duì)各個(gè)成分進(jìn)行計(jì)算即可獲得相關(guān)表型指標(biāo)，包括體積（Volume，mm3）、表面積 （Surface Area，mm2）、原始灰度均值（Mean Greyscale（Original））、體積比和比表面積等（如圖1步驟F）。

2.5 數(shù)據(jù)分析

使用R語(yǔ)言自帶的cor（ ）函數(shù)計(jì)算不同類型玉米籽粒表型指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)，并利用corrplot包繪制相關(guān)性熱圖;采用單因素方差分析和靈敏度較高的最小顯著差法（Least Significant Difference，LSD）在P<0.05水平比較不同類型玉米籽粒間的表型差異顯著性;基于34項(xiàng)玉米籽粒顯微表型指標(biāo)，使用R語(yǔ)言cluster包pam（ ）函數(shù)進(jìn)行K-中心點(diǎn)（K-Medoids）聚類分析。

3? 結(jié)果與分析

3.1 玉米籽粒組織結(jié)構(gòu)三維可視化及表型解析

基于CT序列圖像，使用CT-分析器（CT-Analyser，CTAN）和CT-體積（CT-Volume，CTVOL）對(duì)獲得的3D圖像進(jìn)行渲染，可實(shí)現(xiàn)樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的定性分析，確定其內(nèi)部不同結(jié)構(gòu)的特征，以及不同品種之間在內(nèi)部結(jié)構(gòu)上的差異。如圖2所示，展示了不同類型不同品種籽粒結(jié)構(gòu)的三視圖：x-y平面（橫軸視圖），x-z平面（冠狀視圖）和z-y平面（旋轉(zhuǎn)矢狀視圖）。結(jié)合ScanIP軟件實(shí)現(xiàn)了對(duì)玉米籽粒內(nèi)部三維結(jié)構(gòu)的精細(xì)分割，包括胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔等6個(gè)不同的組織，進(jìn)一步對(duì)各個(gè)成分進(jìn)行計(jì)算，獲得包括體積、表面積、原始灰度均值、體積比和比表面積等34項(xiàng)玉米籽粒顯微表型指標(biāo)，如表1所示。

3個(gè)維度的二維斷面切片圖像

3.2 籽粒表型性狀相關(guān)性分析

為探究不同類型玉米籽粒表型指標(biāo)之間的關(guān)系，對(duì)34項(xiàng)顯微表型指標(biāo)兩兩變量進(jìn)行相關(guān)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，籽粒與胚乳在表面積、體積等表型指標(biāo)上呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r>0.94（圖3），表明胚乳是構(gòu)成籽粒的主要組成部分，符合胚乳約占玉米籽粒80%以上的結(jié)論;空腔、皮下空腔和胚乳空腔三者的體積和體積比兩兩之間相關(guān)系數(shù)r均大于0.8，呈極顯著正相關(guān)，表明空腔大小主要受皮下空腔和胚乳空腔大小影響。

此外，本研究提取到一個(gè)能反應(yīng)籽粒不同結(jié)構(gòu)組織密度的指標(biāo)Mean Greyscale（Original）。greyscale表示灰度，取值范圍為0～255，0為黑色，255為白色[27]。其中致密物質(zhì)為白色，空氣為黑色[28]。籽粒不同組織結(jié)構(gòu)原始灰度均值相關(guān)性分析顯示，胚、胚乳和籽粒兩兩之間相關(guān)系數(shù)r均大于0.90，且灰度值相近，說(shuō)明籽粒與胚乳、胚的組織密度相似，籽粒密度與其內(nèi)部胚乳、胚組織顯著相關(guān)。

3.3 籽粒表型性狀差異分析

為探索同一表型指標(biāo)在不同類型籽粒間的關(guān)系，利用R語(yǔ)言對(duì)表型指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析和LSD檢驗(yàn)。本次試驗(yàn)單因素方差分析主要對(duì)籽粒整體、籽粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及原始灰度均值進(jìn)行分析。

3.3.1 籽粒整體組間差異分析

對(duì)11個(gè)品種玉米籽粒的體積大小進(jìn)行排序發(fā)現(xiàn)，京92、B73、京724等普通玉米籽粒體積明顯大于甜玉米京科甜608、高油玉米R(shí)Y732、爆裂玉米105和830。其中普通玉米京92體積最大，為251.67 mm3，與特種玉米（糯玉米、爆裂玉米、高油玉米和甜玉米）具有顯著差異（P<0.05）（表2）。但是普通玉米籽粒體積與糯玉米無(wú)法區(qū)分（表2），可能是由于糯玉米與普通玉米在籽粒大小外觀表型相似的原因。

比表面積是指整個(gè)籽粒表面積與體積之比，也是衡量籽粒形態(tài)的重要指標(biāo)。由表2可知，11個(gè)品種籽粒比表面積大小排序?yàn)榫┛铺?08 > RY732 > 105 > 京科糯2016 > 京黃糯269 > 830 > 丹599 > B73> MC01 > 京724 > 京92，表明特種玉米籽粒比表面積普遍大于普通玉米籽粒比表面積。例如，比表面積最大為甜玉米京科甜608（2.59），與其他籽粒具有顯著差異，而比表面積最小的特種玉米為830（1.49），其比表面積比普通玉米中比表面積最大的丹599（1.43）還大。

以上研究結(jié)果表明，基于籽粒體積和籽粒比表面積能實(shí)現(xiàn)對(duì)特種玉米和普通玉米籽粒的區(qū)分。

3.3.2 籽粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)在不同類型籽粒間的差異分析

為進(jìn)一步對(duì)比籽粒內(nèi)部結(jié)構(gòu)在不同類型籽粒間的差異，本研究對(duì)胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔以及胚空腔的表型指標(biāo)進(jìn)行單因素方差分析。如表3所示，在胚乳體積中排列前5的玉米籽粒中有4個(gè)為普通玉米，如京92、B73、京724和MC01，其中京92胚乳體積最大，為210.67 mm3。特種玉米中爆裂玉米105、高油玉米R(shí)Y732和甜玉米京科甜608的胚乳體積明顯小于普通玉米，其中京科甜608胚乳體積最小，為83.7 mm3。若按不同品種玉米籽粒胚乳空腔表面積由大到小進(jìn)行排序，11個(gè)玉米籽粒中5個(gè)普通玉米排列在前七位，分別為丹599，京724，B73，MC01，京92，胚乳空腔表面積在88.73～132.40 mm2之間，顯著高于其它類型玉米籽?？涨槐砻娣e4.79～54.24 mm2（表4）。相反，若按胚體積比分類，除丹599，所有普通玉米籽粒胚體積比為9～15，普遍較小，明顯小于其它類型玉米籽粒，如甜玉米京科甜608（胚體積比為25.19）以及高油玉米R(shí)Y732（胚體積比為24.11）（表5）。以上分析表明，胚乳體積、胚乳空腔表面積以及胚體積比等顯微表型指標(biāo)可用于區(qū)分普通玉米和特種玉米（爆裂、高油及甜玉米等）。

由胚乳體積比差異分析結(jié)果可知，爆裂玉米105和830胚乳體積比值在所有玉米類型中排列前二，且比值均大于87（表5），表明爆裂類型玉米籽粒相較其它類型玉米籽粒胚乳體積占籽粒體積比較大。此外，根據(jù)差異分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，胚乳空腔比表面積表型指標(biāo)可用于區(qū)分高油玉米R(shí)Y732和甜玉米京科甜608。高油玉米R(shí)Y732胚乳空腔比表面積最大，為97.44;相反甜玉米京科甜608胚乳空腔比表面積最小，為11.06，且與其他類型籽粒差異顯著（表6）。通過(guò)差異分析還發(fā)現(xiàn)，胚乳空腔體積比大小也可用于高油玉米R(shí)Y732和甜玉米京科甜608的區(qū)分。甜玉米京科甜608胚乳空腔體積比最大，為7.33，高油玉米R(shí)Y732最小，為0.05，其中甜玉米京科甜608顯著區(qū)別于其它類型玉米籽粒胚乳空腔體積比（表5）。

3.4 原始灰度均值的差異分析

本研究還對(duì)原始灰度均值進(jìn)行差異分析。從表7可知，在11個(gè)品種玉米籽粒中，空腔組織結(jié)構(gòu)胚空腔、胚乳空腔、皮下空腔原始灰度均值都低于50;非空腔組織結(jié)構(gòu)胚、胚乳、籽粒原始灰度平均值均高于80，且籽粒空腔與非空腔灰度值差異顯著。表明原始灰度均值能區(qū)分籽?？涨慌c非空腔組織結(jié)構(gòu)，可作為籽?？涨慌c非空腔組織結(jié)構(gòu)劃分的重要表型指標(biāo)。

3.5 表型指標(biāo)聚類分析

使用R語(yǔ)言cluster包pam（ ）函數(shù)對(duì)34項(xiàng)顯微表型指標(biāo)進(jìn)行K-Medoids聚類分析，結(jié)果如圖4所示。圖中不同顏色和形狀劃分的多邊形代表不同的分類組，11種籽粒可被劃分為四類。第一類：京724、MC01、京黃糯269、B73、丹599、京92（藍(lán)色）;第二類：京科糯2016、105、830（綠色）;第三類：京科甜608（黃色）;第四類：RY732（紅色）。

在分類的基礎(chǔ)上，對(duì)四類籽粒做不同表型指標(biāo)的單因素方差分析，結(jié)果如表8所示。其中，胚乳體積（Vend）、籽粒體積（Vk）、胚乳空腔表面積（Sendc）、胚空腔表面積（Sembc）、籽粒比表面積（SVk）、胚乳空腔比表面積（SVendc）、胚體積比（VVemb）和胚乳體積比（VVend）等8個(gè)表型指標(biāo)在不同類型玉米籽粒中存在顯著差異（P-value<0.05）。

為進(jìn)一步確定上述存在顯著差異的8個(gè)表型指標(biāo)對(duì)不同分類組的影響程度，基于這8項(xiàng)表型指標(biāo)和四類玉米籽粒類型進(jìn)行LSD，結(jié)果表明，胚空腔表面積在4類玉米籽粒中不存在顯著差異（表9），不適用于籽粒區(qū)分。因此，本研究使用除胚空腔表面積外的7個(gè)表型指標(biāo)對(duì)不同類型玉米籽粒進(jìn)行分類。

結(jié)合表型指標(biāo)在不同分類組的均值大小，每一類的主要特征為：第一類籽粒胚乳空腔表面積、胚乳體積和籽粒體積最大，其中籽粒體積與其余三類籽粒體積具有顯著差異;第二類籽粒胚乳體積比最大，但與第一類和第四類在P-value<0.05水平上無(wú)顯著差異，胚體積比最小，但與第一類在P-value<0.05水平上無(wú)顯著差異;第三類籽粒胚乳體積、胚乳空腔比表面積和胚乳體積比最小，籽粒比表面積和胚體積比最大;第四類籽粒胚乳空腔表面積和籽粒體積最小，胚乳空腔比表面積最大。

4? 結(jié)論與討論

本研究以普通玉米、糯玉米、爆裂玉米、高油玉米和甜玉米5種類型的11個(gè)品種玉米籽粒為研究對(duì)象，基于Micro-CT開(kāi)展籽粒表型顯微特征研究，主要結(jié)論有：

（1）利用CT掃描技術(shù)實(shí)現(xiàn)玉米籽粒、胚、胚乳、空腔、皮下空腔、胚乳空腔和胚空腔等7個(gè)組織結(jié)構(gòu)的三維分割及34項(xiàng)表型指標(biāo)的精準(zhǔn)提取。

（2）34項(xiàng)表型指標(biāo)中，胚乳空腔表面積、籽粒體積、胚乳體積比和胚乳空腔比表面積等4項(xiàng)表型指標(biāo)在不同類型玉米間差異顯著（P-value<0.05）。其中，普通玉米胚乳空腔表面積和籽粒體積顯著大于其他類型玉米籽粒，爆裂玉米胚乳體積比最大，高油玉米胚乳空腔比表面積最大，甜玉米胚乳空腔比表面積最小。

（3）基于34項(xiàng)表型指標(biāo)進(jìn)行差異分析和聚類分析，可將11個(gè)不同品種玉米籽粒分為四類。第一類：京724、MC01、京黃糯269、B73、丹599、京92;第二類： 105、830、京科糯2016;第三類：京科甜608;第四類：RY732。此分類結(jié)果與實(shí)際玉米類型基本吻合，表明Micro-CT掃描技術(shù)可以為不同品種玉米籽粒分類提供支持。

由于糯玉米同普通玉米相比較，兩者主要區(qū)別在于內(nèi)部組織生化成分不同，而在外形結(jié)構(gòu)上無(wú)差異[29]，所以在進(jìn)行表型數(shù)據(jù)聚類時(shí)，京黃糯269被劃分在普通玉米中。在特種玉米中，甜玉米京科甜608胚乳空腔比表面積與其它類型玉米籽粒相比，其胚乳空腔比表面積最小，差異顯著（表6）。相反，高油玉米籽粒RY732胚乳空腔比表面積在所有玉米籽粒中最大且差異顯著（表6），說(shuō)明胚乳空腔比表面積表型指標(biāo)可用于區(qū)分甜玉米和高油玉米。該結(jié)果與聚類分析結(jié)果一致，高油玉米R(shí)Y732 與甜玉米京科甜608被分別單獨(dú)劃分為一類（圖4）。爆裂玉米105和830胚乳體積比值均大于其他類型玉米（表5），且聚類分析后存在顯著差異的8個(gè)表型指標(biāo)LSD檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，主要由爆裂玉米構(gòu)成的第二類其胚乳體積比也大于其他三類（表9），表明胚乳體積比可作為爆裂玉米同其它類型玉米區(qū)分的重要依據(jù)。同樣地，在區(qū)分普通玉米和特種玉米中，籽粒表型指標(biāo)如籽粒體積、胚乳空腔表面積在種間差異較大，可用于區(qū)分普通玉米與特種玉米。例如，分別對(duì)胚乳空腔表面積、籽粒體積進(jìn)行單因素方差分析，并對(duì)胚乳空腔表面積、籽粒體積大小排序。結(jié)果顯示在11個(gè)籽粒中，排名前50%的玉米籽粒均為普通玉米（表4和表3），且該結(jié)果與聚類分析結(jié)果類似。在聚類分析中，普通玉米被劃分為第一類，明顯區(qū)分于其它三類特種玉米（圖4）。差異分析結(jié)果和聚類分析結(jié)果均發(fā)現(xiàn)胚乳空腔表面積、籽粒體積、胚乳體積比和胚乳空腔比表面積這四項(xiàng)指標(biāo)在不同類型玉米籽粒間存在顯著差異，為不同類型玉米籽粒分類提供重要的參考依據(jù)。

現(xiàn)有的CT圖像分割流程涉及大量的人工交互耗時(shí)長(zhǎng)、效率低，無(wú)法滿足高通量的玉米籽粒顯微表型特征獲取。今后，如何提升顯微表型獲取的效率與精度，開(kāi)展大群體籽粒顯微特征研究，將成為下一步工作的研究重點(diǎn)。

致? 謝

感謝北京市農(nóng)林科學(xué)院玉米中心段民孝副研究員和趙衍鑫副研究員提供部分玉米品種種子。

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Study on the Micro-Phenotype of Different Types of Maize Kernels Based on Micro-CT

ZHAO Huan1，2，3， WANG Jinglu1，2， LIAO Shengjin1，2， ZHANG Ying1，2， LU Xianju1，2， GUO Xinyu1，2， ZHAO Chunjiang1，2*

（1.Beijing Research Center for Information Technology， Beijing 100097， China; 2.National Engineering Research Center for Information Technology in Agriculture/Beijing Key Lab of Digital Plant， Beijing 100097， China;

3.College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070， China）

Abstract： Plant micro-phenotype mainly refers to the phenotypic information at the tissue， cell， and subcellular levels， which is an important part of plant phenomics research. In view of the problems of low efficiency， large error， and few traits of traditional methods for detecting kernel microscopic traits， Micro-CT scanning technology was used to carry out precise identification of micro-phenotype on 11 varieties of maize kernels. A total of 34 microscopic traits were obtained based on CT sequence images of 7 tissues， including seed， embryo， endosperm， cavity， subcutaneous cavity， endosperm cavity and embryo cavity. Among the 34 microscopic traits， 4 traits， including endosperm cavity surface area， kernel volume， endosperm volume ratio and endosperm cavity specific surface area， were significantly different among maize types （P-value<0.05）. The surface area of endosperm cavity and kernel volume of common maize were significantly higher than those of other types of maize. The specific surface area of endosperm cavity of high oil maize was the largest. The endosperm cavity of sweet corn had the smallest specific surface area. The endosperm volume ration of popcorn was the largest. Furthermore， 34 traits were used for One-way ANOVA and cluster analysis， and 11 different maize varieties were divided into four categories， of which the first category was mainly common maize， the second category was mainly popcorn， the third category was sweet corn， and the fourth category was high oil maize. The results indicated that Micro-CT scanning technology could not only achieve precise identification of micro-phenotype of maize kernels， but also provide supports for kernel classification and variety detection， and so on.

Key words： plant phenomics; micro-phenotype; Micro-CT; maize kernel; phenotype identification